專利名稱：紙漿和紙張廢水的顏色減退方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保藏號(hào)為MTCC 5099的細(xì)菌菌株，制備所述菌株的接種物的方法，以及使用上述接種物使紙漿廠廢水顏色減退的方法，該方法包括步驟用所獲得的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水，將混合物在約37℃約100rpm下培養(yǎng)24-48小時(shí)，估定顏色和總木質(zhì)素水平以確定上述細(xì)菌的脫色效率。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)參考在過去數(shù)十年中紙漿和紙張廠廢水的脫色問題已經(jīng)成為重要考慮和調(diào)查研究的主題。在主要紙張生產(chǎn)國(guó)中，估算紙漿和紙張工業(yè)每年排放兩萬(wàn)億加侖廢水，且大量廢水是深色的(Joyce等，1983)。
實(shí)質(zhì)上廢水的褐色主要是有機(jī)性質(zhì)的，且主要?dú)w因于各種制漿和漂白操作中形成的木質(zhì)素降解產(chǎn)物(Srivastava等，1984，Dilek等，2000)。其它給予顏色的物質(zhì)是木材提取物、鞣質(zhì)、樹脂和合成染料。
從來(lái)沒有認(rèn)為顏色是主要問題，規(guī)類為非常規(guī)污染物。據(jù)說在一些地方調(diào)控顏色的原因是保護(hù)漁業(yè)或?qū)徝揽紤]。其次，將有色紙漿廢水排放至接受水中，除了對(duì)生物群具有直接的毒性作用以外，通過降低日光的穿透還抑制了水生生物的光合成活性。
顏色化合物還螯合金屬離子并通過重金屬給予了污染。最近，導(dǎo)致顏色的有機(jī)化合物還涉及藍(lán)綠藻花的出現(xiàn)(Paerl，1982；Kuenzler等，1982；Witherspoon &Pierce，1982)。因此，在排放至接受水之前，除去紙漿和紙張廠廢水中存在的顏色是迫切的。
存在兩種常規(guī)策略來(lái)使紙漿和紙張廠廢水脫色1)常規(guī)輸送管終端的處理2)改變紙漿和紙張的生產(chǎn)方法使得產(chǎn)生較少的顏色以下是常用的脫色技術(shù)-二次處理用常規(guī)的活性污泥法來(lái)處理廢水。然而，常規(guī)生物處理系統(tǒng)不能脫色(Yosefian等，2000)。
-酶預(yù)處理-樹脂分離和離子交換-氧化鋁-木材吸收-膜處理-輻射-電解處理-活性炭-污水田間處理-臭氧在這點(diǎn)上，沒有確定出單個(gè)脫色技術(shù)為最有效的。因?yàn)樗猩鲜黾夹g(shù)都是高成本的，對(duì)所涉及的工廠具有不利的經(jīng)濟(jì)影響。此外，化學(xué)處理方法增加了不斷提高的化學(xué)物在環(huán)境中的濃度(Kapdam等，2000)。
原則上，使用以下一種方法或組合可以實(shí)現(xiàn)脫色-吸收-過濾-沉淀-化學(xué)降解-光降解，和-生物降解Rohella等，2001使用聚合電解質(zhì)(可購(gòu)得)用于除去紙漿廠廢水顏色。然而，還沒有詳細(xì)研究該處理的成本-收益分析，因此這種技術(shù)不可行。然而，由于聚合電解質(zhì)依賴廢水的離子交換，鑒于廢水組成中發(fā)生的巨大波動(dòng)，顏色減退能力變化很大。
大多數(shù)脫色技術(shù)是通過將色料濃縮入泥漿或通過部分降解或完全降解有色分子來(lái)進(jìn)行的(Willmott等，1998)。然而，紙漿廠廢水的顏色和化學(xué)組成通常受日常處理以及季節(jié)性波動(dòng)控制。因此迄今為止還沒有出現(xiàn)簡(jiǎn)單、通用的輸送管終端解決方法。
已經(jīng)發(fā)展了常規(guī)的物理-化學(xué)脫色法如化學(xué)沉淀、快速砂濾、膜處理和吸附(Springer，1985)。吸附和膜處理，盡管是有效的，但是昂貴的(Manjunath和Methrotra，1981)。
電化學(xué)方法的應(yīng)用是處理纖維素紙張生產(chǎn)廢水的另一途徑(Christoskova和Lazarov，1988)。該方法確保了高處理效率，但是其效率取決于電極的類型，電凝結(jié)器的結(jié)構(gòu)和運(yùn)行處理的條件。
使用明礬、氯化鐵和石灰的化學(xué)沉淀已經(jīng)得到了廣泛研究(Lathia和Joyce，1978；Dugal等，1976；Joyce等，1979；Srivastava等，1984；Beulker和Jekel，1993；Stephenson & Duff，1996)。盡管停留時(shí)間短和資本成本低，仍然報(bào)道了一些缺陷，如用于沉淀和用于pH調(diào)節(jié)的化學(xué)物的高成本、由于大劑量產(chǎn)生了大體積的泥漿、與產(chǎn)生的泥漿脫水和放置相關(guān)的問題以及高殘留離子含量，因此它們的顏色保留在上清液中(Stephenson和Duff，1996；Srivastava等，1984)。
理論上，生物處理給予了脫色的理想處理方法，因?yàn)楹突瘜W(xué)處理相比較產(chǎn)生了較少的泥漿。還使得日運(yùn)營(yíng)成本更低。在生物系統(tǒng)中，已經(jīng)廣泛研究了白腐菌降解木質(zhì)素的能力，木質(zhì)素是形成紙漿和紙張廢水的重要和主要組分(Feijoo等，1995)。一些工作者已經(jīng)表明白腐菌的團(tuán)粒，在特定培養(yǎng)條件下，強(qiáng)烈吸收牛皮紙漂白車間廢水的顏色和AOX(Jaspers等，1996)。
Raghu Kumar等，1996，表明了海洋真菌也可以用來(lái)使漂白車間廢水脫色。報(bào)道了一株菌株在堿性pH下14天的時(shí)間段內(nèi)脫色74％。其它的數(shù)名研究者也報(bào)道了通過白腐菌部分脫色(Eaton等，1980；Livernoche等，1983；Pronty，1990；Gokcay和Dilek，1994)。Gokcay和Dilek(1994)已經(jīng)指出由于真菌需要高葡萄糖濃度，該處理在經(jīng)濟(jì)上是不可行的。他們還報(bào)道了當(dāng)存在漂白廢水時(shí)真菌是無(wú)效的。
