胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法。本發(fā)明是通過熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈將硅納米線和熒光團(tuán)共價(jià)連接在一起構(gòu)建而成胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器可用于含有胰蛋白酶的溶液體系中的胰蛋白酶的檢測。當(dāng)檢測體系中不存在胰蛋白酶時(shí)，硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移使熒光團(tuán)的熒光猝滅；當(dāng)檢測體系中有胰蛋白酶存在時(shí)，由于胰蛋白酶的加入切斷了肽鏈，改變了硅納米線與熒光團(tuán)之間的距離，抑制了硅納米線與熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移，使檢測體系中的熒光恢復(fù)。根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測體系中是否含胰蛋白酶的檢測。
【專利說明】胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米結(jié)構(gòu)的熒光化學(xué)傳感器領(lǐng)域，特別涉及基于硅納米線與其表面熒 光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 硅納米線作為一種重要的一維半導(dǎo)體納米材料，具有穩(wěn)定性高、生物兼容 性好、表面易修飾、與現(xiàn)有硅技術(shù)相兼容等特點(diǎn)，使其在傳感器方面有廣泛的應(yīng)用。 2001年，Lieber等人在Science上首次報(bào)道了基于娃納米線的pH和|丐離子電化學(xué) 傳感器，通過電導(dǎo)率的改變進(jìn)行pH和生物分子的識(shí)別（Y. Cui，QQ Wei，H Park，CM Lieber，Science，2001，293, 1289)。之后，科學(xué)家發(fā)展了基于硅納米線的DNA、糖類、蛋白質(zhì)、 病毒等電化學(xué)傳感器。考慮到光化學(xué)傳感器與電化學(xué)傳感器相比具有：不受電磁干擾，可以 通過光纖遠(yuǎn)距離傳輸、單細(xì)胞檢測不需要參比電極等特點(diǎn)。2008年，Shi等人在NanoLett 上首次報(bào)道了基于硅納米線的熒光化學(xué)銅離子傳感器。該傳感器與沒有硅納米線的傳感分 子相比，靈敏度大大提高（LX Mu, WS Shi, JC Chang，ST Lee, NanoLett, 2008, 8, 104)。之后， 研究人員又發(fā)展了基于硅納米線的熒光pH、堿性磷酸酶、NO、超氧化物歧化酶等傳感器并將 其用在細(xì)胞凋亡過程中釋放S0D的實(shí)時(shí)原位檢測。這些工作顯示了硅納米線熒光傳感器與 有機(jī)小分子相比，在傳感器的選擇性和靈敏度方面有所改善，尤其是可以通過將單根硅納 米線傳感器插入細(xì)胞特定部位進(jìn)行檢測，在亞細(xì)胞器檢測方面有明顯優(yōu)勢(shì)。然而，這些硅納 米線熒光傳感器都是基于硅納米線表面的氧化層進(jìn)行修飾，以硅納米線為基底，沒有利用 硅納米線本身的性質(zhì)。近年來，碳納米管、石墨烯、納米金被發(fā)現(xiàn)能夠有效地猝滅熒光，并廣 泛用于能量轉(zhuǎn)移的熒光傳感器中，表現(xiàn)出了很好的傳感性能。而在硅光伏器件研究中，通常 利用硅納米線與量子點(diǎn)之間的能量轉(zhuǎn)移來提高光電轉(zhuǎn)化效率，將這種能量轉(zhuǎn)移用于硅納米 線傳感器中，對(duì)發(fā)展新型硅納米線傳感器和提高硅納米線傳感器的性能具有重要意義。因 此，本發(fā)明以胰蛋白酶為檢測模型，通過肽鏈將硅納米線和熒光團(tuán)共價(jià)鏈接起來，改變熒光 團(tuán)和硅納米線之間的距離，研究二者之間的能量轉(zhuǎn)移，并將其用于胰蛋白酶的檢測，為硅納 米線蛋白酶熒光傳感器提供了新的機(jī)理和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的主要目的是提供一種基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰 蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的制備方法，并且利用該胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器對(duì)含有胰蛋白酶 的溶液體系中的胰蛋白酶進(jìn)行檢測。
[0004] 本發(fā)明的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感 器的制備方法包括以下步驟：
[0005] 1)室溫下，將硅納米線浸泡在質(zhì)量濃度為1%?5%的氫氟酸水溶液中（一般浸 泡的時(shí)間為30秒?5分鐘），取出硅納米線并用去離子水清洗干凈，得到表面具有Si-H鍵 的硅納米線；將得到的表面具有Si-H鍵的硅納米線浸泡于除氧的0. 025?lg/mL叔丁氧基 N-氨基甲酸丙烯的無水乙醇或無水甲醇溶液中，在500W的汞燈下光照1?6小時(shí)，收集硅 納米線，反復(fù)用有機(jī)溶劑清洗后浸泡于三氟乙酸：甲醇的體積比為1:1?1:8的三氟乙酸甲 醇溶液中1?4小時(shí)，得到表面修飾有氨基的硅納米線，收集并用有機(jī)溶劑反復(fù)清洗；
[0006] 2)將步驟1)清洗后得到的表面修飾有氨基的硅納米線浸泡于濃度為0. 01?1M 的對(duì)苯二異硫氰酸酯的乙醇溶液中，在溫度為30?50°C下浸泡30分鐘?2小時(shí)后，得到表 面修飾有異硫氰酸根的硅納米線，收集并用有機(jī)溶劑反復(fù)清洗；
