本發(fā)明屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型用于檢測精氨酸的溶酶體細胞定位發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移機理的比率發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米傳感材料。

背景技術(shù)：

在構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，精氨酸是動物體內(nèi)可以構(gòu)成最為多樣蛋白質(zhì)的氨基酸之一，它在不僅是蛋白質(zhì)合成的前體，也是產(chǎn)生一氧化氮、尿素、多胺、脯氨酸、谷氨酸、肌酸和胍丁胺等的前體。精氨酸在細胞分裂、傷口愈合、免疫功能和激素的釋放中起著至關(guān)重要的作用。

但是由于精氨酸具有強親水性及其與受體間弱的相互作用，使其檢測面臨極大的挑戰(zhàn)。目前已經(jīng)報道的探針很少，2015年parveen，s.d.s.等人和2014年he，l.分別報道了兩例檢測精氨酸的化學探針【parveen，s.d.s.，affrose，a.，pitchumani，k.，2015.sens.actuatorsb221，521-527.he，l.；so，v.l.l.；xinj.h.；2014.sens.actuatorsb192，496-502.】。

分子成像標記材料包括有機染料、熒光蛋白、量子點、稀土納米材料等等，傳統(tǒng)的生物標記染料具有水溶性好、易于標記等特點，但一般基于單光子激發(fā)，光源處于紫外或可見光區(qū)，長時間激發(fā)可能會對生物造成傷害，另外無法避免生物體的自發(fā)熒光，組織穿透能力差。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料由近紅外光激發(fā)，發(fā)射譜帶窄，壽命常、反斯托克斯位移大、光穩(wěn)定性強等特點。另外，比率型熒光探針可以同時檢測兩個不同波長處的熒光強度，建立內(nèi)部標度，可以克服單一熒光探針由于如儀器效率、檢測環(huán)境、探針濃度等因素影響檢測信號的問題。

溶酶體是細胞中一種重要的亞細胞器，其內(nèi)部由單層膜結(jié)構(gòu)組成的囊狀顆粒，大小在0.025微米到0.8微米之間。溶酶體內(nèi)部含有豐富的水解酶，到目前為止已發(fā)現(xiàn)60多種，例如：蛋白水解酶、核酸水解酶、脂肪水解酶、磷酸酯水解酶、糖苷水解酶等，主要用于分解和代謝細胞內(nèi)的蛋白和大分子。溶酶體內(nèi)豐富的水解酶使其內(nèi)部的ph值保持在5左右，此時的溶酶體活性最高。當外界物種進入溶酶體后，溶酶體內(nèi)的水解酶會發(fā)揮作用將外來物種分解為細胞所需的物質(zhì)。當溶酶體內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞時，其內(nèi)部大量水解酶會逸出到細胞內(nèi)，使得細胞發(fā)生自溶。因此，溶酶體在細胞內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。如果探針能夠?qū)崿F(xiàn)溶酶體定位，對細胞溶酶體進行實時成像，就可以對正常及藥物刺激下的細胞溶酶體內(nèi)精氨酸變化進行相關(guān)研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料，具有發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移機理的比率發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米探針的制備方法，以及在精氨酸熒光成像方面的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種檢測精氨酸的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米傳感材料，采用以下方法制備：將稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶采用聚丙烯酸改性得到聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒，再將化合物1組裝在聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料的表面，即得所述的檢測精氨酸的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米傳感材料；所述化合物1的結(jié)構(gòu)式如下：

優(yōu)選的，所述稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為鐿和/或鉺摻雜的nayf4。

優(yōu)選的，所述稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶粒徑為13-30nm，晶格間距為0.30nm，為(110)六方晶相。

優(yōu)選的，所述的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的制備方法如下：①將稀土硝酸鹽和硬脂酸的乙醇溶液逐漸加熱至78℃回流，然后滴加naoh的乙醇溶液，回流，混合物過濾，濾餅水洗兩次，醇洗一次，真空干燥，得到稀土硬脂酸前驅(qū)體；②將稀土硬脂酸前驅(qū)體和naf加入h2o、etoh和油酸中，攪拌轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)器中，反應(yīng)24小時后將反應(yīng)混合物冷卻，分離出沉淀物；③將chcl3和etoh加入沉淀物中，然后離心得到粗產(chǎn)物白色粉末，再用h2o-etoh洗三次、醇洗一次后，得到所述的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶。