Dilek等，1999已經(jīng)報(bào)道了使用混合的培養(yǎng)藻類使紙漿廢水的脫色。Vidal等已經(jīng)使用了需氧-厭氧的組合處理。將分泌數(shù)種胞外氧化酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的白腐菌用于使漂白牛皮紙紙漿廠廢水脫色。通過酶處理后運(yùn)用需氧-厭氧處理顏色減退高達(dá)64％。
迄今為止，幾乎沒有關(guān)于利用純細(xì)菌培養(yǎng)物來(lái)使紙漿廢水脫水的報(bào)道。本發(fā)明的新穎性是應(yīng)用從天然生境中分離的細(xì)菌純培養(yǎng)物以工業(yè)上和經(jīng)濟(jì)上可行的方式用于紙漿和紙張廢水脫色。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供需氧處理紙漿廠廢水用于顏色減退的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于紙漿和紙張廢水顏色減退的細(xì)菌菌株。
仍然是本發(fā)明的另一目的是開發(fā)菌株的接種物用于紙張和紙漿廢水顏色減退。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及保藏號(hào)為MTCC 5099的細(xì)菌菌株，制備所述菌株的接種物的方法，和使用上述接種物使紙漿廠廢水脫色的方法，該方法包括步驟用所獲得的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水，將混合物在約37℃約100rpm下培養(yǎng)24-48小時(shí)，估定顏色和總木質(zhì)素水平來(lái)測(cè)定上述細(xì)菌的脫色效率。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及保藏號(hào)為MTCC 5099的細(xì)菌菌株，制備菌株接種物的方法，和使用上述接種物使紙漿廠廢水脫色的方法，該方法包括步驟用如權(quán)利要求2所要求的所獲得的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水，用于和含有廢水樣品但沒有任何添加接種物的對(duì)照搖瓶一起進(jìn)行顏色減退研究，將步驟(a)中建立的搖瓶在37℃/100rpm培養(yǎng)48小時(shí)，從上述搖瓶中取出50ml等份試樣并對(duì)它們進(jìn)行處理，估定顏色和總木質(zhì)素水平來(lái)測(cè)定上述細(xì)菌的顏色去除效率。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中為保藏號(hào)MTCC 5099的細(xì)菌菌株。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中A菌株如權(quán)利要求1中所要求的，其中菌株是革蘭氏-ve。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中A菌株如權(quán)利要求1中所要求的，其中菌株是短桿狀的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中制備權(quán)利要求1的菌株之接種物的方法，所述方法包括步驟i)從紙漿和紙張廠廢水處理車間收集的活性污泥中分離細(xì)菌，ii)在含有木質(zhì)素、鞣質(zhì)和香草醛各0.1％w/v的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)菌來(lái)獲得純培養(yǎng)物，iii)將所述細(xì)菌接種于含有0.01％吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯中來(lái)獲得起始培養(yǎng)物，iv)培養(yǎng)上述培養(yǎng)物來(lái)獲得所需的生物量，方法是通過用起始培養(yǎng)物接種合適等份試樣的營(yíng)養(yǎng)肉湯，并將上述培養(yǎng)基在37℃/100rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)，v)在達(dá)到1.5-2.0的光學(xué)密度后，將所得到的培養(yǎng)物離心來(lái)獲得團(tuán)粒，通過溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)洗滌收集的團(tuán)粒，將團(tuán)粒再次離心，和vi)收集步驟(e)獲得的團(tuán)粒，溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)獲得用于可處理性研究的細(xì)胞漿液。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中用于顏色減退實(shí)驗(yàn)中的接種物是將上述細(xì)菌接種于含有0.01％吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯中來(lái)獲得起始培養(yǎng)物而獲得的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中上述起始培養(yǎng)物用于獲得所需的接種物，方法是通過用起始培養(yǎng)物接種合適等份試樣的營(yíng)養(yǎng)肉湯，并將上述培養(yǎng)基在37℃/100rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中將所得到的培養(yǎng)物在合適的rpm，優(yōu)選6000rpm下于4℃離心20分鐘。