專利名稱：：溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種發(fā)光試劑，特別是指一種具有溴代苯并噻唑結(jié)構(gòu)的魯米諾衍生物的制備方法。技術(shù)背景化學(xué)發(fā)光分析不使用光源，可避免光譜法中普遍存在的雜散光干擾。常用的化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光過程僅在數(shù)秒(甚至更短)時間內(nèi)完成，加之發(fā)光微弱和機(jī)理復(fù)雜，客觀上要求嚴(yán)格控制操作條件，因此極大地影響了化學(xué)發(fā)光法在實(shí)際工作中的應(yīng)用。然而，隨著發(fā)光檢測技術(shù)的改善和電腦技術(shù)的飛速發(fā)展，進(jìn)樣和試劑混合全由微處理機(jī)控制以及反應(yīng)系統(tǒng)全部自動化的化學(xué)發(fā)光分析儀器的問世，使化學(xué)分析法在分析速度、靈敏度和準(zhǔn)確度方面顯著提高，在環(huán)境、臨床、藥物、免疫和生物等相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用(ZhangYim,GregoryJ.Phillips,andEdwardS.Yeung.AnalyticalChemistry,2007，79(14):5373;D.WhitneyKing,WilliamJ.Cooper,StevenA.Rusak,BarrieM.Peake，JamesJ.Kiddle,DanielW.O'Sullivan，MeganL.Melamed，ChrisR.Morgan,andStephenM.Theberge.AnalyticalChemistry,2007,79(11):4169)?；瘜W(xué)發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度即反應(yīng)靈敏度決定于躍遷時量子產(chǎn)率的高低，尋找新的更高效的發(fā)光試劑倍受分析工作者關(guān)注。盡管近年來許多有機(jī)化合物，如吖啶酯類、二氧環(huán)乙垸類和洛粉堿類也被合成與應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光分析(林旭聰，.郭良洽，謝增鴻，世界科技研究與發(fā)展，2004,26(4):136;雷春華，李承志應(yīng)用化工，2005，34(11):680)，但魯米諾仍被普遍采用。由于魯米諾化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度不夠高，且易受反應(yīng)介質(zhì)酸度等因素的影響，不能滿足現(xiàn)代生物和環(huán)境分析中超痕量組分的準(zhǔn)確檢測。為了進(jìn)一步改善魯米諾試劑的發(fā)光性能，人們相繼開發(fā)出多種魯米諾衍生物，大部分新試劑在化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度方面獲得不同程度的改進(jìn)(StefanB，TomaszK.AnalyticaChimicaActa,2007,585(1):147;ManabuN，TakaeH，KiyoshiZaitsu.JournalofPhotochemistryandPhotobiologyA:Chemistry,2007，186(1):99;Jong-WooCheon,Chil畫WonLee，Myoung-SeonGong.NeriGeum，DyesandPigments,2004,61:23;Chil-WonLee,Sang-WooJoo,OhyoungKim，JaejungKo,Myoung-SeonGong.DyesandPigments,2002，52:37;高文達(dá)，理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊，2004，40(4):226;匡永清，孫曉莉，何煒，尉琳，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002，23(11):1037;JunichiIshida,MakiTakada，TomohiroYakabe,MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1995,27(1》1;HideyukiYoshida,KiyoshiUreshino,JunichiIshida,HitoshiNohta,MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1999，41:177;HideyukiYoshida,RyujiNakao，HitoshiNohta，MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,2000，47:239)。其中，日本福岡大學(xué)MasatoshiYamaguchi教授合成的含有苯并噻唑結(jié)構(gòu)的魯米諾衍生物化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的數(shù)十倍(JunichiIshida，MakiTakada,TomohiroYakabe,MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1995,27(1):1)?