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一種秸稈的預(yù)處理方法以及包含經(jīng)預(yù)處理后秸稈的修復(fù)劑與流程

文檔序號:11510136閱讀:803來源:國知局
一種秸稈的預(yù)處理方法以及包含經(jīng)預(yù)處理后秸稈的修復(fù)劑與流程

本發(fā)明涉及一種秸稈的預(yù)處理方法以及包含經(jīng)預(yù)處理后秸稈的修復(fù)劑,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。



背景技術(shù):

土傳病害是由于土壤中病原物侵染寄主植物所引起的一類植物病害。通常作物栽培3-5年后土傳真菌和根結(jié)線蟲危害會越來越重,對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重的影響。一般可以造成減產(chǎn)20%-40%,嚴(yán)重的可減產(chǎn)60%以上甚至絕收。我國是農(nóng)業(yè)大國,近年來隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,我國設(shè)施農(nóng)業(yè)蓬勃發(fā)展,保護(hù)地蔬菜面積已超過約230萬公頃,高附加值作物和種苗種植面積超過500萬公頃,保護(hù)地蔬菜栽培和生產(chǎn)己成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要部分。但是由于大棚生產(chǎn)栽培品種單一,復(fù)種指數(shù)高,再加上溫室大棚特殊的環(huán)境條件和管理模式,隨著栽培時間的延長,土傳植物病害發(fā)生嚴(yán)重,農(nóng)作物產(chǎn)量下降,品質(zhì)變差,嚴(yán)重影響了保護(hù)地栽培的可持續(xù)發(fā)展。特別是近年來,由于溫室大棚及其相關(guān)設(shè)施日益完善,保護(hù)地栽培已經(jīng)進(jìn)入了穩(wěn)定的規(guī)?;a(chǎn)階段,農(nóng)戶因為市場需求和土地資源的緊張,越來越多地進(jìn)行高附加值產(chǎn)品的連續(xù)化生產(chǎn),農(nóng)作物輪作期限大大縮短,這更為植物土傳病害在溫室大棚的發(fā)生創(chuàng)造了適宜的生態(tài)環(huán)境和滋生條件。由于缺乏有效的技術(shù)防治,致使溫室大棚產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)利益逐年下降。

引起植物土傳病害的主要病原真菌有鐮孢菌(fusariumspp.)、立枯絲核菌(rhizoetoniaspp.)和灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)等。這些土傳病原菌可以在土壤或植物殘體上習(xí)居存活多年,難以清除,造成防治困難,一旦溫度、濕度等條件合適時就會侵染寄主,引發(fā)枯萎病、根腐病、立枯病、灰霉病等農(nóng)作物常見病和多發(fā)病害。特別是在冬季連續(xù)陰天、高濕情況下,植株一旦發(fā)病,田間發(fā)病率可以達(dá)25%-65%,嚴(yán)重的田塊達(dá)75%-85%,甚至全部毀滅。給菜農(nóng)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。同時,由于溫室大棚連茬種植,使得棚內(nèi)土壤理化性質(zhì)和環(huán)境條件發(fā)生變化,一些有益微生物的生長受到抑制,而有害微生物迅速繁殖,土壤微生態(tài)平衡遭到破壞。而病害的頻繁發(fā)生,又導(dǎo)致菜農(nóng)頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥來防治,這又使土壤中農(nóng)藥殘留大幅增加,形成惡性循環(huán)。我們采用多點取樣的方法,在同一地塊的溫室大棚內(nèi)和大棚外分別采取土壤樣品,通過實驗室培養(yǎng)、檢測得出如下結(jié)果:

溫室大棚內(nèi)土壤和棚外土壤生物撿測結(jié)果

由上表可見:棚內(nèi)土壤中,土傳病原菌數(shù)量是棚外的3.2倍,其他微生物如細(xì)菌量減少了7.8倍,真菌量減少2倍,放線菌減少5倍,農(nóng)藥殘留量卻比棚外高了6.7倍??梢娭夭绶N植使棚內(nèi)土壤中的病原菌大量孳生繁殖,導(dǎo)致其他有益微生物數(shù)量降低,嚴(yán)重破壞了土壤微生態(tài)平衡;同時土傳病原菌的大量存在,也易引發(fā)蔬菜病害的頻繁發(fā)生,而菜農(nóng)頻繁的噴藥防治,又增加了土壤和蔬菜中的農(nóng)藥殘留量。