[0007] 3)將步驟2)清洗后得到的表面修飾有異硫氰酸根的硅納米線浸泡于濃度為 0. 5?1. 5mol/L的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈的N，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液 中，并按照每20mL熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入10? 60 μ L的N，N-二異丙基乙胺加入N，N-二異丙基乙胺，室溫下攪拌10?24小時(shí)后，用有機(jī) 溶劑反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈，得到基于硅納米線與 其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。
[0008] 所述的硅納米線是由化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為10?15nm的硅納米線或 由化學(xué)刻蝕法制備得到的直徑為200?400nm，長度為15?20 μ m的硅納米線。
[0009] 所述的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)或丙酮。
[0010] 所述的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的熒光團(tuán)可以是熒光素或其它發(fā)射 波長的熒光團(tuán)如羅丹明、花青類等。
[0011] 所述的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈可以是含有胰蛋白酶選擇性 作用位點(diǎn)的不同長度的肽鏈，如N-GCGPLGVRGK-amidation或N-RGK-amidation。
[0012] 所述的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈優(yōu)選是N-FITC-GCGPLGVRGK-amidation 或 N-FITC-RGK-amidation。
[0013] 本發(fā)明中所述的化學(xué)氣相沉積法制備硅納米線的方法可是：室溫下，將一氧化硅 經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，系統(tǒng)先用機(jī)械泵和分子泵對(duì)石英 管抽真空至l(T 3Pa，隨后以20?50sccm(mL/min)的流速通入氦氣（占混合氣體的體積 95% )與氫氣（占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當(dāng)壓力穩(wěn)定在700?lOOOPa時(shí)，系統(tǒng) 開始升溫；系統(tǒng)以10?20°C /min升至300°C，再以10?20°C /min升溫至800°C，此時(shí)關(guān) 閉氣閥和泵閘，保溫10?30分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，在1350°C下反應(yīng)（一般反應(yīng)時(shí)間 為3?7小時(shí)），反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線。
[0014] 本發(fā)明中所述的化學(xué)刻蝕法制備硅納米線的方法可是：取不同尺寸的n(100)硅 片，依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲清洗（一般超聲清洗的時(shí)間為10?30分鐘），將清 洗后的硅片置于含有濃度為3?8mmol/L的AgN0 3和2?7mol/L的HF的混合水溶液中進(jìn) 行浸泡（一般浸泡的時(shí)間為5?10分鐘），將硅片取出后浸入含有濃度為2?7mol/L的 HF和0. 05?0. 4mol/L的H202的混合水溶液中，體系由溫度為40?60°C的水浴保溫，15? 45分鐘后取出硅片，放入濃鹽酸（質(zhì)量濃度為36% ):濃硝酸（質(zhì)量濃度為36% )的體積 比為3 :1的混合液中，浸泡0. 5?2. 5小時(shí)后取出硅片，用蒸餾水沖洗后自然晾干，得到由 硅納米線構(gòu)成的硅納米線陣列；超聲使硅納米線從基底上脫落，離心收集硅納米線。
[0015] 本發(fā)明的制備方法得到的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白 酶熒光化學(xué)傳感器，是通過熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈將硅納米線和熒光 團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的熒光團(tuán)共價(jià)連接在一起構(gòu)建而成的胰蛋白酶熒光化學(xué) 傳感器。該胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器是以硅納米線作為能量轉(zhuǎn)移的受體，利用硅納米線與 其表面熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生或抑制使熒光團(tuán)的熒光猝滅或恢復(fù)；當(dāng)檢測體系中不 存在胰蛋白酶時(shí)，硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移使熒光團(tuán)的熒光猝滅；當(dāng)檢測 體系中有胰蛋白酶存在時(shí)，由于胰蛋白酶的加入切斷了肽鏈，改變了硅納米線與熒光團(tuán)之 間的距離，抑制了硅納米線與熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移，使檢測體系中的熒光恢復(fù)。根據(jù)熒光 強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測體系中是否含胰蛋白酶的檢測。