；谖覀冮L期對溴原子特殊的電子效應(yīng)對有機(jī)化合物的光譜性能影響規(guī)律的深入研究(LiZaijun，PanJiaomai,TangJan.TheAnalyst,2001,136(7):1154;LiZaijun，ChenYepu，PanJiaomai,TangJian.AnalyticalLetters,2002,35(13):2157;LiZaij叫ZhuZhenzhong,ChenYepu，HsuChunggin，PanJiaomai.Talanta,1999,48(3):511)，希望將溴原子引入苯并噻唑結(jié)構(gòu)中開發(fā)出發(fā)光性能更為優(yōu)異的新型發(fā)光試劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于合成一類具有苯并噻唑結(jié)構(gòu)的魯米諾衍生物，該材料發(fā)光性能優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定性好、使用壽命長。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備含有溴代苯并噻唑結(jié)構(gòu)的魯米諾衍生物的方法，該方法簡單實(shí)用，可操作性強(qiáng)。本發(fā)明提供的具有溴代苯并噻唑結(jié)構(gòu)的五種新型發(fā)光試劑，通過發(fā)光性能檢測，其發(fā)光強(qiáng)度為魯米諾的數(shù)十倍，甚至達(dá)230倍左右。本發(fā)明提供的制備上述材料的方法為-a、硝化，300~400mL濃硫酸和60~80mL發(fā)煙硝酸加入到反應(yīng)瓶中，置于冰浴中冷卻到01(TC;在劇烈攪拌下加入5060g鄰苯二甲酰亞胺，控制體系溫度不高于15'C;反應(yīng)45小時，停止攪拌并撤去冰浴，室溫下靜置過夜；次日，將反應(yīng)物慢慢倒入冰水混合物中，形成大量黃色懸濁物，用布氏漏斗抽濾，將濾出物再洗滌抽濾35次，用95%乙醇重結(jié)晶，過濾，然后在508(TC下千燥得到淡黃色固體4-硝基鄰苯二甲酰亞胺淡黃色固體；b、還原，150~200gSnCl2溶于150~300mL濃鹽酸中，再加6080mL水，恒溫在5060°C;分批加入3050g4-硝基鄰苯二甲酰亞胺，體系溫度不斷上升，大約反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行20~50分鐘時，溫度開始下降；繼續(xù)加熱兩小時，室溫下放置過夜，次日過濾，用大量去離子水洗滌沉淀，用吡啶重結(jié)晶，烘干得到產(chǎn)品4-胺基鄰苯二甲酰亞胺；c、巰基化，15~20g的4-胺基鄰苯二甲酰亞胺和1520g的硫氰酸鈉溶于200300mL的甲醇溶液中，冰浴中冷卻至05'C;另將1518mL液溴溶于150mL的甲醇置于滴液漏斗中；當(dāng)燒瓶中溶液溫度達(dá)到05'C時，開始逐滴滴加溴的甲醇溶液；滴加完后，繼續(xù)在零度下攪拌兩小時，然后室溫反應(yīng)810小時；用布氏漏斗抽率得黃色沉淀，真空干燥得產(chǎn)品4-胺基-6-巰基鄰苯二甲酰亞胺；加入巰基時所采用的試劑為硫氰化鈉；反應(yīng)溫度05'C，并且在含液溴的甲醇溶液中攪拌進(jìn)行；d、酰肼化，由4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰亞胺制備4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰肼(簡稱AMHP);反應(yīng)恒溫在6070'C進(jìn)行，加入的試劑為85%水合肼；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾得到粗產(chǎn)品，再用無水乙醇重結(jié)晶，得中間產(chǎn)物4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰肼。e、合成，將AMHP分別與4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羥基苯甲醛、3,5-二溴-2-羥基苯甲醛、3,5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3,4,5-三溴苯甲醛縮合，得到終產(chǎn)物4-(4-溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-2-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼和4-(3,4,5-三溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼(簡稱p-B-AMHP、DB-;-H-AMHP、DB-o-H-AMHP、DB-p-MO-AMHP和TB-AMHP);反應(yīng)時，分別將AMHP和4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羥基苯甲醛、3，5-二溴-2-羥基苯甲醛、3,5-二溴-4-甲氧基苯甲醛及3,4，5-三溴苯甲醛溶于N,N-二甲基甲酰胺，反應(yīng)恒溫在506(TC進(jìn)行；溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑的結(jié)構(gòu)通式如下，其中Ar代表不同結(jié)構(gòu)的芳基，上述a、b、c、d、e反應(yīng)的路線如下:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明所采用的原料易得，且產(chǎn)率高在2-溴代芳烴苯并噻唑類試劑的合成中，AMHP的制備最為關(guān)鍵。