本發(fā)明提供了一個可用于選擇性檢測硝基還原酶的熒光探針，利用反應物與產物的熒光差別實現(xiàn)對硝基還原酶活性的檢測。

背景技術：

硝基還原酶可由大腸桿菌等細菌合成，在人的某些類型的細胞處于缺氧狀態(tài)時也會大量表達,在還原型輔酶ⅰ(nadh)或ⅱ(nadph)存在下，硝基還原酶可以代謝芳香族硝基化合物；另一方面，硝基還原酶可用于生物化工合成、抗腫瘤藥物研發(fā)等領域(萬瓊瓊等，分析科學學報，2014年，第30卷，755-759頁)。因此，評價硝基還原酶的活性就有著十分重要的意義。

熒光法是有效檢測硝基還原酶活性的手段之一。一個有應用價值的熒光探針需要有專一的選擇性。值得注意的是，在生理條件下，硫化氫也可能將硝基還原為氨基；利用這一反應，人們已經開發(fā)出了多個檢測生物體系內硫化氫的熒光探針(fabiaoyuet.al,chem.commun.,2014,50,12234-12249)。根據(jù)我們的文獻調研，完全不對硫化氫響應的檢測硝基還原酶的熒光探針還沒有報道。因此開發(fā)對硝基還原酶具有高選擇性的熒光探針仍然具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種可用于選擇性檢測硝基還原酶的熒光探針，在生理條件下硫化氫不能使得體系熒光增強。

本發(fā)明采用如下技術方案：采用萘酰亞胺染料作為熒光母體，基于硝基被還原為氨基引起的多米諾分解反應，在還原型輔酶ⅰ存在下，本探針可以在ph為7.2的水溶液中選擇性地被硝基還原酶代謝，代謝產物可以發(fā)出強熒光，從而實現(xiàn)選擇性地檢測硝基還原酶。

所述熒光探針的結構式為a：

上述結構式a表示的熒光探針應用于檢測硝基還原酶，反應生成具有結構式b結構的化合物，從而導致體系熒光增強。

結構式a所示的熒光探針可對硝基還原酶定性、定量的檢測。將濃度呈梯度變化的硝基還 原酶分別加入含熒光探針a和還原性輔酶ⅰ的水溶液中，反應達到平衡后，分別測定各樣品的熒光強度，然后以硝基還原酶的濃度為橫坐標、反應后體系的熒光強度為縱坐標作圖，即可根據(jù)熒光強度從圖中讀出待測溶液中硝基還原酶的含量。