[0016] 本發(fā)明的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感 器可用于含有胰蛋白酶的溶液體系中的胰蛋白酶的檢測。在有胰蛋白酶存在的溶液體系 中，所述的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器會(huì)產(chǎn)生熒光增強(qiáng)，通過繪制已知胰蛋白酶的濃度和熒 光特征峰相對(duì)強(qiáng)度的定標(biāo)曲線，并與待檢測的溶液體系中的由所述的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳 感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強(qiáng)進(jìn)行比較，確定檢測的溶液體系中的胰蛋白酶的濃 度。
[0017] 本發(fā)明的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感 器在用于含有胰蛋白酶的溶液體系中的胰蛋白酶檢測時(shí)，所述的有胰蛋白酶存在的溶液體 系，是將胰蛋白酶的溶液直接加入到含有本發(fā)明的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量 轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的溶液中，在37°c下作用，之后再進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測試， 用熒光光譜儀進(jìn)行檢測。所用的激發(fā)光源為氙燈（最大激發(fā)波長為489nm)，本發(fā)明的基 于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的最大發(fā)射波長為 520nm〇
[0018] 本發(fā)明的制備方法得到的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白 酶熒光化學(xué)傳感器為硅納米線傳感器的研究提供了新的機(jī)理，同時(shí)也為基于硅納米線與 表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的蛋白酶檢測提供了新機(jī)理，為蛋白酶的檢測提供了一種新的方 法。在單細(xì)胞蛋白酶檢測方面有廣泛的應(yīng)用前景。
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1.本發(fā)明實(shí)施例1?4的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋 白酶熒光化學(xué)傳感器對(duì)胰蛋白酶的響應(yīng)機(jī)理示意圖。
[0021] 圖2.發(fā)明實(shí)施例1中，基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒 光化學(xué)傳感器的熒光強(qiáng)度隨胰蛋白酶（質(zhì)量比2. 5%的胰蛋白酶）加入量和時(shí)間的變化。
[0022] 圖3.本發(fā)明實(shí)施例2中，基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶 突光化學(xué)傳感器在加入不同酶時(shí)的相對(duì)突光強(qiáng)度。
[0023] 圖4.本發(fā)明實(shí)施例3中，不同濃度的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移 的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器對(duì)胰蛋白酶的滴定曲線。
[0024] 圖5.本發(fā)明實(shí)施例4中，基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶 熒光化學(xué)傳感器的結(jié)構(gòu)及制備過程示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 1)室溫下，將用化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為10?15nm的硅納米線浸泡在 質(zhì)量濃度為15%的氫氟酸水溶液中30秒，取出硅納米線并用去離子水清洗干凈，得到表面 具有Si-H鍵的娃納米線；將得到的表面具有Si-H鍵的娃納米線浸泡于除氧lg/mL叔丁氧 基N-氨基甲酸丙烯的無水乙醇溶液中，在500W的汞燈下光照6小時(shí)，收集硅納米線，反復(fù) 用乙醇清洗后浸泡于三氟乙酸：甲醇的體積比為1:4的三氟乙酸甲醇溶液中4小時(shí)，得到表 面修飾有氨基的硅納米線，收集并用甲醇反復(fù)清洗；
[0027] 2)將步驟1)清洗后得到的表面修飾有氨基的硅納米線浸泡于濃度為0. 01M的對(duì) 苯二異硫氰酸酯的乙醇溶液中，在40°C下浸泡2小時(shí)后，得到表面修飾有異硫氰酸根的硅 納米線，收集并用乙醇反復(fù)清洗；
[0028] 3)將步驟2)清洗后得到的表面修飾有異硫氰酸根的硅納米線浸泡于濃度為 1. 5mol/L的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈（N-FITC-GCGPLGVRGK-amidation，購于上 海淘普生物科技有限公司）的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，并按照每20mL熒光團(tuán)標(biāo)記的胰 蛋白酶選擇性肽鏈的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入40 μ L的N，N-二異丙基乙胺加入N，N-二 異丙基乙胺，室溫下攪拌24小時(shí)后，用DMF反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋 白酶選擇性肽鏈，得到基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳 感器。
