皮爾瑞俄類芽孢桿菌作為土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及皮爾瑞俄類芽孢桿菌作為土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的應(yīng)用?；谠搼?yīng)用，本發(fā)明還提供了一種土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，該土壤生態(tài)改良修復(fù)劑包括皮爾瑞俄類芽孢桿菌、有機質(zhì)和微量元素。本發(fā)明皮爾瑞俄類芽孢桿菌土壤生態(tài)改良劑含有的有益微生物及抗生物質(zhì)可防病、抑菌、抗重茬；含有的多種微生物活性物質(zhì)、酶、有機酸，可有效改善土壤微生態(tài)系統(tǒng)、增強作物抗逆性、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、生態(tài)環(huán)保；添加的純天然有機養(yǎng)分能有效改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，使土壤疏松，打破土壤板結(jié)，通水透氣，提高肥料利用率；添加作物生長所必需的鎂、硼等微量元素，可增強作物抗病、抗旱、抗寒能力。
【專利說明】皮爾瑞俄類芽孢桿菌作為土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及土壤生態(tài)改良技術(shù)，具體涉及皮爾瑞俄類芽孢桿菌作為土壤生態(tài)改良 修復(fù)劑的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤污染引起土壤質(zhì)量惡化，已對食品安全、人類健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成巨 大威脅和挑戰(zhàn)。污染物源主要包括：化肥、農(nóng)藥，城市周邊工業(yè)釋放的有機物、重金屬、放射 性物質(zhì)、病原菌等。修復(fù)土壤污染有必要減少化學農(nóng)藥和化學肥料的使用量，尋找有效的替 代品，促進社會、經(jīng)濟、環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明提供了皮爾瑞俄類芽孢桿菌作為土壤生態(tài)改 良修復(fù)劑的應(yīng)用。
[0004] 優(yōu)選的，所述皮爾瑞俄類芽孢桿菌為皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39,保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5900。
[0005] 本發(fā)明還提供了一種土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，該土壤生態(tài)改良修復(fù)劑包括皮爾瑞俄 類芽孢桿菌、有機質(zhì)和微量元素。
[0006] 所述有機質(zhì)為動物腐殖質(zhì)和植物腐殖質(zhì)中的一種或兩種的混合物。
[0007] 所述微量元素為Fe、Mn、B、Zn和Mo中的一種或兩種以上。
[0008] 本發(fā)明還提供了上述土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的使用方法，于作物生育前期按30? 50Kg/畝均勻播撒或穴施在種植田中，隨后翻耕或覆土。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的制備方法，該制備方法包括：對皮爾 瑞俄類芽孢桿菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)后獲皮爾瑞俄類芽孢桿菌，再將皮爾瑞俄類芽孢桿菌與有 機質(zhì)和微量元素復(fù)配得土壤生態(tài)改良修復(fù)劑。
[0010] 所述發(fā)酵培養(yǎng)包括：
[0011] ⑴對活化后的皮爾瑞俄類芽孢桿菌種進行兩級種子發(fā)酵培養(yǎng)，得到種子發(fā)酵菌 液，且第二級種子發(fā)酵培養(yǎng)的初始發(fā)酵菌液為第一級種子發(fā)酵培養(yǎng)后得到的發(fā)酵菌液；
[0012] (2)以種子發(fā)酵菌液為初始發(fā)酵菌液進行生產(chǎn)擴大培養(yǎng)得到皮爾瑞俄類芽孢桿 菌。
[0013] 所述第一級種子發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%， pH為6?10 ;
[0014] 第二級種子發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅30g/L，葡萄糖20g/L，NaC15g/ L，MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· lg/L，培養(yǎng) pH 為 6 ?8 ;
[0015] 所述生產(chǎn)擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅30g/L，地瓜粉5g/L，怡糖25g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· lg/L，培養(yǎng) pH 為 6 ?8。
[0016] 所述復(fù)配包括：將皮爾瑞爾類芽孢桿菌與有機質(zhì)及微量元素經(jīng)粉碎、混合、造粒、 烘干后得土壤生態(tài)改良修復(fù)劑。
[0017] 本發(fā)明皮爾瑞俄類芽孢桿菌土壤生態(tài)改良劑含有的有益微生物及抗生物質(zhì)可防 病、抑菌、抗重茬；含有的多種微生物活性物質(zhì)、酶、有機酸，可有效改善土壤微生態(tài)系統(tǒng)、增 強作物抗逆性、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、生態(tài)環(huán)保；添加的純天然有機養(yǎng)分能有效改善土壤團 粒結(jié)構(gòu)，使土壤疏松，打破土壤板結(jié)，通水透氣，提高肥料利用率；添加作物生長所必需的 鎂、硼等微量元素，可增強作物抗病、抗旱、抗寒能力。