優(yōu)選的，所述稀土硝酸鹽為yno3、ybno3和erno3的混合物；yno3、ybno3和erno3的摩爾比為0.78∶0.20∶0.02。

優(yōu)選的，所述將稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶采用聚丙烯酸改性得到聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的具體步驟如下：將稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶用氯仿分散得到稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶氯仿膠體溶液，然后滴加入nobf4的飽和二氯甲烷溶液，攪拌，然后離心分離，將沉淀物用乙醇沖洗三次再分散在n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入過量的甲苯，離心分離，產(chǎn)物分散入dmf中得到稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的dmf溶液；將聚丙烯酸(paa)(25％皂化)的dmf溶液緩慢加入到上述稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的dmf溶液，再加入丙酮攪拌，離心，然后水洗，得到聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒。

優(yōu)選的，將化合物1組裝在聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料的表面的具體步驟如下：將聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料分散在水中，然后將化合物1的dmso(二甲基亞砜)溶液逐滴加入，室溫下攪拌過夜，離心得到沉淀，水洗，得到所述檢測精氨酸的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米傳感材料。

所述的檢測精氨酸的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米傳感材料在精氨酸檢測中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的比率發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米納米材料中上轉(zhuǎn)換納米顆粒一方面起到能量供體的作用，另一方面上轉(zhuǎn)換納米顆粒起到有機分子錨定位點的作用。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是：本發(fā)明的比率發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米材料的激發(fā)波長為980nm，對細胞的傷害小，可以有效避免生物體的自發(fā)熒光，組織穿透能力強。以比率發(fā)光的方式檢測精氨酸，作為傳感器，可以同時檢測兩個不同波長處的熒光強度，建立內(nèi)部標度，可以克服單一熒光探針由于如儀器效率、檢測環(huán)境、探針濃度等因素影響檢測信號的問題。并且作為新型用于檢測精氨酸的溶酶體細胞定位發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移機理的比率發(fā)光上轉(zhuǎn)換傳感器，具有穩(wěn)定性好、抗干擾性好等優(yōu)點，適用于精氨酸檢測的比率生物發(fā)光成像。

附圖說明

圖1(a)為nayf4∶yb，er納米粒子的電鏡圖像，(b)為原位制備的nayf4∶yb，er的高分辨透射電鏡圖像，(c)聚丙烯酸(paa)修飾的nayf4∶yb，er納米粒子的電鏡圖像，(d)油酸(oa)改性的nayf4∶yb，er和聚丙烯酸(paa)改性的nayf4∶yb，er納米粒子xrd圖樣；

圖2(a)化合物1(7.3×10^-5m)在水/dmso溶液(8∶2(v/v))中的吸收光譜和paa-ucnps(0.15mg/ml)在980nm光激發(fā)下在水中的發(fā)光光譜；(b)paa-ucnps-1(0.25mg/ml)在水/dmso溶液(8∶2(v/v))中滴加精氨酸水溶液在980nm光激發(fā)下的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜；(c)隨精氨酸濃度增加660nm處與525nm處發(fā)光強度比率線性關(guān)系圖；

圖3探針paa-ucnps-1[0.25mg/ml分散于8∶2(v/v)water/dmso中]在660nm處與525nm處的發(fā)光強度隨精氨酸濃度(分別為1.0×10^-5m，5.0×10^-5m，1.0×10^-4m，1.5×10^-4m，2.0×10^-4m，3.0×10^-4m，4.0×10^-4m，5.0×10^-4m)，激發(fā)波長980nm；(b)980nm光激發(fā)下探針paa-ucnps-1[0.25mg/ml分散于8∶2(v/v)water/dmso中]在660nm處與525nm處發(fā)光強度比率時間變化曲線；(c)980nm光激發(fā)下探針paa-ucnps-1[0.25mg/ml分散于8∶2(v/v)water/dmso中]在660nm處與525nm處發(fā)光強度比率溫度變化曲線；