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中通過溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)洗滌所得到的團(tuán)粒，將團(tuán)粒再次離心。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中將所得到的團(tuán)粒溶解于10ml0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)獲得用于顏色減退研究的接種物；本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中使用如權(quán)利要求2中所要求的上述接種物使紙漿廠廢水脫色，其包括i)用如權(quán)利要求2中所要求的獲得的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水，與含有廢水樣品但無(wú)任何添加接種物的對(duì)照搖瓶一起用于顏色減退研究。
ii)將步驟(i)中建立的搖瓶在37℃/100rpm培養(yǎng)48小時(shí)，iii)從上述搖瓶中取出50ml等份試樣并處理之用來(lái)估定顏色和總木質(zhì)素水平，iv)分析上述細(xì)菌的顏色去除效率，方法是通過在24和48小時(shí)的間隔后，將用如權(quán)利要求2所要求的細(xì)菌處理的廢水的顏色水平和對(duì)照樣品的顏色水平相比較。
v)檢測(cè)廢水中上述培養(yǎng)物的生活力，方法是通過將其在營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)并計(jì)算CFU/ml。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中檢測(cè)上述培養(yǎng)物的生活力，方法是通過將從實(shí)驗(yàn)樣品取得的稀釋物涂布來(lái)獲得可計(jì)數(shù)的菌落，并在24和48小時(shí)間隔后計(jì)算其CFU/ml。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中如權(quán)利要求1至9所要求的方法，其中限定了需氧、生物脫色方法，其利用從紙漿和紙張廠ETP的活性污泥獲得的細(xì)菌分離物，使給定廢水的顏色水平降低至多達(dá)55％。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中菌株顯示出24小時(shí)內(nèi)顏色減退55％。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中菌株顯示出48小時(shí)內(nèi)顏色減退60％。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中與生物量的當(dāng)量比約為1∶1。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中顏色減退后菌株是有生活力的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中本發(fā)明提供了使紙漿和紙張廠廢水顏色減退的生物方法。還公開了從特定來(lái)源分離的、能夠使紙漿和紙張廢水顏色減退的細(xì)菌菌株。所述細(xì)菌分離物能夠減退廢水顏色。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中本發(fā)明涉及使紙漿和紙張廢水顏色減退的生物方法，方法是使用從紙漿和紙張廠特定來(lái)源分離的需氧細(xì)菌菌株。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中本發(fā)明提供了使用需氧處理方法使紙漿廠廢水顏色減退的方法。需氧細(xì)菌菌株是從紙漿和紙張廠特定來(lái)源分離的并用于紙漿廠廢水脫色。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌分離物是目前保藏于IGIB如CBTCC/及其鑒定在進(jìn)行中。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中該細(xì)菌分離物有助于紙漿和紙張廢水的顏色減退。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中本發(fā)明中所述的細(xì)菌是從紙漿和紙張廠廢水處理車間的活性污泥中分離出來(lái)的。將紙漿和紙張廠廢水處理車間中取出的5g均質(zhì)活性污泥接種于富集培養(yǎng)基中。富集培養(yǎng)基由100ml污泥浸出物，25ml無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯和各為0.1％(w/v)的木質(zhì)素(Alkali lignin-Aldrich，USA)、香草醛和鞣質(zhì)(Sigma)。將pH調(diào)節(jié)至6.8±0.2。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中將含有300ml污泥的混合物在1200ml三重蒸餾水中煮沸約30分鐘來(lái)制得污泥浸出物。將浸出物冷卻，離心并粗濾。將獲得的終濾液在121℃15psi高壓滅菌20分鐘并用于制備富集培養(yǎng)基。將活性污泥接種的富集培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)來(lái)獲得富集培養(yǎng)物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中使用pH7.0的0.05MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖液將加富培養(yǎng)物連續(xù)稀釋至10-12。制備木質(zhì)素、香草醛和鞣質(zhì)的儲(chǔ)液。制得含有2％瓊脂的營(yíng)養(yǎng)肉湯并從其儲(chǔ)液中加入各0.2％(v/v)的木質(zhì)素、香草醛和鞣質(zhì)。