[0018] 本發(fā)明采用生物發(fā)酵工藝，在高濃度純培養(yǎng)有益微生物后進行助劑配伍加工，生 產(chǎn)出微生物土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，營養(yǎng)全面、肥效持久、綠色環(huán)保、無污染、能有效改善土壤 微生物環(huán)境，提高肥料利用率，以菌抑菌，抗重茬，減少作物病蟲害，長期使用效果更佳。

【具體實施方式】
[0019] 解決土壤污染最經(jīng)濟、最安全的途徑是采用微生物修復(fù)技術(shù)，即利用有益微生物 (土著菌、外來菌、基因工程菌）對污染物的代謝作用將其快速降解和轉(zhuǎn)化成無害物質(zhì)，使 土壤恢復(fù)其天然功能，作用方式是通過改變各種環(huán)境條件如：營養(yǎng)、氧化還原電位、共代謝 基質(zhì)，強化微生物降解作用等。
[0020] 有益微生物以其與有害菌競爭營養(yǎng)和空間位點、拮抗作用、溶菌作用、誘導植物抗 性、促生作用等達到防病、抑菌、抗重茬，同時對根際土壤有明顯改良作用，促進土壤中各種 養(yǎng)分的有效化，增加速效養(yǎng)分的含量，改善土壤微生態(tài)環(huán)境等。解除土壤農(nóng)藥殘留污染最有 效途徑是利用土壤微生物降解作用，一是因為微生物的最終降解產(chǎn)物為H 2O和0)2等，二是 因為微生物具有代謝多樣性，可降解幾乎所有有機污染物。目前發(fā)現(xiàn)可利用的有益微生物 主要包括：假單胞菌屬、產(chǎn)氫單胞菌、黃桿菌屬、紅酵母屬、放線菌類細菌、芽孢桿菌類細菌 等50多種。
[0021] 芽孢桿菌具有分布廣、生長快、易分離培養(yǎng)、營養(yǎng)簡單、無毒無害、耐熱抗逆等特 點，已成為微生物菌劑研發(fā)重點。皮爾瑞俄類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae)是在 土壤中發(fā)現(xiàn)的具有詰抗作用的細菌，最初定名皮爾瑞俄芽孢桿菌（Bacillus peoriae) (Montefusco et al.(美國），1993)，重新定名為皮爾瑞俄類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae) (Heyndrickx et al.(英國），1996 年）。
[0022] 皮爾瑞俄類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，水解酶類如幾丁質(zhì)酶，纖維素酶；多肽 類抗生素，一種具有抗細菌活性屬于多粘菌素；黏菌素一環(huán)桿菌素家族，包括如含有二氨基 丁酸結(jié)構(gòu)的polypeptim、jolipeptin、gavascrin和saravalin等，另一種具有抗真菌和放 線菌活性包括gatavalin和thsaricidim。這些物質(zhì)可起到預(yù)防植物病害和抑制植物病原 菌作用，以菌抑菌，抗重茬，最大限度的減輕真菌、細菌和病毒性病害的發(fā)生，用作生物肥料 能夠在作物根際或體內(nèi)定殖，能有效改善土壤微生態(tài)系統(tǒng)，起到特定肥料效應(yīng)；還可分泌植 物激素、植物生長素、細胞分裂素促進植物生長。
[0023] 本發(fā)明提供一種微生物土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，可以通過皮爾瑞俄類芽孢桿菌三級 培養(yǎng)、發(fā)酵，獲得高質(zhì)量菌液，并與有機質(zhì)、微量元素制劑化成土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，達到高 效抑制病原菌、防病、抗重茬作用。
[0024] 本發(fā)明的微生物土壤生態(tài)改良修復(fù)劑可由皮爾瑞俄類芽孢桿菌的發(fā)酵菌液及 有機質(zhì)、微量元素制劑化而成，各組分的重量百分比可選擇：皮爾瑞俄類芽孢桿菌36%? 41 %、有機質(zhì)53%?58%，微量元素6%。最終有效活菌數(shù)彡0.8億/克，水分蘭20%，pH =5.0?8.0,細度彡80目。
[0025] 本發(fā)明所述的皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保 藏，保藏日期為2012年3月15日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏編號：CGMCC No. 5900。
[0026] 本發(fā)明的菌種活化為皮爾瑞俄類芽孢桿菌的常規(guī)菌種活化方法，可選用將保藏的 基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將裝有培 養(yǎng)基的三角瓶在121°C條件下滅菌30min，接種量為1. 5?5%，優(yōu)選2%，培養(yǎng)溫度為30? 36°C，光照強度為3500?4500勒克斯，培養(yǎng)時間為5?8天；配成孢子液用于種子罐接種。
[0027] 本發(fā)明的種子發(fā)酵為二級種子發(fā)酵培養(yǎng)，可選用先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng) 基后再滅菌，冷卻至30°C，將孢子液按5?10 %接入培養(yǎng)液中，優(yōu)選8 %，通入無菌氧氣培 養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌；將二級種子種子罐在121°C下滅菌30min，裝入培養(yǎng)基后再滅 菌，冷卻至30°C，將一級種子罐發(fā)酵液按5?10%接種量接二級種子罐，優(yōu)選8%，通入無菌 氧氣，攪拌培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液。