圖4(a)在980nm光激發(fā)下paa-ucnps-1[0.25mg/ml分散于8∶2(v/v)water/dmso中]加入不同的生物相關(guān)小分子(3.6×10^-4m)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光響應(yīng)情況及paa-ucnps-1和精氨酸(濃度5.0×10^-4m，水為溶劑)的混合物加入過量的其他生物相關(guān)小分子(3.6×10^-4m)后的上轉(zhuǎn)換發(fā)光響應(yīng)情況，激發(fā)光波長為980nm，反應(yīng)時間為20分鐘；ucl660和ucl525分別代表660nm和525nm處上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度；生物相關(guān)小分子為ala，asp，glu，gly，iie，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr，val，cys，hcy，glc，和h2o2；(b)黑暗環(huán)境下的經(jīng)探針paa-ucnps-1處理的hela細胞的活性測定；

圖5以0.006mg/ml的paa-ucnps-1和不同濃度的精氨酸((a1)0，(a2)2.0×10^-5m，和(a3)2.8×10^-5m)染色15分鐘的海拉細胞的共聚焦熒光圖像(通道1：λex＝980nm，λem＝660nm)；以溶酶體定位紅色染料(2.0mm)和不同濃度的精氨酸((b1)0，(b2)2.0×10^-5m，and(b3)2.0×10^-5m)染色15分鐘的海拉細胞的共聚焦熒光圖像(通道2：λex＝543nm，λem＝590nm)；(c1，c2andc3)(a)和(b)的合并圖像；

圖6(a)為加入paa-ucnps-1(0.006mg/ml)后的hela細胞的共聚焦顯微鏡圖片，圖6(b)、(c)為加入paa-ucnps-1(0.006mg/ml)和不同濃度的精氨酸(b2.0×10^-5m，c2.8×10^-5m)后hela細胞的共聚焦顯微鏡圖片；明場圖像(d，e，f)。激發(fā)波長為980nm，圖像660nm處收集；圖7化合物paa-ucnps，、化合物1和paa-ucnps-1的紅外光譜；

圖8化合物1濃度與紫外可見光譜之間關(guān)系圖(外圖)，650nm處的吸收與強度函數(shù)關(guān)系圖(插圖)；有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(paa-ucnps-1)中化合物1的濃度為7.51wt％，經(jīng)圖中函數(shù)計算得到有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(paa-ucnps-1)中的有機分子1濃度為6.6×10^-5m；

圖9滴加精氨酸(化合物1的0-30.0當量)水溶液反應(yīng)20分鐘的化合物1[1.0×10^-5min8∶2(v/v)water/dmso]的吸收光譜；

圖10激發(fā)波長為980nm聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps(0.15mg/ml)的8∶2(v/v)的水/二甲基亞砜溶液滴加精氨酸水溶液的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜；

圖11有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1[0.25mg/mlin8∶2(v/v)water/dmso]溶液中加入不同的金屬離子(0.11摩爾/升)的熒光相應(yīng)強度(淺色柱analyte)及有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1[0.25mg/mlin8∶2(v/v)water/dmso]與精氨酸(2.2×10^-3摩爾/升水溶液)的溶液加入過量的指定金屬離子的發(fā)光強度(深色柱arg+analyte)，激發(fā)波長為980nm，反應(yīng)時間為20分鐘；ucl660和ucl525分別代表660nm和525nm處上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度；所使用金屬離子分別為na⁺，mg²⁺，k⁺，ca²⁺，mn²⁺，co²⁺和zn²⁺；