[0029] 所得基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器是 通過熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈將硅納米線和熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選 擇性肽鏈中的熒光團(tuán)共價(jià)連接在一起構(gòu)建而成的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。基于硅納米 線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器對(duì)胰蛋白酶的響應(yīng)機(jī)理如圖 1所示。將基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器分散 在ρΗ8. 0的PBS緩沖液中，得到20 μ g/mL的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移 的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的懸濁液。從圖2可以看出，每隔5分鐘加入不同量（10μ1、 1〇 μ 1、1〇μ 1、1〇μ 1、4〇μ 1)的質(zhì)量比2. 5%的胰蛋白酶到基于硅納米線與其表面熒光團(tuán) 之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的lmL懸濁液中，用熒光光譜儀測熒光（激發(fā)波 長489nm)，結(jié)果顯示基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感 器的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 1)室溫下，將用化學(xué)刻蝕法制備得到的直徑為200?300nm的硅納米線浸泡在質(zhì) 量濃度為5%的氫氟酸水溶液中5分鐘，取出硅納米線并用去離子水清洗干凈，得到表面具 有Si-H鍵的硅納米線；將得到的表面具有Si-H鍵的硅納米線浸泡于除氧0. 025g/mL叔丁 氧基N-氨基甲酸丙烯的無水甲醇溶液中，在500W的汞燈下光照4小時(shí)，收集硅納米線，反 復(fù)用乙醇清洗后浸泡于三氟乙酸：甲醇的體積比為1:8的三氟乙酸甲醇溶液中1小時(shí)，得到 表面修飾有氨基的硅納米線，收集并用甲醇反復(fù)清洗；
[0032] 2)將步驟1)清洗后得到的表面修飾有氨基的硅納米線浸泡于濃度為1M的對(duì)苯二 異硫氰酸酯的乙醇溶液中，在50°C下浸泡30分鐘后，得到表面修飾有異硫氰酸根的硅納米 線，收集并用乙醇反復(fù)清洗；
[0033] 3)將步驟2)清洗后得到的表面修飾有異硫氰酸根的硅納米線浸泡于濃度為 0· 5mol/L的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈（N-FITC-GCGPLGVRGK-amidation，購于上 海淘普生物科技有限公司）的DMF溶液中，并按照每20mL熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽 鏈的DMF溶液加入10 μ L的N，N-二異丙基乙胺加入N，N-二異丙基乙胺，室溫下攪拌10小 時(shí)后，用DMF反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈，得到基于硅 納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。
[0034] 所得基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器是 通過熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈將硅納米線和熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選 擇性肽鏈中的熒光團(tuán)共價(jià)連接在一起構(gòu)建而成的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器?；诠杓{米 線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器對(duì)胰蛋白酶的響應(yīng)機(jī)理如圖1 所示。將基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器分散在 ρΗ8. 0的PBS緩沖液中，得到20 μ g/mL的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰 蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的懸濁液。分別取lmL基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移 的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的懸濁液，并分別加入不同的酶（〇. 48mg/ml胰蛋白酶、2. 7 μ Μ 凝血酶、2. 4mg/ml胃蛋白酶、1. 4mg/ml溶解酵素、1. 56mg/ml堿性磷酸酶），在突光光譜儀上 測熒光（激發(fā)波長489納米），基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光 化學(xué)傳感器相對(duì)熒光強(qiáng)度如圖3所示。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 1)室溫下，將用化學(xué)刻蝕法制備得到的直徑250?400nm的硅納米線浸泡在質(zhì)量 濃度為4%的氫氟酸水溶液中2分鐘，取出硅納米線并用去離子水清洗干凈，得到表面具有 Si-H鍵的硅納米線；將得到的表面具有Si-H鍵的硅納米線浸泡于除氧05g/mL叔丁氧基 N-氨基甲酸丙烯的無水甲醇溶液中，在500W的汞燈下光照5小時(shí)，收集硅納米線，反復(fù)用乙 醇清洗后浸泡于三氟乙酸：甲醇的體積比為1:1的三氟乙酸甲醇溶液中3小時(shí)，得到表面修 飾有氨基的硅納米線，收集并用甲醇反復(fù)清洗；