由于土傳病害一旦發(fā)生就很難根治,因此在作物定植前也可對土壤進(jìn)行消毒處理,從而殺滅土壤中的植物病原菌。溴甲烷(methylbromide,mb)是使用廣泛、效果較好的熏蒸劑,可有效殺滅土壤中的真菌、細(xì)菌、土傳病毒、線蟲等。但溴甲烷是破壞臭氧層物質(zhì),因此被《蒙特利爾議定書》列為受控物質(zhì),在2015年后已禁止使用。

生物防治是用拮抗微生物防治植物土傳病害的一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效地防治方法,前景廣闊。生物防治已有60多年歷史,并取得了一定的成果。近年來土傳病害的生物防治在許多方面取得了重大進(jìn)展,有些生防材料的商品化制劑己在有些國家開始出售,其中以木霉為主成分的殺菌劑己經(jīng)至少在6個國家注冊。目前國外防治溫室大棚土傳病害的微生物農(nóng)藥有80多種。其中新西蘭生產(chǎn)的用來防治植物土傳病害的木霉產(chǎn)品有5種;美國生產(chǎn)了綠粘帚產(chǎn)品用于防治絲核菌引起的立枯??;我國也研制了一些生物農(nóng)藥,如防治青枯病的青枯散等。但由于生物農(nóng)藥生產(chǎn)及使用成本較化學(xué)農(nóng)藥高幾倍、甚至十幾倍,限制了生物農(nóng)藥的推廣和使用。

我國是農(nóng)業(yè)大國,秸稈資源豐富,每年秸稈產(chǎn)量約6一7億噸,其中玉米秸稈3-4億噸,占比達(dá)到50%左右。玉米秸稈作為廉價的可再生性生物質(zhì)資源,可謂來源豐富。當(dāng)前,秸稈的利用率僅為30%,大量農(nóng)作物秸稈被廢棄,甚至被露天焚燒,導(dǎo)致空氣污染和資源浪費。玉米秸稈主要基本成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等。其中纖維素約占32%、半纖維素為27.8%。纖維素是由葡萄糖基結(jié)構(gòu)單元通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的線性高分子聚合物,線性聚合物通過氫鍵和范德華作用力結(jié)合形成的具有晶體結(jié)構(gòu)的纖維束。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互交織、連接形成了致密頑固的三維網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu),以及纖維素自身所具有的結(jié)晶結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致秸稈中的可發(fā)酵碳水化合物組分很難被微生物直接代謝利用,需要先進(jìn)行預(yù)處理脫除木質(zhì)素或半纖維素,破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。在酸、堿等作用下,可脫除木質(zhì)纖維素中的半纖維素以及木質(zhì)素,打破纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu),為后續(xù)纖維素發(fā)酵過程提供適宜的底物。但傳統(tǒng)的酸、堿預(yù)處理過程,會產(chǎn)生大量的廢水,面臨著環(huán)境污染嚴(yán)重、處理成本較高等問題。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明針對上述缺陷,目的在于提供一種能有效的對秸稈進(jìn)行預(yù)處理,使其內(nèi)含的可發(fā)酵碳水化合物被微生物利用,且得到一種能具備很好土壤修復(fù)能力的一種秸稈的預(yù)處理方法以及包含經(jīng)預(yù)處理后秸稈的修復(fù)劑。

為此本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種秸稈的預(yù)處理方法,采用一級預(yù)處理方式進(jìn)行秸稈處理,以fecl3為催化劑,jfc-m溶液為高溫滲透劑。

按照以下具體步驟進(jìn)行:

1)取20-21g干燥玉米秸稈樣品和400-410ml去離子水,加入催化劑fecl31.0-1.1g;加入高溫滲透劑jfc-m溶液20ml-21ml,混合后加入到反應(yīng)釜中,并密封反應(yīng)釜;

2)打開磁力攪拌裝置的冷卻水閥,先行冷卻,避免高溫導(dǎo)致磁力攪拌器消磁;

3)將磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速調(diào)至260-280r/min,打開電加熱裝置開關(guān),開始加熱;

4)水熱預(yù)處理:當(dāng)溫度160-165℃,恒溫保持時間25-26min,進(jìn)行水解,分離玉米秸稈中的半纖維素組分,脫除木質(zhì)素,預(yù)處理反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行固液分離,固項物料送至固體發(fā)酵,液項返回級預(yù)處理當(dāng)做水繼續(xù)使用;