圖12有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1[0.25mg/mlin8∶2(v/v)water/dmso]溶液中加入不同的陰離子(0.11摩爾/升)的熒光相應(yīng)強度(淺色柱analyte)及有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1[0.25mg/mlin8∶2(v/v)water/dmso]與精氨酸(2.2×10^-3摩爾/升水溶液)的溶液加入過量的指定陰離子的發(fā)光強度(深色柱arg+analyte)，激發(fā)波長為980nm，反應(yīng)時間為20分鐘；ucl660和ucl525分別代表660nm和525nm處上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度。所使用陰離子分別為f^-，cl^-，br^-，i^-，n3^-，no3^-，clo3^2-，clo4^-，c2o4^2-，sh^-，s2o3^2-，so3^2-，hso3^2-，so4^2-和hpo4^2-。

具體實施方式

實施例1

化合物1的制備采用如下合成路線：

1)合成3-吡咯烷基-1-苯酚(化合物6)：

將3-氨基苯酚(1.0913g，10.0mmol)、碳酸鉀(1.5203g，11.0mmol)和1，4-二溴丁烷(1340μl，11.0mmol)溶解于10mldmf中。加熱至80℃，反應(yīng)2小時，冷卻至室溫。過柱提純(展開劑為乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10)，得到3-吡咯烷基苯酚，產(chǎn)率：58.8％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.10(t，1h)，6.19(t，2h)，6.09(s，1h)，4.86(s，1h)，3.28(t，4h)，2.02(t，4h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc156.55，149.47，130.06，104.81，102.57，98.69，47.71，and25.44。

2)合成2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚(化合物5)：

將3-吡咯烷基苯酚(324.6毫克，2毫摩爾)溶解在12毫升的濃鹽酸(37wt％)和4ml的水混合溶劑中，將亞硝酸鈉(138毫克，2毫摩爾)的4毫升水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，混合物反應(yīng)1.5小時并過濾。固體用飽和醋酸鈉溶液洗滌三次，獲得呈紅褐色固體最終產(chǎn)物(340毫克，產(chǎn)率：88.4％)。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.30(d，1h)，6.72(d，1h)，5.91(s，1h)，5.32(s，1h)，3.44(t，4h)，1.92(t，4h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc173.88，169.19，156.46，134.66，117.30，96.28，49.63，and23.49。

3)合成3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮(化合物4)：

將2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚(720.75毫克，2.5毫摩爾)和1563微升80％的水合肼加入到17毫升乙醇中，將混合物加熱至30-40℃，然后加入41.5毫克pd-c催化劑。將上述混合物回流直至溶液的紅色在氬氣氛消失。加入2.5毫升丙酮酸乙酯，將反應(yīng)溶液回流4小時。通過真空蒸餾得到的粗產(chǎn)物，并用乙酸乙酯/石油醚(1/20)為洗脫液過柱提純得到終產(chǎn)物，產(chǎn)率為68％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.40(d，1h)，6.56(d，1h)，6.37(s，1h)，3.31(t，4h)，1.98(t，4h)，1.26(s，3h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc149.39，148.96，146.66，129.21，122.24，110.08，97.11，61.96，and48.04。

4)合成7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-3-甲醛(化合物3)：

將3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮(345.4毫克，1.5毫摩爾)與seo2(204.4毫克，1.8毫摩爾)溶解在12ml1，4-二氧六環(huán)中，回流7小時。減壓蒸餾，過柱分離提純(展開劑為二氯甲烷/乙醇＝500∶1)得到產(chǎn)物(式iii)，產(chǎn)率：84.7％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，cdcl3，tms)：δh10.08(s，1h)，7.67(d，1h)，6.68(d，1h)，6.31(s，1h)，3.51(t，4h)，2.15(t，4h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δc187.86，153.07，152.64，151.30，134.17，133.42，124.64，112.46，96.96，48.59，and25.33。

5)化合物2的制備：

稱取4-羧基苯肼鹽酸鹽(500mg，2.46mmol)和氫氧化鈉(98.5mg，2.46mmol)于100ml的茄形瓶中，加入適量的乙醇超聲，室溫條件下攪拌，溶解30min，隨后將乙醇旋出，將剩余的固體轉(zhuǎn)移至100ml三口瓶中，加入16ml冰乙酸溶解，再加入醋酸鈉(405mg，4.94mmol)，超聲溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮(397μl，3.7mmol)，加熱至100℃，回流16h，待反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)，冷卻至室溫，減壓蒸餾，旋出冰乙酸，用冰水冷卻至0℃，慢慢加入飽和的碳酸鈉溶液，直至沒氣泡產(chǎn)生為止，用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用無水硫酸鈉干燥，抽濾，再旋出二氯甲烷，得紅色油狀物2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸(405mg，產(chǎn)率為81％)。