[0028] 本發(fā)明的生產(chǎn)擴大培養(yǎng)可在生產(chǎn)發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)。可選用先將發(fā)酵罐滅菌，裝 入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫到30°C，按5?10%的接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵 罐中培養(yǎng)，優(yōu)選8%，通入無菌空氣，攪拌培養(yǎng)，可得生產(chǎn)用皮爾瑞爾類芽孢桿菌菌液。
[0029] 本發(fā)明制劑的復(fù)配可由皮爾瑞俄類芽孢桿菌的發(fā)酵菌液、有機質(zhì)、Fe、Mn、B、Zn、Mo 等微量元素經(jīng)粉碎、混合攪拌、造粒、烘干、冷卻、篩分，制劑化而成。
[0030] 本發(fā)明的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑使用方法是于作物生育前期按30?50Kg/畝均勻 播撒或穴施在種植田中，隨后翻耕或覆土，可用作基肥、追肥，連年使用可控制重要病害，增 強抗逆性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0031] 實施例1 :
[0032] 該實施例為土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的制備：
[0033] 選用菌種：取自楊凌綠都生物科技有限公司菌種庫的皮爾瑞俄類芽孢桿菌，優(yōu)選 基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39。
[0034] 以下分別為皮爾瑞俄類芽孢桿菌的培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0035] 第一級種子發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，pH為 7. 2。
[0036] 第二級種子發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅30g/L，工業(yè)葡萄糖20g/L，NaCl 5g/L, MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· lg/L，pH 為 6. 9。
[0037] 生產(chǎn)擴大培養(yǎng)的配方：黃豆餅30g/L，地瓜粉5g/L，怡糖25g/L，NaCl 5g/L， MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· lg/L，pH 為 6· 7。
[0038] 制備流程如下：
[0039] (1)菌種活化
[0040] 將保藏的基因重組皮爾瑞俄類芽孢桿菌BC39劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面 上，接種前將裝有培養(yǎng)基的三角瓶在121°C條件下滅菌30min，按接種量2%接種，培養(yǎng)溫度 為33°C，光照強度為4000勒克斯，培養(yǎng)時間為6天；配成孢子液用于種子罐接種。
[0041] (2)種子罐發(fā)酵
[0042] 先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C，將孢子液按8%接入 培養(yǎng)液中，通入無菌氧氣培養(yǎng)，攪拌培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌；將二級種子種子罐在 121°0下滅菌3〇11^11，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°0，將孢子液按8%接入培養(yǎng)液中，通 入無菌氧氣，攪拌培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液。
[0043] (3)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0044] 先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫到30°C，按8%的接種量將二級 種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通入無菌空氣，攪拌培養(yǎng)，可得生產(chǎn)用皮爾瑞爾類芽孢 桿菌菌液。
[0045] 過程中的滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121°C，壓力0· 3?0· 5kg/cm2條件下滅菌 30min。一級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持1:0. 5,機械攪拌270rpm， 30°C恒溫培養(yǎng)24h ;二級種子罐培養(yǎng)條件，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持1:0. 5,機械攪 拌220rpm，30°C恒溫培養(yǎng)24h ;發(fā)酵罐接種后，氧氣通氣量與發(fā)酵液體積比保持1:0. 5,機械 攪拌140rpm，30°C恒溫培養(yǎng)65h。
[0046] (4)制劑配制