然后將連續(xù)稀釋的接種物涂布并在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。挑選單個(gè)分離的菌落并在相同培養(yǎng)基的新鮮平板上劃線。重復(fù)上述步驟兩次，直至獲得純的菌落。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中利用無(wú)菌鎳鉻合金接種環(huán)將上述細(xì)菌接種于15-20ml無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)中，營(yíng)養(yǎng)肉湯含有(每升)5.0g動(dòng)物組織的胃酶消化物，5.0g氯化鈉，1.5g牛肉浸膏，1.5g酵母浸膏和0.2ml吐溫-80。將培養(yǎng)物在振蕩培養(yǎng)器中37℃培養(yǎng)約16-18小時(shí)。為了輕微振蕩，將振蕩培養(yǎng)器保持于合適的rpm，優(yōu)選100rpm。獲得充分生長(zhǎng)后，將肉湯保持于4℃直至進(jìn)一步使用。用250μl上述制得的起始培養(yǎng)物接種250ml無(wú)菌NB。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中將搖瓶在37℃/100rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)直至獲得13-2.0的光密度(650nm)。在合適rpm，優(yōu)選6000rpm離心20分鐘來(lái)收集細(xì)胞。通過溶解于0.05M，pH6.8的最小量的磷酸鹽緩沖液中來(lái)洗滌所獲得的團(tuán)粒，并使用相同的rpm和時(shí)間條件再次離心。在離心過程中，將溫度維持于4℃。因此將獲得的團(tuán)粒重懸浮于0.05M，pH6.8的最小體積優(yōu)選10ml的磷酸鹽緩沖液，并渦旋制得均質(zhì)懸浮液用于紙漿和紙張廢水顏色減退。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中為了建立顏色減退實(shí)驗(yàn)，從螺帽圓錐搖瓶中取250ml樣品。在檢測(cè)廢水pH，優(yōu)選約7.0后，將接種物加入廢水樣品中。還維持了不含有任何添加接種物的對(duì)照搖瓶用于比較。將搖瓶在37℃/100rpm培養(yǎng)48小時(shí)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中為了分析上述細(xì)菌的顏色減退效率以及總木質(zhì)素含量，取出約50ml的樣品。在合適rpm，優(yōu)選8000rpm 4℃離心30分鐘來(lái)制得用于分析的樣品。然后將上清液通過0.45μ濾器(Millipore)。為了測(cè)量顏色水平，將樣品的pH調(diào)節(jié)至7.6并在465nm處測(cè)量光密度，如NCASI顏色測(cè)定方法中所述的。還通過改良的PearlBenson方法進(jìn)行了總木質(zhì)素測(cè)定。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中為了測(cè)定整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)物的生活力，將樣品連續(xù)稀釋并涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃倒置培養(yǎng)過夜。計(jì)數(shù)菌落并計(jì)算菌落形成單位/ml(CFU/ml)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，其中本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備所述菌株的接種物的方法，并將該接種物用于紙漿和紙張工業(yè)廢水顏色減退，其包括a)從紙漿和紙張廠廢水處理車間的活性污泥中分離細(xì)菌；b)在含有木質(zhì)素、鞣質(zhì)和香草醛各0.1％w/v的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)菌來(lái)獲得純培養(yǎng)物；c)將所述細(xì)菌接種于含有0.01％吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯中來(lái)獲得起始培養(yǎng)物；d)培養(yǎng)上述細(xì)菌來(lái)獲得所需的生物量，方法是通過將起始培養(yǎng)物接種于合適等份試樣的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，并將上述培養(yǎng)基在37℃/100rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)；e)在獲得1.5-2.0的光密度后，將所得到的培養(yǎng)物離心來(lái)獲得團(tuán)粒，通過溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)洗滌收集的團(tuán)粒，將團(tuán)粒再次離心；f)收集從步驟(e)中獲得的團(tuán)粒，溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)獲得用于可處理性研究的細(xì)胞漿液；g)用步驟(f)中獲得的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水，和含有廢水樣品但沒有任何添加接種物的對(duì)照搖瓶一起用于顏色減退研究；h)將步驟(g)中建立的搖瓶在37℃/100rpm培養(yǎng)48小時(shí)；i)從上述搖瓶中取出50ml等份試樣并對(duì)它們進(jìn)行處理來(lái)估定顏色和總木質(zhì)素含量；i)分析上述細(xì)菌的脫色效率，方法是通過在24和48小時(shí)間隔后和對(duì)照樣品的顏色水平相比較；k)檢測(cè)廢水中上述細(xì)菌的生活力，方法是在24和48小時(shí)后通過菌落計(jì)數(shù)方法并計(jì)算CFU/ml。