將2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸(1.0g，4.93mmol)和碘甲烷(700mg，4.93mmol)溶解于10毫升乙腈中?；旌衔锛訜峄亓鞣磻?yīng)12小時，冷卻至室溫。過濾旋蒸除去溶劑得到化合物2(0.76g，44.7％)。

化合物2表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh8.38(s，1h)，8.19(d，1h)，8.03(d，21h)，4.00(s，3h)，2.82(s，3h)，1.57(sd，6h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc199.48，166.95，142.42，141.72，132.04，130.83，124.68，115.85，54.72，35.52，21.96，and15.12。

6)化合物1的制備：

將化合物3(209.9毫克，0.64毫摩爾)和化合物2(155.3毫克，0.64毫摩爾)溶解在17毫升乙醇中，加熱至78℃并回流12小時。將反應(yīng)溶液冷卻至室溫后過濾，濾餅用乙醚洗滌三次，得到為暗綠色固體，產(chǎn)率：76.4％。

化合物1的表征如下：hrms(ei)m/z：calcdforc26h26n3o4[m-i]，444.1923；found，444.1921.¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh8.39(s，1h)，8.24(s，1h)，8.19(d，1h)，8.02(d，1h)，7.80(d，1h)，7.66(d，1h)，6.96(d，1h)，6.67(s，1h)，4.04(s，3h)，3.59(t，4h)，2.00(t，4h)，1.79(s，6h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc166.99，153.39，145.75，143.88，133.14，131.55，131.04，127.48，124.22，115.58，114.86，98.14，52.30，49.49，34.98，26.22，and25.25。

稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的制備

將y2o3(0.8807g，3.9mmol)、yb2o3(0.3941g，1.0mmol)和er2o3(0.0383g，0.1mmol)溶解于20ml濃硝酸中，加熱出去過量的硝酸，得到白色粉末狀的稀土的硝酸鹽，y³⁺，yb³⁺和er³⁺的摩爾比為0.78∶0.20∶0.02；將上述稀土硝酸鹽和硬脂酸8.5344g(30mmol)的80ml乙醇溶液逐漸加熱至78℃回流，然后滴加naoh(1.1900g，30mmol)的20ml乙醇溶液，回流1小時?；旌衔镞^濾，濾餅水洗兩次，醇洗一次，真空干燥12小時得到稀土硬脂酸前驅(qū)體。將上一步得到的稀土硬脂酸前驅(qū)體(0.9577g，1.0mmol)和naf(0.2099g，5mmol)加入10mlh2o、15mletoh(乙醇)和5ml油酸的混合溶液中，攪拌15分鐘后轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)器中。150℃下反應(yīng)24小時后將反應(yīng)混合物冷卻至60℃，分離出沉淀物。將chcl3和etoh(v/v＝1∶6)共20毫升加入沉淀物中，然后離心(7800轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)得到粗產(chǎn)物白色粉末，再用h2o-etoh(v/v＝1∶2)洗三次、醇洗一次后，得到所述的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(nayf4∶yb，er)。

制備聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒

將稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(nayf4∶yb，er)分散于30毫升氯仿中得到得到稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(nayf4∶yb，er)氯仿膠體溶液，然后滴加入50mgnobf4的飽和二氯甲烷溶液，攪拌15分鐘。然后離心分離(18000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，將沉淀物用乙醇沖洗三次再分散在20毫升n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中。加入過量的甲苯(50ml)，離心分離(18000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)產(chǎn)物分散入10毫升dmf中得到nayf4∶yb，er的dmf溶液。將300毫克的聚丙烯酸(paa)(25％皂化)的10毫升dmf溶液緩慢加入到上述nayf4∶yb，er的dmf溶液，再加入60毫升丙酮攪拌12小時，離心(18000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，然后水洗，收集聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(paa-ucnps)并分散在水中得到paa-ucnps溶液。