[0047] 將步驟⑶得到微生物菌液原料，再加入有機質(zhì)，硫酸鐵、硫酸錳、硼酸、硫酸鋅和 鉬酸銨，經(jīng)粉碎、混合攪拌、造粒、烘干、冷卻、篩分等程序制劑化得土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，各 組分的體積百分比為：皮爾瑞俄類芽孢桿菌38 %、有機質(zhì)56 %，微量元素6 %。最終有效活 菌數(shù)=I. 1億/克，水分18%，pH = 6. 6,細度彡80目。
[0048] 實施例2 ：
[0049] 該實施例為利用實施例1制得的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑防治小麥全蝕?。?br> [0050] 試驗地設(shè)在西北農(nóng)林科技大學附近試驗田，連續(xù)種植小麥10年以上，目前小麥全 蝕病發(fā)生處于上升態(tài)勢，小麥長勢不好，白株死苗率嚴重。
[0051] 試驗設(shè)置施用皮爾瑞俄芽孢桿菌土壤生態(tài)改良修復(fù)劑40千克/畝處理，施用枯草 芽孢桿菌復(fù)合微生物菌肥40千克/畝處理，不施任何土壤修復(fù)劑對照3個處理，3次重復(fù)， 每一小區(qū)50m 2。
[0052] 播種前按試驗設(shè)計在小區(qū)內(nèi)均勻撒施皮爾瑞俄類芽孢桿菌土壤生態(tài)改良修復(fù)劑、 枯草芽孢桿菌復(fù)合微生物菌肥，撒施后隨播種蓋土。按照常規(guī)方法進行田間管理，發(fā)病盛期 調(diào)查小麥全蝕病病病情指數(shù)，計算防治效果，收貨時測產(chǎn)，結(jié)果見表1 :
[0053] 表1皮爾瑞俄芽孢桿菌土壤生態(tài)改良修復(fù)劑與常規(guī)菌肥防治小麥全蝕病效果對 比
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 皮爾瑞俄類芽孢桿菌作為土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述皮爾瑞俄類芽孢桿菌為皮爾瑞俄類芽 孢桿菌BC39,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5900〇
3. -種土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，其特征在于，該土壤生態(tài)改良修復(fù)劑包括皮爾瑞俄類芽 孢桿菌、有機質(zhì)和微量元素。
4. 如權(quán)利要求3所述的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，其特征在于，所述有機質(zhì)為動物腐殖質(zhì) 和植物腐殖質(zhì)中的一種或兩種的混合物。
5. 如權(quán)利要求3所述的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑，其特征在于，所述微量元素為Fe、Mn、B、 Zn和Mo中的一種或兩種以上。
6. 權(quán)利要求3所述土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的使用方法，其特征在于，于作物生育前期按 30?50Kg/畝均勻播撒或穴施在種植田中，隨后翻耕或覆土。
7. -種土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的制備方法，其特征在于，該制備方法包括：對皮爾瑞俄 類芽孢桿菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)后獲皮爾瑞俄類芽孢桿菌，再將皮爾瑞俄類芽孢桿菌與有機質(zhì) 和微量元素復(fù)配得土壤生態(tài)改良修復(fù)劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng) 包括： (1) 對活化后的皮爾瑞俄類芽孢桿菌種進行兩級種子發(fā)酵培養(yǎng)，得到種子發(fā)酵菌液，且 第二級種子發(fā)酵培養(yǎng)的初始發(fā)酵菌液為第一級種子發(fā)酵培養(yǎng)后得到的發(fā)酵菌液； (2) 以種子發(fā)酵菌液為初始發(fā)酵菌液進行生產(chǎn)擴大培養(yǎng)得到皮爾瑞俄類芽孢桿菌。
9. 如權(quán)利要求7所述的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的制備方法，其特征在于： 所述第一級種子發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：酵母膏1 %、蛋白胨2 %、葡萄糖2 %，pH為 6 ?10 ; 所述第二級種子發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅30g/L，葡萄糖20g/L，NaCl 5g/ L，MgS04 ? 7H20 0? lg/L，K2HP040. lg/L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? lg/L，pH 為 6 ?8 ; 所述生產(chǎn)擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：黃豆餅30g/L，地瓜粉5g/L，怡糖25g/L，NaCl 5g/ L，MgS04 ? 7H20 0? lg/L，K2HP040. lg/L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? lg/L，pH 為 6 ?8。
10. 如權(quán)利要求7所述的土壤生態(tài)改良修復(fù)劑的制備方法，其特征在于，所述復(fù)配包 括：將皮爾瑞爾類芽孢桿菌與有機質(zhì)及微量元素經(jīng)粉碎、混合、造粒、烘干后得土壤生態(tài)改 良修復(fù)劑。
【文檔編號】C09K17/00GK104498041SQ201410629067
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】楊軒, 楊長鎖, 謝咸升, 付強, 安天賜, 田佳, 安德榮 申請人:楊凌綠都生物科技有限公司