工作之初，我們參照文獻(xiàn)(JunichiIshida,MakiTakada,TomohiroYakabe，MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1995,27(1):1)相似的方法操作，結(jié)果不僅產(chǎn)率低，而且經(jīng)常導(dǎo)致AMHP及2-溴代芳烴苯并噻唑類試劑合成失敗。經(jīng)過對合成路線的仔細(xì)分析和大量實(shí)踐，我們發(fā)現(xiàn)問題主要存在于巰基化步驟。由于NaSCN/B^巰基化工藝中所使用液溴具有很強(qiáng)的氧化性，它既可破壞巰基，還能分解最終產(chǎn)物。為了克服以上問題，一方面我們嚴(yán)格控制巰基化反應(yīng)的溫度在o。c左右，盡量減少溴對中間產(chǎn)物中巰基的氧化，另一方面AMHP粗產(chǎn)品采用無水甲醇反復(fù)洗滌，直到流出液沒有顏色為止，以確AMHP中殘留溴去除完全。如此，AMHP的總產(chǎn)率達(dá)50%，明顯高于文獻(xiàn)值。在此基礎(chǔ)上，合成的五種溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑的意產(chǎn)率分別為DB-p-H-AMHP:47°/。，DB-p-MO-AMHP:50%,TB-AMHP:42%,/-B畫AMHP:50%和DB-o-H-AMHP:47%。2.產(chǎn)品性能穩(wěn)定試劑可在室溫下貯藏半年后，其發(fā)光性能基本不變。3.發(fā)光性能好通過對五種溴代芳烴苯并噻唑類化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)光強(qiáng)度迅速上升到最大值，然后很快下降至基線。然而，試劑的發(fā)光動力學(xué)曲線與試劑的初始濃度有關(guān)。通常，試劑濃度越大發(fā)光強(qiáng)度上升或下降所需要的時間越長，反之就越短(這是因?yàn)樵噭舛却蠡瘜W(xué)反應(yīng)完成需要更多的時間)。當(dāng)試劑濃度為lxlO-slxlO"mol/L時，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在0.51.0min內(nèi)進(jìn)行完全，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值，發(fā)光強(qiáng)度的衰減比較緩慢；當(dāng)試劑濃度為lxlO—7mol/L時，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在l3s內(nèi)進(jìn)行完全，發(fā)光強(qiáng)度的衰減迅速，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)曲線呈現(xiàn)尖峰狀。由于在實(shí)際分析應(yīng)用時，發(fā)光試劑的濃度是非常低的，優(yōu)異的發(fā)光動力學(xué)特征不僅可提高化學(xué)發(fā)光分析方法的靈敏度，而且還能增加樣品分析頻次，這些對生化反應(yīng)機(jī)理探討和實(shí)時分析都是至關(guān)重要的。對五種試劑發(fā)光試劑的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行測定，結(jié)果列于表1。從表1中可以看出五種新試劑的發(fā)光強(qiáng)度明顯高于傳統(tǒng)發(fā)光試劑一魯米諾，其中DB-p-H-AMHP化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度是傳統(tǒng)試劑魯米諾的230倍，具有很好的分析應(yīng)用前景。另一方面，實(shí)踐進(jìn)一步證實(shí)在苯并噻唑類試劑中同時引入多個供電子基團(tuán)或多種供電子基團(tuán)組合可獲得性能更為優(yōu)異的發(fā)光試劑。具體實(shí)施方式1.發(fā)光試劑的制備(1)350mL濃硫酸和60mL發(fā)煙硝酸加入到反應(yīng)瓶中，置于冰浴中冷卻到l(TC左右。在劇烈攪拌下加入50g鄰苯二甲酰亞胺，控制體系溫度不高于15°C。反應(yīng)4小時，停止攪拌并撤去冰浴，室溫下靜置過夜。次日，將反應(yīng)物慢慢倒入冰水混合物中，形成大量黃色懸濁物，用布氏漏斗抽濾，將濾出物再洗滌抽濾四次，用95%乙醇重結(jié)晶，得到淡黃色固體4-硝基鄰苯二甲酰亞胺。(2)173gSnCl2溶于175mL濃鹽酸中，再加66mL水，恒溫在5060。C。分批加入30g4-硝基鄰苯二甲酰亞胺，體系溫度不斷上升，大約反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行20分鐘時，溫度開始下降。繼續(xù)加熱兩小時，室溫下放置過夜，次日過濾，用大量去離子水洗滌沉淀，用吡啶重結(jié)晶，烘干得到產(chǎn)品4-胺基鄰苯二甲酰亞胺。(3)19.5g的4-胺基鄰苯二甲酰亞胺和18.34g的硫氰酸鈉溶于300mL的甲醇溶液中，冰浴中冷卻至0X:。