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)菌是從紙漿和紙張廠的廢水處理車間收集的活性污泥中分離的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將上述細(xì)菌接種于含有0.01％吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯中來(lái)獲得起始培養(yǎng)物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，通過用起始培養(yǎng)物接種營(yíng)養(yǎng)肉湯來(lái)制得細(xì)菌培養(yǎng)物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，通過在100rpm輕柔振蕩來(lái)進(jìn)行細(xì)菌菌株的培養(yǎng)。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)菌菌株在37℃生長(zhǎng)16-18小時(shí)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，在達(dá)到約1.5-2.0的光密度后，將所述細(xì)菌在合適rpm，優(yōu)選6000rpm 4℃離心約20分鐘。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，通過溶解于最小量0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中來(lái)洗滌所得到的團(tuán)粒，使用相同的rpm和時(shí)間條件再次離心。在離心過程中，將溫度維持于4℃。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，將如此獲得的團(tuán)粒重懸浮于最小體積、優(yōu)選10ml的0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，并渦旋來(lái)獲得均質(zhì)的懸浮液。
本發(fā)明一實(shí)施方案中，上述獲得的細(xì)胞漿液用于接種廢水樣品以減退顏色。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了降低紙漿和紙張廠廢水彩色信號(hào)電平的方法。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，將含有上述接種物的搖瓶在37℃120rpm培養(yǎng)48小時(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在48小時(shí)后觀察到顏色和總木質(zhì)素水平的降低。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物生長(zhǎng)于含有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，用于測(cè)定所述廢水中細(xì)菌的生活力。
如臨時(shí)專利中所述的，細(xì)菌聚生體能夠在5天的時(shí)間段內(nèi)使廢水顏色減退。然而，進(jìn)行了后來(lái)的研究來(lái)降低保留時(shí)間(使處理更快)以及來(lái)提高廢水顏色減退的程度。觀察到通過單一細(xì)菌分離物在24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)約降低了58％的顏色水平，明顯優(yōu)于較早的聚生體情況中在3至5天時(shí)間段內(nèi)降低51％。因此，在完整專利說明書中，呈現(xiàn)了使用單一細(xì)菌分離物所獲得的結(jié)果；顯著優(yōu)于那些通過細(xì)菌聚生體獲得的結(jié)果。
2.于2003年3月17日前已經(jīng)將培養(yǎng)物保藏于國(guó)際保藏單位IMTECH并分配編號(hào)。
3.我們只要求了一個(gè)重復(fù)給出最佳結(jié)果的細(xì)菌分離物，如完整說明書中表5和表8所給出的。
本申請(qǐng)的菌株保藏于MTCC，昌迪加爾，印度，保藏號(hào)為MTCC5099。在說明書中的一些地方該菌株以細(xì)菌菌株細(xì)菌B4提及。
以實(shí)施例的形式進(jìn)一步詳細(xì)描述本申請(qǐng)的本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例只是說明本發(fā)明并不是來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I從廢水處理車間的進(jìn)口以及出口流出的廢水中分離細(xì)菌。檢測(cè)廢水的pH，發(fā)現(xiàn)為7.6±0.2。以不同的百分比，即100％、80％、50％、30％、和10％將過濾并高壓滅菌的廢水用作分離原地生活細(xì)菌的介質(zhì)，使用礦物鹽培養(yǎng)基(MSM)。所用MSM的組成如下K2HPO45mMKH2PO45mMMgSO4.7H2O1mMEDTA 0.3mMZnSO4.7H2O0.01mMMnSO4.7H2O0.02mMCuSO4.7H2O0.004mMFeSO4.7H2O0.1mMNaMoO4.2H2O 0.004mM(NH4)2SO4.7H2O 5mMpH 7.0±0.2向100ml等份的營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)中，加入各1ml進(jìn)口以及出口的廢水，并保持于37℃/24-48小時(shí)來(lái)富集。