[0037] 2)將步驟1)清洗后得到的表面修飾有氨基的硅納米線浸泡于濃度為0. 05M的對(duì) 苯二異硫氰酸酯的乙醇溶液中，在30°C下浸泡2小時(shí)后，得到表面修飾有異硫氰酸根的硅 納米線，收集并用乙醇反復(fù)清洗；
[0038] 3)將步驟2)清洗后得到的表面修飾有異硫氰酸根的硅納米線浸泡于濃度為 1. 5mol/L的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈（N-FITC-RGK-amidation，購于上海淘普生 物科技有限公司）的DMF溶液中，并按照每20mL熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈的DMF 溶液加入60 μ L的N，N-二異丙基乙胺加入N，N-二異丙基乙胺，室溫下攪拌12小時(shí)后，用 DMF反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈，得到基于硅納米線與 其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。
[0039] 所得基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器是 通過熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈將硅納米線和熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選 擇性肽鏈中的熒光團(tuán)共價(jià)連接在一起構(gòu)建而成的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。基于硅納米 線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器對(duì)胰蛋白酶的響應(yīng)機(jī)理如圖1 所示。將基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器分散在 ρΗ8. 0的PBS緩沖液中，得到濃度分別為20 μ g/mL、5 μ g/mL、2 μ g/mL的基于硅納米線與其 表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的懸濁液。分別取濃度為20 μ g/mL、 5 μ g/mL、2 μ g/mL的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感 器的懸濁液各lmL，加入不同濃度的胰蛋白酶，在熒光光譜儀上測熒光（激發(fā)波長489納 米），得到基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的相對(duì) 熒光強(qiáng)度。通過繪制已知胰蛋白酶的濃度和熒光特征峰（520nm)相對(duì)強(qiáng)度的定標(biāo)曲線（如 圖4所示），并與待檢測的溶液體系中的由所述的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光 特征峰的熒光增強(qiáng)進(jìn)行比較，確定檢測的溶液體系中的胰蛋白酶的濃度。
[0040] 實(shí)施例4
[0041] 1)室溫下，將用化學(xué)氣相沉積法制備得到的直徑為10?15nm的硅納米線浸泡在 質(zhì)量濃度為3%的氫氟酸水溶液中2分鐘，取出硅納米線并用去離子水清洗干凈，得到表面 具有Si-H鍵的硅納米線；將得到的表面具有Si-H鍵的硅納米線浸泡于除氧0. 5g/mL叔丁 氧基N-氨基甲酸丙烯的無水乙醇溶液中，在500W的汞燈下光照1小時(shí)，收集硅納米線，反 復(fù)用乙醇清洗后浸泡于三氟乙酸：甲醇的體積比為1:5的三氟乙酸甲醇溶液中2小時(shí)，得到 表面修飾有氨基的硅納米線，收集并用甲醇反復(fù)清洗；
[0042] 2)將步驟1)清洗后得到的表面修飾有氨基的硅納米線浸泡于濃度為0. 05M的對(duì) 苯二異硫氰酸酯的乙醇溶液中，在45°C下浸泡1小時(shí)后，得到表面修飾有異硫氰酸根的硅 納米線，收集并用乙醇反復(fù)清洗；
[0043] 3)將步驟2)清洗后得到的表面修飾有異硫氰酸根的硅納米線浸泡于濃度為 lmol/L的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈（N-FITC-RGK-amidation，購于上海淘普生物 科技有限公司）的DMF溶液中，并按照每20mL熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈的DMF溶 液加入20 μ L的N，N-二異丙基乙胺加入N，N-二異丙基乙胺，室溫下攪拌18小時(shí)后，用DMF 反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈，得到基于硅納米線與其表 面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。