上述各組分的比例可同比例放大或縮小。

所述jfc-m溶液濃度為6mg/ml。

一種土壤修復(fù)劑,采用所述處理過的秸稈作為原料,還包括有木霉菌tg31-6;

所述tg31-6分離篩選按照以下方式進(jìn)行:在100ml含多菌靈濃度為200mg/l的富集培養(yǎng)液中分別加入10g土樣,30℃搖床培養(yǎng)3d后,吸取5ml轉(zhuǎn)接至多菌靈濃度為400mg/l富集培養(yǎng)液中,培養(yǎng)3d,依次連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接5次,使多菌靈濃度依次為200、400、500、600和800mg/l。富集完畢后,取培養(yǎng)液均勻涂布于相同濃度的多菌靈分離純化培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待平板上出現(xiàn)單菌落后,挑取較大單菌落轉(zhuǎn)接至pb培養(yǎng)基上,反復(fù)純化,最終篩選出降解菌tg31-6。經(jīng)過實驗室初步鑒別為綠色木霉;

其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/l):k2hpo45.71,kh2po41.70,(nh4)2so42.63,mgso4·7h2o0.095,mnso40.05,feso40.05,cacl20.003,水1000,ph=7.0;

富集培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入多菌靈(多菌靈先用少量稀鹽酸溶解設(shè)5個濃度梯度,分別為200mg、400mg、500mg、600mg、800mg);

分離培養(yǎng)基(g/l):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,nacl5.0,瓊脂20。

一種土壤修復(fù)劑,具體按照以下步驟進(jìn)行:

1)液體發(fā)酵:

液體培養(yǎng)基:土豆浸出液8-10ml,(nh4)2so40.2g-0.4g,k2hpo40.2g-0.3g,cac031g,補(bǔ)加水至100ml,調(diào)ph6-6.5;用上述物質(zhì)配成培養(yǎng)液100ml,高壓滅菌20-30分鐘,冷卻后接入已活化好的木霉菌tg31-6,于25-28℃、200轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng),用分光光度計測量od600值達(dá)到0.30-0.35停止液體發(fā)酵,發(fā)酵液作為種子液備用;

2)固體發(fā)酵:

固體培養(yǎng)基:已預(yù)處理的玉米秸稈粉10-11g,麩皮1-2g,葡萄糖0.8-0.9g,(nh4)2so40.2-0.4g,kh2po40.1-0.2g,mgs04·7h200.08-0.1g,水100ml,調(diào)ph6-6.5;先用水把葡萄糖和無機(jī)鹽溶解后,再與玉米秸稈粉、麩皮攪拌均勻,用稀酸液調(diào)節(jié)溶液ph值為5-5.5,高壓滅菌30分鐘,冷卻后接入上述tg31-6種子液100-130ml,同時加入10fpu/g底物的纖維素酶,攪拌均勻,放在25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)80-90小時,用血球計數(shù)板測量固體發(fā)酵物的產(chǎn)孢量達(dá)到1015/g,即可結(jié)束固體混菌發(fā)酵出料,常溫風(fēng)干或使用真空干燥器控制溫度43-45℃干燥,即可得到生物修復(fù)劑。

本發(fā)明的優(yōu)點是:本發(fā)明開發(fā)了一級水熱預(yù)處理工藝。高溫液態(tài)水能夠自電離產(chǎn)生h3o+,離子積常數(shù)增大,介電常數(shù)降低,用于預(yù)處理木質(zhì)纖維素能夠有效水解半纖維素,破壞木質(zhì)纖維素致密的結(jié)構(gòu),活化纖維素,從而提高纖維素酶的可及度。水熱預(yù)處理玉米秸稈,能夠有效的水解玉米秸稈中的半纖維素,降解少量木質(zhì)素,破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu),從而提高玉米秸稈中纖維素在酶解糖化過程中的效率。經(jīng)過處理的纖維素能夠通過纖維素酶降解生成其組成單元葡萄糖,葡萄糖可以作為碳源而被微生物更好地利用。

本發(fā)明研制的土壤生物修復(fù)劑,它既能有效抑制土壤中的土傳病原菌,提高有益微生物數(shù)量,修復(fù)被破壞的生態(tài)環(huán)境;又可生物降解土壤中的農(nóng)藥殘留,使生產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品達(dá)到綠色食品標(biāo)準(zhǔn)。這就從根本上解決溫室大棚產(chǎn)生的作物發(fā)病率越來越高,產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量越來越高,而農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)卻逐年下降問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明tg31-6菌株對五種不同化學(xué)農(nóng)藥的降解率柱圖。