使用2％瓊脂作為固化劑來(lái)制得廢水-MSM平板。將平板放置使固化并倒置直至進(jìn)一步使用。通過連續(xù)稀釋富集的接種物直至10-12的稀釋度來(lái)進(jìn)行連續(xù)稀釋涂布。如下進(jìn)行連續(xù)稀釋取9ml等份Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH6.8，0.05M)并接種1ml富集的接種物于第一個(gè)指管中，渦旋并從該指管中取出1ml并用其稀釋至下一個(gè)指管中，直至獲得10-12的稀釋度。然后將這些指管用于涂布廢水MSM平板。
將100μl上述稀釋液放置于不同的廢水-MSM平板上并用無(wú)菌玻璃涂布器涂布。所有平板制備兩份并在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。根據(jù)形態(tài)差異將這些平板上出現(xiàn)的菌落標(biāo)記并選擇用于進(jìn)一步的純化。
用無(wú)菌接種針挑取呈現(xiàn)不同形態(tài)外觀的菌落并涂布于含有各自生長(zhǎng)培養(yǎng)基的平板上。各自兩至三代傳代培養(yǎng)后，獲得純化的分離物，測(cè)試其純度并在其各自培養(yǎng)基中以斜面和穿刺保存。
取出鉑環(huán)量的培養(yǎng)物并接種于無(wú)菌等份的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，渦旋并保持于37℃/120rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)。在650nm測(cè)定這些種子發(fā)酵劑的光密度。
選擇35個(gè)形態(tài)不同的細(xì)菌來(lái)篩選它們使紙漿廠廢水顏色減退的能力。用100μl各自的種子培養(yǎng)物接種100ml無(wú)菌NB并記錄650nm的最終光密度。通過6000rpm 4℃離心20分鐘收集OD650為1.5-2.0的培養(yǎng)物。使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8，0.05M)洗滌所獲得的團(tuán)粒兩次并重懸浮于小體積的相同緩沖液中。然后將該懸浮液以1∶1的比例用于可處理性試驗(yàn)，即，用100ml培養(yǎng)基獲得的團(tuán)粒來(lái)處理100ml廢水樣品。
在圓錐燒瓶的分批培養(yǎng)物中進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)，37℃120rpm5天。使用NCASI光密度方法在450nm測(cè)量第零天、第三天和第五天的色度。13株細(xì)菌在第五天給出了50％和更多的顏色減退(表1)。
實(shí)施例II選擇了呈現(xiàn)高于50％顏色減退的13株單獨(dú)細(xì)菌并使用隨機(jī)組合配制9個(gè)不同的細(xì)菌聚生體。
將組成配制聚生體的單獨(dú)培養(yǎng)物獨(dú)立地生長(zhǎng)于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，方法是通過將100μl活化生長(zhǎng)培養(yǎng)物接種于每個(gè)搖瓶中。將培養(yǎng)物在37℃/120rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)直至獲得1.5-2.0的光密度。然后根據(jù)聚生體組成將培養(yǎng)物組合在一起。測(cè)量組合培養(yǎng)物在650nm處的光密度。在6000rpm 4℃離心20分鐘收集所得到的聚生體細(xì)胞，并用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH6.8，0.05M)洗滌兩次。然后將團(tuán)粒再溶解于10ml磷酸鹽緩沖液中并用于顏色減退實(shí)驗(yàn)。
取500ml等份的中和至pH7.0+0.2的廢水樣品于搖瓶中，并用上述制得的團(tuán)粒以1∶1比例接種。所有搖瓶在37℃/120rpm培養(yǎng)3天。還維持了對(duì)照，其不含有任何添加的從自然菌群分離的接種物。
使用NCASI光譜實(shí)驗(yàn)分析樣品的顏色水平并計(jì)算顏色減退的百分比。只有兩個(gè)聚生體呈現(xiàn)顏色減退高于50％(表2)。
實(shí)施例III檢測(cè)用于降低顏色水平的最佳接種量，方法是通過接種三個(gè)不同比例，即1∶1，1∶0.5和1∶0.75(廢水∶培養(yǎng)物)的聚生體。
取100ml廢水樣品于搖瓶中并接種從100ml、50ml和75ml NB等份制得的配制聚生體。培養(yǎng)溫度、時(shí)間和振蕩的所有條件保持和實(shí)施例2中相似，處理三天后測(cè)量顏色水平。
1∶1廢水∶生物量比例的聚生體呈現(xiàn)最高顏色減退(表3)實(shí)施例IV為了提高脫色效率，從紙漿和紙張廠的ETP獲得的活性污泥中進(jìn)行新鮮細(xì)菌的分離。將從紙漿和紙張廠的ETP取得的5克均質(zhì)活性污泥取樣在培養(yǎng)基中富集，培養(yǎng)基包括100ml污泥浸出液，25ml無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯和木質(zhì)素(Alkali lignin-Aldrich，USA)、香草醛和鞣質(zhì)(Sigma)各0.1％(w/v)。將pH調(diào)節(jié)至6.8±0.2。
篩選單個(gè)細(xì)菌使紙張廠廢水顏色減退的能力。在100ml等份試樣中進(jìn)行可處理性試驗(yàn)，并篩選單個(gè)細(xì)菌團(tuán)粒的脫色效率。觀察到分離物No.4為其中的最佳，在48小時(shí)內(nèi)脫色68％。接著為分離物No.35(63％)和19(60％)(表4)。
實(shí)施例V然后將分離物4、19和35在兩種不同的培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)——營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)(富集培養(yǎng)基)和含有無(wú)機(jī)成分和作為碳源的葡萄糖(1％)的礦物鹽培養(yǎng)基(最小培養(yǎng)基)，來(lái)比較生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物的紙漿廠廢水顏色減退性能的作用。
