一種噻唑橙類菁染料分子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種噻唑橙類菁染料分子及其應(yīng)用。該染料分子的結(jié)構(gòu)包括：結(jié)合基團、酶標基團、交聯(lián)基團以及連接部位。該分子用于細胞熒光染色以及基于細菌內(nèi)酯酶活性判斷細菌的生存狀態(tài)，選擇性抑制死細菌DNA在PCR反應(yīng)中的擴增，從而達到對活細菌快速定量檢測的目的。本發(fā)明染料分子結(jié)構(gòu)簡單，制備成本低，而且酯酶降解率高。
【專利說明】一種噻唑橙類菁染料分子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于活細菌檢測的分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計及其在細菌檢測技術(shù)中的應(yīng) 用。本發(fā)明涉及的噻唑橙類菁染料分子（簡稱Β0ΜΑ)能應(yīng)用于細胞染色、細菌檢測技術(shù)領(lǐng) 域，利用細胞內(nèi)酯酶活性是否存在作為判斷細菌生存狀態(tài)的依據(jù)，通過在熒光定量PCR反 應(yīng)中抑制死細菌的DNA擴增，達到定量檢測樣本中活細菌含量的目的。

【背景技術(shù)】
[0002] 食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一，在世界食品安全領(lǐng)域中備受關(guān) 注。而在自然環(huán)境中，微生物以多種生理狀態(tài)存在：可培養(yǎng)的活菌，處于非可培養(yǎng)狀態(tài)的活 菌（Viable but Nonculturable，VBNC)，具有完整結(jié)構(gòu)但無生物活性的死菌（"Ghosts"） 以及膜損傷死菌。只有"活菌"才保留有原菌的毒力和致病性，對食品安全造成潛在的威 脅，而經(jīng)過高溫、紫外線等各種途徑滅活處理的細菌已喪失了其致病性，因此食源性致病菌 檢驗的關(guān)鍵是食品中"活"的致病菌是否存在和準確定量。
[0003] 目前用于區(qū)別活菌和死菌的標準主要有：是否可培養(yǎng)，是否有代謝活性以及細胞 膜是否完整。分離培養(yǎng)法對于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌會出現(xiàn)漏檢。現(xiàn)有活菌PCR技術(shù) (EMA/PMA-qPCR活菌檢測技術(shù)）實際上是通過細胞的膜的完整性來對"死"、"活"細胞進行 區(qū)分檢測。該活菌檢測技術(shù)是利用新型核酸染料EMA (疊氮溴化乙錠）或PMA (疊氮溴化丙 錠）滲入膜損傷的細胞后，與DNA發(fā)生共價結(jié)合，從而抑制膜損傷細胞DNA在PCR反應(yīng)中的 擴增。該方法利用EMA/PMA分子中的溴化乙錠、溴化丙錠不能穿透細胞膜的特性，選擇性對 膜損傷細胞的DNA進行結(jié)合，之后在可見光的作用下，使交聯(lián)基團與DNA發(fā)生共價交聯(lián)，達 到在PCR反應(yīng)中抑制被交聯(lián)的DNA擴增的效果。然而細胞膜損傷可能是細胞死亡的一種極 端表現(xiàn)形式，以細胞膜的完整性作為區(qū)分死、活菌的檢測標準存在缺陷。首先，理論上EMA/ PMA不能進入活的細胞內(nèi)，但對一些具有可逆性的部分膜損傷細胞（如存在于環(huán)境樣本中 的細菌）以及部分膜完整的活菌，染料仍會穿透細胞膜，造成不同程度的活菌DNA損失，產(chǎn) 生假陰性結(jié)果。其次某些滅菌方法不直接作用于細胞膜，如紫外線滅菌法，冷凍滅菌等。這 種情況下，不能采用基于EMA或PMA的活菌PCR方法來評估滅菌方法的效果，否則會造成活 細胞數(shù)目的嚴重高估。因此，以細胞膜的完整性作為區(qū)分活菌和死菌的檢測標準仍有缺陷， 而基于生物代謝活性的活菌分析將克服PMA-qPCR方法在原理上的不足，能直接通過細胞 內(nèi)代謝活性的有無對死、活細菌加以區(qū)分。盡管少數(shù)死亡細胞仍會殘留微量的代謝活性，但 在絕大多數(shù)情況下，這種活性喪失的速度快于膜的損傷，或大致相等。因此，建立一套基于 生物代謝活性的活菌分析方法，使其既可有效檢測出活菌（包括VBNC菌），又可克服原有活 菌檢測技術(shù)方法在原理上的不足，對于膜完整或膜損傷的死細胞不檢測，同樣符合致病菌 檢測的根本要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種基于細菌酯酶活性檢測活細菌的噻唑橙類菁染料分子。
[0005] 本發(fā)明另一目的是提供該種分子的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是一種用于活細菌檢測技術(shù)的噻唑橙類菁染料分子結(jié)構(gòu)及其在活細菌檢 測中應(yīng)用。該分子結(jié)構(gòu)將噻唑橙類染料從分子探針的設(shè)計、應(yīng)用，拓展到用于活細菌檢測的 分子設(shè)計、應(yīng)用。應(yīng)用該分子結(jié)構(gòu)設(shè)計的分子可用于細胞染色及細菌檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，通過利 用該分子自由穿透細胞膜的特性，通過細胞內(nèi)酯酶活性判斷細菌生存狀態(tài)，以及在熒光定 量PCR反應(yīng)中對死細菌DNA擴增的抑制作用，達到定量檢測活細菌含量的目的。
[0007] -種噻唑橙類菁染料分子，分子結(jié)構(gòu)如下：
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 一種噻唑橙類菁染料分子，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)如下：
R為C2?C5的烷基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噻唑橙類菁染料分子，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)為：
3. 權(quán)利要求1或2所述噻唑橙類菁染料分子的應(yīng)用，其特征在于，該分子用于活菌含量 的檢測。
4. 權(quán)利要求1或2所述噻唑橙類菁染料分子的應(yīng)用，其特征在于，該分子用于對細胞進 行快速熒光染色。
【文檔編號】C09B23/04GK104194379SQ201410390968
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】肖性龍, 黃韻, 余以剛, 吳暉, 李曉鳳, 唐語謙, 劉冬梅 申請人:華南理工大學