圖2為處理多菌靈2d的培養(yǎng)液采用hplc-ms分析,結(jié)果出現(xiàn)4個峰的圖形。

圖3、4、5、6為本發(fā)明的質(zhì)譜圖。

圖7為對12-8菌株處理多菌靈5d的培養(yǎng)液進(jìn)行分析時的圖形。

具體實施方式

下面對本發(fā)明作出進(jìn)一步詳細(xì)的說明:

一、秸稈預(yù)處理

1、水熱預(yù)處理優(yōu)點

針對玉米秸稈結(jié)構(gòu)致密、難于直接被酶水解的特點,目前均采用稀酸、氨水/稀酸、氫氧化鈉等方法對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理的目的就是降解脫除木質(zhì)纖維素中的半纖維素以及木質(zhì)素,打破纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu),為后續(xù)纖維素的酶解、發(fā)酵過程提供適宜的底物。但傳統(tǒng)的酸、堿預(yù)處理過程,會產(chǎn)生大量的廢水,面臨著環(huán)境污染嚴(yán)重、處理成本較高等問題。本成果開發(fā)了一級熱水預(yù)處理工藝。其優(yōu)點:

(1)水熱預(yù)處理技術(shù)對環(huán)境友好,更加經(jīng)濟(jì)、綠色、清潔、環(huán)保。

(2)預(yù)處理液循環(huán)回用技術(shù)可提高預(yù)處理液的酸度,強(qiáng)化玉米秸稈原料水熱預(yù)處理的效果,此過程無需額外添加化學(xué)試劑,不會對產(chǎn)品分離等后續(xù)工藝造成負(fù)擔(dān)。且將預(yù)處理液回用能降低過程能耗和工藝廢水的排放。

(3)fe3+對半纖維素的溶出率有很強(qiáng)烈的催化作用,可大幅提高酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率,和未添加fecl3時對比,分別提高了酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率為48.6%和66.5%。預(yù)處理溫度由未加的180℃、處理時間30min,下降為160℃,20min,可降低能源消耗和處理成本。因為預(yù)處理溫度過高,纖維素在預(yù)處理過程中損失嚴(yán)重,從而導(dǎo)致酶解過程中葡萄糖的收率下降。夠獲得較高的葡萄糖收率,控制纖維素在預(yù)處理過程中的降解損失是非常有必要的。水熱預(yù)處理能夠有效水解分離玉米秸稈中的半纖維素成分,同時較好的保護(hù)纖維素組分不受損失,尤其在較低的預(yù)處理溫度和較短的預(yù)處理時間條件下,能夠較好的保護(hù)纖維素的完整性,提高木霉分生孢子產(chǎn)量。

(4)高溫滲透劑jfc-m的加入,利于熱水及催化劑fe3+滲透纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu),更好地脫除半纖維素及木質(zhì)素。分析認(rèn)為:jfc-m是聚氧乙烯醚化合物,由于醚基和熱水自電離產(chǎn)生h3o+和fe3+通過范德華力等相互作用,有利于熱水和催化劑滲透到致密的纖維結(jié)晶結(jié)構(gòu),大幅提高半纖維素和木質(zhì)素的脫除率。可使文獻(xiàn)中的二級預(yù)處理工藝,簡化成一級。簡化了工藝流程,提高可勞動生產(chǎn)率、降低了設(shè)備投資及能源消耗。

2、水熱處理工藝

玉米秸稈原料自然風(fēng)干后,通過物料粉碎機(jī)將風(fēng)干的玉米秸稈粉碎、篩分,篩選出粒徑約40目的部分,放入真空干燥箱中,在溫度為105℃條件下干燥,將干燥后的秸稈原料置于干燥器中儲備備用。

玉米秸稈水熱預(yù)處理具體實驗步驟如下:

(1)預(yù)處理實驗采用的固液比為5%(wt),即取20-21g干燥玉米秸稈樣品和400-410ml去離子水,加入催化劑fecl31.0-1.1g;加入高溫滲透劑jfc-m溶液20ml-21ml(濃度為6mg/ml的jfc-m溶液),混合后加入到1000ml的反應(yīng)釜中,并密封反應(yīng)釜。