還分開培養(yǎng)了上述分離物，用于以聚生體的形式將它們配制一起，并同樣測(cè)試了培養(yǎng)基對(duì)聚生體顏色減退效率的作用。
通過溶解(每升)5.0g動(dòng)物組織胃酶消化物，5.0g氯化鈉，1.5g牛肉浸膏，1.5g酵母浸膏和0.2ml吐溫80來(lái)制得營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)。如實(shí)施例I中所述的制得礦物鹽培養(yǎng)基(MSM)。還將從無(wú)菌儲(chǔ)液中取出的葡萄糖(1％v/v)加入MSM種作為細(xì)菌的碳補(bǔ)充物。
在37℃和120rpm振蕩培養(yǎng)的100ml等份分批培養(yǎng)物中進(jìn)行脫色試驗(yàn)。在0、24和48小時(shí)間隔取出用于顏色分析的樣品并分析顏色水平。
NB和MSM生長(zhǎng)培養(yǎng)物兩者呈現(xiàn)幾乎相類似的結(jié)果(表5)。
實(shí)施例VI將呈現(xiàn)了使紙漿廠廢水脫色高于60％的分離物4、19和35配制成聚生體，并和其它配制的含有隨機(jī)組合培養(yǎng)物的聚生體一起篩選它們的顏色減退能力。其中聚生體CC17是最佳的，在48小時(shí)內(nèi)呈現(xiàn)高達(dá)55％的顏色減退。
實(shí)施例VII將實(shí)施例VI中配制的聚生體CC17在不同濃度即0.5、0.75、1.0％w/v的葡萄糖和蔗糖的存在下用于世紀(jì)(century)進(jìn)口廢水的顏色減退。
和其它相比較，發(fā)現(xiàn)1％葡萄糖為最佳補(bǔ)充劑，在48小時(shí)內(nèi)給予了高達(dá)75％的顏色減退。然而，所有其它的相互之間沒有顯著不同(表7)。
實(shí)施例VIII盡管廢水中添加葡萄糖看來(lái)似乎給予了更好的顏色減退，然而，其可實(shí)踐的可處理性是可疑的。因此本發(fā)明者決定提高廢水中生物菌團(tuán)負(fù)荷來(lái)觀察效果。將細(xì)菌no.4、19和35單獨(dú)生長(zhǎng)，如之前所述的直至1.5-2.0而不是1.0的OD 650，來(lái)配制聚生體，還將MTCC 5099單獨(dú)培養(yǎng)至1.5-2.0的光密度，來(lái)觀察顏色減退效率的任何提高。所有其它實(shí)驗(yàn)條件相同。細(xì)菌No.4在24小時(shí)內(nèi)呈現(xiàn)高達(dá)55％的顏色減退(表8)。
還使用改良的Pearl Benson法計(jì)算了上述細(xì)菌的總木質(zhì)素含量。
和具有提高生物菌團(tuán)負(fù)荷的其它單獨(dú)細(xì)菌以及聚生體相比，細(xì)菌No.4呈現(xiàn)最佳反應(yīng)。結(jié)果重復(fù)三次。
實(shí)施例IX通過關(guān)于菌落形成單位(CFU/ml)的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行分離物4的生物量和生活力的監(jiān)控。
發(fā)現(xiàn)第零小時(shí)時(shí)，CFU/ml水平約為109CFU/ml，其保持至24小時(shí)，實(shí)際上顯示了提高至1010CFU/ml，表明甚至直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，細(xì)胞完全是有生活力的。將樣品劃線于固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，來(lái)和廢水中培養(yǎng)的原始菌落的形態(tài)特征相匹配，發(fā)現(xiàn)是相同的。
表-1世紀(jì)紙漿和紙張廠進(jìn)口ETP的顏色減退
*顯示高于50％顏色減退的細(xì)菌備注所有值是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均表-2不同配制聚生體的世紀(jì)ETP進(jìn)口廢水的顏色減退％
*在0天呈現(xiàn)高于50％的聚生體。
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2表-3不同配制聚生體的世紀(jì)ETP進(jìn)口廢水的顏色減退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2
表-448小時(shí)后不同分離物的顏色減退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2表-5單個(gè)分離物及其配制的聚生體的紙漿廠廢水顏色減退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2
表-6不同配制的聚生體的紙漿廠廢水顏色減退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2表-7額外的碳源對(duì)聚生體CC17效率的影響
所有值是兩次分析的平均，S.D.±0.2
表-8提高單個(gè)細(xì)菌的生物量以及以聚生體形式對(duì)紙漿廠廢水的顏色和總木質(zhì)素含量的影響
所有值是三次讀數(shù)的平均，S.D.±0.5表-9在顏色減退實(shí)驗(yàn)過程中就菌落形成單位(CFU/ml)而言廢水中MTCC5099的生活力
優(yōu)勢(shì)1.分離的細(xì)菌能夠以可復(fù)現(xiàn)的方式使紙漿廠廢水顏色減退。
2.分離的細(xì)菌甚至在完成實(shí)驗(yàn)后保持生活力，表明了在下次實(shí)驗(yàn)中的再用性。
3.天然分離的細(xì)菌是非致病性的，且可以在簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)而無(wú)任何經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
4.使紙漿廠廢水顏色減退的該種類細(xì)菌是新的。