將化合物1組裝在聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料的表面(paa-ucnps-1)：

化合物1(45.72mg)的dmso(0.5ml)溶液逐滴加入圓底燒瓶中的所制備的paa-ucnps(5mg/ml)溶液中，然后混合物室溫下攪拌過夜得到均相液體?；旌衔镫x心后，反復用水沖洗三次，收集固相，得到所述的檢測精氨酸的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米傳感材料(paa-ucnps-1)。(paa-ucnps-1需在去離子水中分散保持)。

本實施例中制備的檢測精氨酸的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米傳感材料作為熒光探針的應(yīng)用。

本發(fā)明中有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1中的稀土納米顆粒由溶劑熱法制備，paa修飾的稀土納米顆粒由配體交換過程制備。如圖1所示有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料(paa-ucnps-1)的電鏡圖片可以看到納米顆粒的尺寸形狀均一，顆粒直徑在13nm到30nm之間。其高分辨電鏡顯示晶格間距為0.30nm，對應(yīng)于nayf4∶yb，er納米顆粒的(110)六方晶相。原位(油酸)制備的nayf4∶yb，er和paa-ucnps的xrd圖樣與標準圖樣相一致(jcpds28-1192)，說明表面修飾并未改變納米顆粒晶相。

圖2中化合物1的吸收光譜和納米顆粒paa-ucnps在980nm光激發(fā)下在水中的發(fā)光光譜相重疊，識別精氨酸后化合物1的吸收光譜藍移，使得有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的發(fā)光出現(xiàn)比率變化(圖3)；并且種變化不隨時間和溫度的變化而變化。

由圖4可以看到精氨酸影響有機分子探針的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，對上轉(zhuǎn)換納米顆粒的發(fā)光沒有影響，并且除精氨酸外的其他生物相關(guān)小分子ala，asp，glu，gly，iie，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr，val，cys，hcy，glc，和h2o2對上轉(zhuǎn)換發(fā)光無影響。暗毒性測試表明在測試濃度下有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒探針paa-ucnps-1對細胞毒性較?。粓D5的hela細胞的共聚焦顯微鏡圖片證實復合細胞實驗(圖5、圖6)證明有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米探針paa-ucnps-1可以實現(xiàn)溶酶體細胞定位，并以比率發(fā)光的方式實現(xiàn)精氨酸的細胞檢測成像。

圖7的化合物paa-ucnps、1和paa-ucnps-1的紅外光譜證實有機熒光探針負載于復合上轉(zhuǎn)換納米探針；圖8化合物1濃度與紫外可見光譜之間關(guān)系圖和650nm處的吸收與強度函數(shù)關(guān)系圖確認負載的有機熒光探針的量；圖9滴加精氨酸水溶液反應(yīng)20分鐘的化合物1的吸收光譜和圖10激發(fā)波長為980nm聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps溶液滴加精氨酸水溶液的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜證實精氨酸對有機化合物1的吸收光譜和上轉(zhuǎn)換納米顆粒的發(fā)光光譜的不同作用，是其機理的重要證據(jù)。圖11有機分子修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1識別精氨酸的na⁺，mg²⁺，k⁺，ca²⁺，mn²⁺，co²⁺和zn²⁺金屬離子和f^-，cl^-，br^-，i^-，n3^-，no3^-，clo3^2-，clo4^-，c2o4^2-，sh^-，s2o3^2-，so3^2-，hso3^2-，so4^2-和hpo4^2-陰離子干擾實驗證實有機復合上轉(zhuǎn)換納米顆粒paa-ucnps-1具有很好的抗干擾性。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種新型用于檢測精氨酸的溶酶體細胞定位發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移機理的比率發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米探針。該納米探針在精氨酸的發(fā)光呈現(xiàn)出比率變化。該傳感器具有很好的精氨酸檢測性質(zhì)，很好的光和熱穩(wěn)定性、抗干擾性，適用于檢測精氨酸的比率的生物發(fā)光成像。