(2)首先打開磁力攪拌裝置的冷卻水閥,先行冷卻,避免高溫導(dǎo)致磁力攪拌器消磁。

(3)依次打開實驗裝置的總電源、控制器電源、顯示器電源,設(shè)定預(yù)處理目標(biāo)溫度,將磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速調(diào)至260-280r/min,打開電加熱裝置開關(guān),開始加熱。

(4)水熱預(yù)處理:當(dāng)溫度160-165℃,恒溫保持時間25-26min,進(jìn)行水解,分離玉米秸稈中的半纖維素組分,脫除木質(zhì)素,使秸稈結(jié)構(gòu)變得疏松,預(yù)處理反應(yīng)結(jié)束后,通過布氏漏斗進(jìn)行固液分離,固項物料送至固體發(fā)酵;液項返回級預(yù)處理當(dāng)做水繼續(xù)使用。

(5)在上述相同條件下,作不加jfc-m的二級水熱預(yù)處理試驗:

第一級預(yù)處理:當(dāng)溫度180℃,恒溫保持時間30min,進(jìn)行水解,預(yù)處理反應(yīng)結(jié)束后,通過布氏漏斗進(jìn)行固液分離,固體相進(jìn)行第二級水熱預(yù)處理;液項返回第一級預(yù)處理當(dāng)做水繼續(xù)使用。

第二級預(yù)處理:一級處理后的固體20-21g,400-410ml去離子水,混合后加入到1000ml的反應(yīng)釜中,并密封反應(yīng)釜。當(dāng)溫度達(dá)到200℃時,恒溫30min,二級水熱預(yù)處理反應(yīng)結(jié)束后,將物料通過布氏漏斗進(jìn)行固液分離,固項底物送至酶解裝置。

(6)預(yù)處理反應(yīng)結(jié)束時,關(guān)閉電加熱裝置開關(guān),停止加熱,打開冷卻水給反應(yīng)釜降溫,當(dāng)反應(yīng)釜溫度降到30℃時,關(guān)閉冷卻水。

其中高溫滲透劑jfc-m溶液配制:

配制濃度為6mg/ml的jfc-m溶液:稱取1.2g(精確至o.ooolg)jfc-m,溶于200ml水(加熱),搖勻,待用。

3.結(jié)果分析

把經(jīng)過一級預(yù)處理和經(jīng)過二級處理后的秸稈取樣,在相同條件下酶解。用高速液相色譜分析酶解液中葡萄糖的收率,結(jié)果如下表:

。

由上表可見:加入高溫滲透劑jfc-m后,不僅處理溫度下降,處理時間由原來的1小時縮短為25分鐘,而且,把繁瑣的二級工藝,簡化為一級處理工藝,既降低設(shè)備投資,還提高了勞動生產(chǎn)率、降低了能源消耗和處理成本。而且,通過一級處理后的葡萄糖收率還比二級處理的高10.1%。分析認(rèn)為:加入由于jfc-m是聚氧乙烯醚化合物,由于醚基和熱水自電離產(chǎn)生h3o+和fe3+通過范德華力等相互作用,有利于熱水和催化劑滲透到致密的纖維結(jié)晶結(jié)構(gòu),大幅提高半纖維素和木質(zhì)素的脫除率,使纖維素活性基團(tuán)暴露出來,增加了纖維素與纖維素酶接觸的面積,從而有利于后續(xù)纖維素分解過程。

經(jīng)過水熱預(yù)處理后,玉米秸稈固體發(fā)酵的物料中,木霉分生孢子產(chǎn)量由原來的1010/g,提高到1015/g。減少了產(chǎn)品的運輸和包裝成本。同時,玉米秸稈的利用率由原來的5%,提高到15-20%,提高了原料的利用率,節(jié)約了資源,提高了勞動生產(chǎn)率,降低了生產(chǎn)成本。

二、高溫滲透劑篩選:

按上述方法,同時做高溫滲透劑jfc-4、aep980ep-98對比試驗。

用高速液相色譜分析酶解液中葡萄糖的收率,結(jié)果如下表:

由此可以得出采用高溫滲透劑jfc-m的葡萄糖收率明顯高于aep980ep-98、jfc-4的收率,因此本發(fā)明選用jfc-m為高溫滲透劑。

三、液、固體發(fā)酵

土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的方法,按以下步驟進(jìn)行:

1液體發(fā)酵:

液體培養(yǎng)基:土豆浸出液8-10ml,(nh4)2so40.2g-0.4g,k2hpo40.2g-0.3g,cac031g,補(bǔ)加水至100ml,調(diào)ph6-6.5;用上述物質(zhì)配成培養(yǎng)液100ml,高壓滅菌20-30分鐘,冷卻后接入已活化好的木霉菌tg31-6,于25-28℃、200轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng),用分光光度計測量od600值達(dá)到0.30-0.35停止液體發(fā)酵,發(fā)酵液作為種子液備用;

2固體發(fā)酵:

固體培養(yǎng)基:已預(yù)處理的玉米秸稈粉10-11g,麩皮1-2g,葡萄糖0.8-0.9g,(nh4)2so40.2-0.4g,kh2po40.1-0.2g,mgs04·7h200.08-0.1g,水100ml,調(diào)ph6-6.5;先用水把葡萄糖和無機(jī)鹽溶解后,再與玉米秸稈粉、麩皮攪拌均勻,用稀酸液調(diào)節(jié)溶液ph值為5-5.5,高壓滅菌30分鐘,冷卻后接入上述tg31-6種子液100-130ml,同時加入10fpu/g底物的纖維素酶,攪拌均勻,放在25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)80-90小時,用血球計數(shù)板測量固體發(fā)酵物的產(chǎn)孢量達(dá)到1015/g,即可結(jié)束固體混菌發(fā)酵出料,常溫風(fēng)干或使用真空干燥器控制溫度43-45℃左右干燥,即可得到生物修復(fù)劑。

tg31-6的分離篩選:土樣:取自江蘇靖江農(nóng)藥廠倉庫被多菌靈等農(nóng)藥長期污染的土壤;

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.1%):由山東化揚科技股份有限公司提供。

纖維素酶活是以濾紙酶活(filterpaperactivity)定義的。即1單位的酶活(filterpaperunit,fpu).是以whatmanno.l濾紙為底物,在ph值5.50℃的條件下,每分鐘內(nèi)催化纖維素水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖所用的酶量。實驗前根據(jù)測試數(shù)據(jù),計算出10fpu/g底物的纖維素酶的量。

木霉(trichodermasp.)tg31-6菌株,對病原真菌鐮孢菌(fusariumspp.)、立枯絲核菌(rhizoetoniaspp.)和灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)等多種土傳病原菌具有良好抑制作用;其特征主要有:

1、對五種農(nóng)藥殘留有良好的降解作用

該菌株在保持對多種病原菌有良好拮抗性同時,對速克靈、多菌靈等氨基甲酸甲酯類化學(xué)農(nóng)藥殘留有顯著的降解效果,降解率達(dá)80-95%,可顯著降解土壤中的農(nóng)藥殘留,使生產(chǎn)的蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品有害殘留大幅降低,達(dá)到綠色食品標(biāo)準(zhǔn),

在土壤中,人工接種該修復(fù)劑,接種量為0.3g/kg干土,含水量15%,加入多菌靈、速克靈,粉銹寧,克菌丹,甲霜靈,濃度為100mg/kg干土。把盆土放入人工環(huán)境培養(yǎng)箱,在溫度25℃、濕度85%下進(jìn)行降解處理10-12d時,取樣殘留高速液相色譜檢測,農(nóng)藥殘留量。對這些農(nóng)藥的降解率達(dá)80-95%。

能對多種化學(xué)農(nóng)藥具有顯著的將解效果,這一特性在目前國內(nèi)外的研究中還沒未見報道(見圖1)。

2、對農(nóng)藥殘留降解產(chǎn)物不產(chǎn)生二次污染,菌株tg31-6對多菌靈降解實驗:

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入100mg/l多菌靈,以5%接種量接入木霉)tg31-6種子液,于25℃、200r/min振蕩培養(yǎng)。第2d,第5d分別取樣1次,用hplc-ms檢測培養(yǎng)液中多菌靈及代謝產(chǎn)物。

處理多菌靈2d的培養(yǎng)液采用hplc-ms分析,結(jié)果出現(xiàn)4個峰(圖2),結(jié)合質(zhì)譜圖3、圖4、圖5、圖6認(rèn)為代謝產(chǎn)物分別為:2-氨基苯腈、2-氨基苯并咪唑、苯并咪唑和殘留的多菌靈,保留時間分別為:1.41,1.81,2.42和3.14min。而在對12-8處理多菌靈5d的培養(yǎng)液進(jìn)行分析時,卻未檢測出代謝產(chǎn)物和多菌靈(圖7)。表明12-8菌株5d已完全降解100mg/l的多菌靈。