權(quán)利要求
1.保藏號(hào)為MTCC 5099的細(xì)菌菌株。
2.如權(quán)利要求1的菌株，其中菌株是革蘭氏-ve。
3.如權(quán)利要求1的菌株，其中菌株是短桿狀的。
4.制備權(quán)利要求1的菌株接種物的方法，所述方法包括a)從紙漿和紙張廠廢水處理車間收集的活性污泥中分離細(xì)菌，b)在含有木質(zhì)素、鞣質(zhì)和香草醛各0.1％w/v的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)菌來(lái)獲得純培養(yǎng)物，c)將所述細(xì)菌接種于含有0.01％吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯中來(lái)獲得起始培養(yǎng)物，d)通過用起始培養(yǎng)物接種合適等份試樣的營(yíng)養(yǎng)肉湯，并將上述培養(yǎng)基在37℃/100rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)，培養(yǎng)上述培養(yǎng)物來(lái)獲得所需的生物量，e)在達(dá)到1.5-2.0的光學(xué)密度后，將所得到的培養(yǎng)物離心來(lái)獲得團(tuán)粒，通過溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)洗滌收集的團(tuán)粒，將團(tuán)粒再次離心，和f)收集步驟(e)獲得的團(tuán)粒，溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)獲得用于可處理性研究的細(xì)胞漿液。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中用于顏色減退實(shí)驗(yàn)的接種物是通過將上述細(xì)菌接種于含有0.01％吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯中來(lái)獲得起始培養(yǎng)物而獲得的。
6.如權(quán)利要求4的方法，其中上述起始培養(yǎng)物用于獲得所需的接種物，方法是通過用起始培養(yǎng)物接種合適等份試樣的營(yíng)養(yǎng)肉湯并將上述培養(yǎng)基在37℃/100rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)。
7.如權(quán)利要求4的方法，其中將所得到的培養(yǎng)物在合適的rpm，優(yōu)選6000rpm于4℃離心20分鐘。
8.如權(quán)利要求4的方法，其中通過溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)洗滌所得到的團(tuán)粒，將團(tuán)粒再次離心。
9.如權(quán)利要求4的方法，其中將所得到的團(tuán)粒溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中來(lái)獲得用于顏色減退研究的接種物。
10.使用上述如權(quán)利要求2的接種物使紙漿廠廢水顏色減退的需氧方法，其包括a)用所獲得的如權(quán)利要求2的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水，和含有廢水樣品但不含任何添加接種物的對(duì)照搖瓶一起用于顏色減退研究；b)將步驟(a)中建立的搖瓶在37℃/100rpm下培養(yǎng)48小時(shí)；c)從上述搖瓶中取出50ml等份試樣并對(duì)它們進(jìn)行處理用于估定顏色和總木質(zhì)素水平；d)分析上述細(xì)菌的顏色除去效率，方法是通過在24和48小時(shí)間隔后將用如權(quán)利要求2中所要求的細(xì)菌處理的廢水之顏色水平和對(duì)照樣品的顏色水平相比較，e)檢測(cè)上述培養(yǎng)物在廢水中的活力，方法是通過將其在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)并計(jì)算CFU/ml。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中通過涂布取自實(shí)驗(yàn)的樣品之稀釋液以獲得可計(jì)數(shù)菌落并在24和48小時(shí)間隔后計(jì)算其CFU/ml而檢測(cè)上述培養(yǎng)物的活力。
12.如權(quán)利要求10的方法，其中使用從紙漿和紙張廠ETP活性污泥中獲得的細(xì)菌分離物限定需氧、生物脫色方法，其給予給定廢水顏色水平高達(dá)55％的減退。
13.如權(quán)利要求10的方法，其中菌株在24小時(shí)內(nèi)顯示出顏色水平55％的減退。
14.如權(quán)利要求10的方法，其中菌株在48小時(shí)內(nèi)顯示出顏色水平60％的減退。
15.如權(quán)利要求10的方法，其中與生物量的當(dāng)量比約為1∶1。
16.如權(quán)利要求10的方法，其中菌株在顏色減退后有活力。
全文摘要
本發(fā)明涉及保藏號(hào)為MTCC 5099的細(xì)菌菌株、制備所述菌株接種物的方法、使用上述菌株使紙漿和紙張廠廢水顏色減退的方法，其包括步驟用獲得的細(xì)胞漿液接種合適等份試樣的紙漿和紙張廠廢水、將混合物在約37℃約100rpm下培養(yǎng)24－48小時(shí)、估定顏色和總木質(zhì)素含量來(lái)測(cè)定上述細(xì)菌的除色效率。
文檔編號(hào)C02F3/34GK1771322SQ200380110281
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2003年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者R·庫(kù)馬爾, A·庫(kù)馬爾, D·K·蒂胡 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)