本發(fā)明的有益效果：在硝基還原酶、還原性輔酶ⅰ的存在下，熒光探針a的水溶液的熒光發(fā)生顯著改變，可用于高選擇性、高靈敏性地檢測硝基還原酶含量或活性。

附圖說明

圖1本發(fā)明提供的熒光探針檢測硝基還原酶的原理示意圖；

圖2實施例1中熒光探針a的合成流程圖；

圖3實施例2中熒光探針a對硝基還原酶響應的吸收光譜變化示意圖；

圖4實施例2中熒光探針a水溶液的熒光光譜(a)和熒光強度(b)隨硝基還原酶濃度的變化示意圖；

圖5實施例3中硝基還原酶催化熒光探針a反應的動力學曲線；

圖6實施例4中熒光探針a的選擇性實驗結果示意圖。

具體實施方式

實施例用于進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實施例。

實施例1(熒光探針a的合成)：

熒光探針a的合成流程如圖2所示。向250ml三口燒瓶中加入n-嗎啉乙胺基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺(0.33g，1mmol)、碳酸鉀(1.00g)、對硝基芐溴(0.43g，2mmol)，真空/氬氣置換3次后，加入150ml無水乙腈，在氬氣保護下升溫至乙腈回流，加熱攪拌4個小時。將反應液減壓蒸發(fā)，所得固體經柱層析純化得目標化合物熒光探針a。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.63(d,j＝8.0hz,2h),8.54(d,j＝8.0hz,1h),8.33(d,j＝8.4hz,2h),7.78–7.72(m,3h),7.10(d,j＝8.0hz,1h),5.49(s,1h),4.34(t,j＝7.0hz,2h),3.70(t,j＝4.2hz,4h),2.73(t,j＝6.8hz,2h),2.63(s,4h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):14.14,22.70,29.71,31.93,37.03,53.77,56.17,66.94,69.46,106.42,115.93,122.55,124.15,126.41,127.86,128.45,131.83,133.14,142.72,148.00,159.0,163.76,164.37.hrms:m/z,calcdforc25h23n3o6,[mh]⁺:462.1665,found462.1661.

實施例2(熒光探針a對硝基還原酶的吸收光譜和發(fā)射光譜響應)：

向含有5μm熒光探針a和還原性輔酶ⅰ(0.5mm)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.2，10mm，助溶劑dmso占總體積的1％)中加入不同體積的硝基還原酶溶液(1mg/ml)。在37℃下反應60min后測量工作液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為445nm。

熒光探針a對硝基還原酶的吸收光譜和發(fā)射光譜響應實驗結果分別如圖3和圖4所示。從 圖3中可以看出，隨加入的硝基還原酶量增加(從0到30μg/ml),溶液體系在445nm處的吸光度逐漸增加，出現(xiàn)了一個新的吸收峰，這個吸收峰是產物b貢獻的。圖4a表明隨加入的硝基還原酶量增加，體系熒光顯著增強，在550nm處出現(xiàn)的新的熒光峰是產物b貢獻的。圖4b給出了探針溶液對不同量的硝基還原酶的熒光響應，縱坐標表示用熒光儀檢測到的550nm波長處的熒光強度，橫坐標表示加入的硝基還原酶的含量；在硝基還原酶的含量為0-3.0μg/ml范圍內，550nm波長處的熒光強度與加入的硝基還原酶濃度存在著線性關系(線性相關系數(shù)為0.9929)。

實施例3(硝基還原酶催化熒光探針a反應的動力學實驗)

向含有硝基還原酶(25μg/ml)和還原性輔酶ⅰ(0.5mm)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.2，10mm)中加入不同濃度的熒光探針a(溶液的最終dmso含量為占總體積5％)，用酶標儀在37℃下每間隔1min測量一次溶液在550nm處的熒光強度，激發(fā)波長為445nm。

另外，在相同條件下配制含有不同已知濃度的分子b(按照文獻合成)的溶液，得到表示分子b在550nm處的熒光強度和濃度的標準曲線。

硝基還原酶催化熒光探針a反應的動力學實驗結果如圖5所示，橫坐標表示反應時間(s)，縱坐標表示550nm處的熒光強度，所加入的熒光探針a的濃度為0μm,0.78μm,1.56μm,3.13μm,4.69μm,6.25μm,12.5μm,18.75μm,25μm。分析實驗結果，通過擬合michaelis-menten方程，可以得到該探針的vmax＝0.017μm/s,km＝43.7μm。

實施例4(熒光探針a對硝基還原酶的選擇性)：

向含有5μm熒光探針a和還原性輔酶ⅰ(0.5mm)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.2，10mm，助溶劑dmso占總體積的1％)中加入各種分析物。在37℃下等待60min后測量工作液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為445nm。

實驗結果如圖6所示，加入還原型谷胱甘肽(1mm，5mm)、維生素c(1mm)、雙氧水(1mm)、次氯酸鈉(100μm)、二硫蘇糖醇(1mm)、高半胱氨酸(1mm)、精氨酸(1mm)、半胱氨酸(1mm)、硫化鈉(1mm，是一種硫化氫供體)、人血清白蛋白(1mg/ml)、氯化鈣(1mm)、氯化鎂(1mm)都不能使得熒光增強，而加入硝基還原酶(10μg/ml)后熒光增長達上百倍，結果表明熒光探針a對硝基還原酶具有十分優(yōu)異的選擇性。