通過hplc-ms質(zhì)譜聯(lián)用儀分析,認(rèn)為12-8菌株產(chǎn)生的酯酶首先使多菌靈氨基甲酸酯的酯鍵斷裂,形成2-氨基苯并咪唑,進(jìn)而繼續(xù)轉(zhuǎn)化成苯并咪唑、2-氨基苯腈,再通過單加氧酶或雙加氧酶將氧原子加在苯環(huán)上形成羥基團(tuán)導(dǎo)致開環(huán),最終被徹底降解成二氧化碳和水,對環(huán)境不產(chǎn)生二次污染。

3、可生物防治5種土傳植物病害:

該修復(fù)劑還可以防治農(nóng)作物枯萎病、灰霉病和霜霉病等常見病和多發(fā)病害,生防效果達(dá)到80%以上,均優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥防治效果。

取修復(fù)劑5g與2000g土壤混合后裝入盆內(nèi);取2000g土壤裝入盆內(nèi),用50%多菌靈可濕性粉劑500倍液15ml澆灌;取2000g土壤裝入盆內(nèi)作為對照。以上三盆分別移栽8株津青1號黃瓜苗。然后分別取15ml尖鐮孢菌孢子懸浮液(105cfu/ml)灌根。每處理4盆,重復(fù)3次。于25℃保濕10d,調(diào)查瓜苗發(fā)病情況,計算發(fā)病率和對枯萎病的防治效果。依據(jù)上述方法分別用甲霜靈、粉銹寧和代森錳鋅替代多菌靈;用灰葡萄孢菌、古巴假霜霉菌、單絲殼白粉菌、炭疽病病原菌葫蘆科刺盤孢菌代替尖鐮孢菌,用于防治灰霉病、霜霉病、白粉病和炭疽病。

發(fā)病率=感病株數(shù)/總株數(shù)×100%

防治效果=(對照發(fā)病率-用藥發(fā)病率)/對照發(fā)病率×100%

防治效果防治結(jié)果見表1-5。

。

4、提高農(nóng)作物產(chǎn)量:

使用本生物修復(fù)劑處理后,還可使農(nóng)作物產(chǎn)量曾加15-30%。在種植黃瓜的溫室大棚內(nèi),把本生物修復(fù)劑用玉米秸稈粉稀釋到分生孢子為(108個/克),在黃瓜秧長到1.3米左右,隨機(jī)選取100株,圍繞黃瓜秧的根部(不要傷害根)挖10公分左右的坑,每株放置50克菌劑,然后用土壤填埋好。并選取旁邊100株黃瓜,每株按上述方法放入50克秸稈粉作對照。在采摘黃瓜時統(tǒng)計20次的采摘量作為對照產(chǎn)量,實驗結(jié)果見表6。

表6使用本修復(fù)劑處理和未處理的黃瓜產(chǎn)量統(tǒng)計結(jié)果

對土壤起到良好的修復(fù)效果,還能大幅提高大棚蔬菜的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。

5、改善土壤的微生態(tài)環(huán)境:

該修復(fù)劑還能增加土壤中有益微生物的數(shù)量,改善土壤的微生態(tài)環(huán)境。通過對溫室大棚內(nèi)被本生物修復(fù)劑處理過的土壤、棚內(nèi)未處理的土壤以及溫室大棚外的土壤進(jìn)行多點取樣,混合均勻后,分別稱取10克土樣,加入到100ml無菌水的三角瓶中,置于200r/min的要床上震蕩30min混勻,作為母液。然后參照:農(nóng)用微生物菌劑gb20287-2006中的平板計數(shù)法,分別檢測土壤中的微生物數(shù)量,檢測結(jié)果見表7。

表7溫室大棚內(nèi)處理土壤、未處理土壤和棚外土壤生物撿測結(jié)果

。

由上表可見:大棚土壤經(jīng)過修復(fù)劑處理后,病原菌數(shù)、多菌靈殘留量均大幅降低,而有益菌群大幅提高,各項指標(biāo)與自然土壤非常接近,修復(fù)了被破壞的微生態(tài)環(huán)境。

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