[0044] 本實(shí)施例中基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳 感器的制備過程如圖5所示。基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光 化學(xué)傳感器對(duì)胰蛋白酶的響應(yīng)機(jī)理如圖1所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器的制 備方法，其特征是，所述的制備方法包括以下步驟： 1) 室溫下，將硅納米線浸泡在質(zhì)量濃度為1%?5%的氫氟酸水溶液中，取出硅納米線 并用去離子水清洗干凈，得到表面具有Si-H鍵的硅納米線；將得到的表面具有Si-H鍵的硅 納米線浸泡于除氧的〇. 025?lg/mL叔丁氧基N-氨基甲酸丙烯的無水乙醇或無水甲醇溶 液中，在500W的汞燈下光照1?6小時(shí)，收集硅納米線，反復(fù)用有機(jī)溶劑清洗后浸泡于三氟 乙酸：甲醇的體積比為1:1?1:8的三氟乙酸甲醇溶液中1?4小時(shí)，得到表面修飾有氨基 的硅納米線，收集并用有機(jī)溶劑反復(fù)清洗； 2) 將步驟1)清洗后得到的表面修飾有氨基的硅納米線浸泡于濃度為0. 01?1M的對(duì) 苯二異硫氰酸酯的乙醇溶液中，在溫度為30?50°C下浸泡30分鐘?2小時(shí)后，得到表面修 飾有異硫氰酸根的硅納米線，收集并用有機(jī)溶劑反復(fù)清洗； 3) 將步驟2)清洗后得到的表面修飾有異硫氰酸根的硅納米線浸泡于濃度為0. 5? 1. 5mol/L的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，并按照每 20mL熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入10?60μ L的 Ν，Ν-二異丙基乙胺加入Ν，Ν-二異丙基乙胺，室溫下攪拌10?24小時(shí)后，用有機(jī)溶劑反復(fù) 超聲清洗除去未反應(yīng)的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈，得到基于硅納米線與其表面熒 光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟1)所述的將硅納米線浸泡在質(zhì)量 濃度為1 %?5%的氫氟酸水溶液中，其浸泡的時(shí)間為30秒?5分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述的硅納米線是由化學(xué)氣相沉積法 制備得到的直徑為10?15nm的硅納米線或由化學(xué)刻蝕法制備得到的直徑為200?400nm， 長度為15?20 μ m的硅納米線。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、N，N-二 甲基甲酰胺或丙酮。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性 肽鏈中的熒光團(tuán)是熒光素、羅丹明熒光團(tuán)或花青熒光團(tuán)； 所述的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的肽鏈?zhǔn)呛幸鹊鞍酌高x擇性作用位點(diǎn) 的不同長度的肽鏈，其為 N-GCGPLGVRGK-amidation 或 N-RGK-amidation。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的制備方法，其特征是：所述的熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選 擇性肽鏈?zhǔn)?N-FITC-GCGPLGVRGK-amidation 或 N-FITC-RGK-amidation。
7. -種基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器，其是 由權(quán)利要求1?6任意一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶熒 光化學(xué)傳感器，其特征是：所述的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器，是通過熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶 選擇性肽鏈中的肽鏈將硅納米線和熒光團(tuán)標(biāo)記的胰蛋白酶選擇性肽鏈中的熒光團(tuán)共價(jià)連 接在一起構(gòu)建而成的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器。
9. 一種權(quán)利要求7或8所述的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的胰蛋白酶 熒光化學(xué)傳感器的應(yīng)用，其特征是：所述的基于硅納米線與其表面熒光團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的 胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器用于含有胰蛋白酶的溶液體系中的胰蛋白酶的檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是：所述的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器，在有胰 蛋白酶存在的溶液體系中，所述的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器會(huì)產(chǎn)生熒光增強(qiáng)，通過繪制已 知胰蛋白酶的濃度和熒光特征峰相對(duì)強(qiáng)度的定標(biāo)曲線，并與待檢測的溶液體系中的由所述 的胰蛋白酶熒光化學(xué)傳感器檢測到的熒光特征峰的熒光增強(qiáng)進(jìn)行比較，確定待檢測的溶液 體系中的胰蛋白酶的濃度。
【文檔編號(hào)】C09K11/59GK104152141SQ201410429549
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】穆麗璇, 師文生 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所