另將15.5mL液溴溶于150mL的甲醇置于滴液漏斗中。當(dāng)燒瓶中溶液溫度達(dá)到0"C時，開始逐滴滴加溴的甲醇溶液。滴加完后，繼續(xù)在零度下攪拌兩小時，然后室溫反應(yīng)8小時。用布氏漏斗抽濾得黃色沉淀，真空干燥得產(chǎn)品4-胺基-6-巰基鄰苯二甲酰亞胺。(4)12g4-胺基-6-巰基鄰苯二甲酰亞胺懸浮于200mL的乙醇溶液中，攪拌并恒溫至6(TC。將45mL水合肼逐漸向懸濁液中滴加，滴加兩小時，然后回流48小時。反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸餾乙醇一水溶劑，無水乙醇重結(jié)晶，得鮮紅的粉末狀產(chǎn)品AMHP。(5)將4.2gAMHP溶于40mL的N,N-二甲基甲酰胺，稱取與AMHP等摩爾的3，5-二溴-4-羥基苯甲醛溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，在攪拌下加入三口燒瓶，恒溫至52。C，滴加溶有1.5g亞磷酸氫鈉的濃度為1.5mol/L的稀硫酸溶液50mL。繼續(xù)攪拌2小時，然后室溫攪拌3小時。0'C冷卻，過濾沉淀，無水乙醇重結(jié)晶產(chǎn)品。避光環(huán)境下自然揮發(fā)溶劑乙醇，得淡黃色固體粉末DB，H陽AMHP。其它四種溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑的制備按上述操作進(jìn)行，僅在反應(yīng)步驟(5)中用不同的芳醛替代3,5-二溴-4-羥基苯甲醛(4-溴苯甲醛、3，5-二溴-2-羥基苯甲醛、3，5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3,4,5-三溴苯甲醛)，即可得到4-(4-溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-2-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼和4-(3，4,5-三溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼(簡稱p畫B-AMHP、DB-o-H誦AMHP、DB卞誦MO-AMHP和TB陽AMHP)。五種發(fā)光試劑的結(jié)構(gòu)和純度均被紅外、紫外、核磁、電噴霧質(zhì)譜和元素分析結(jié)果所證實(shí)。2.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的測定在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光監(jiān)測儀上，以1.0xl(T7mOl/L的各種發(fā)光試劑溶液為流動相(管內(nèi)徑為l.Omm)，加入50nL鐵氰化鉀或過氧化氫溶液(釆用注射閥進(jìn)樣)，記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。表l:不同溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.一種溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑，其特征是溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑的結(jié)構(gòu)通式如下，其中Ar代表不同結(jié)構(gòu)的芳基，2、如權(quán)利要求1所述溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑，其特征是該發(fā)光試劑包括4-(4-溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3，5-二溴-4-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3，5-二溴-2-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼和4-(3,4，5-三溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼。3、一種溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑的制備方法，其特征在于，a、硝化，300400mL濃硫酸和60~80mL發(fā)煙硝酸加入到反應(yīng)瓶中，置于冰浴中冷卻到01(TC;在劇烈攪拌下加入5060g鄰苯二甲酰亞胺，控制體系溫度不高于15t:;反應(yīng)45小時，停止攪拌并撤去冰浴，室溫下靜置過夜；次日，將反應(yīng)物慢慢倒入冰水混合物中，形成大量黃色懸濁物，用布氏漏斗抽濾，將濾出物再洗滌抽濾35次，用95%乙醇重結(jié)晶，過濾，然后在5080。C下干燥得到淡黃色固體4-硝基鄰苯二甲酰亞胺淡黃色固體；b、還原，150200gSnCl2溶于150~300mL濃鹽酸中，再加6080mL水，恒溫在5060°C;分批加入30~50g4-硝基鄰苯二甲酰亞胺，體系溫度不斷上升，大約反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行20~50分鐘時，溫度開始下降；繼續(xù)加熱兩小時，室溫下放置過夜，次日過濾，用大量去離子水洗滌沉淀，用吡啶重結(jié)晶，烘干得到產(chǎn)品4-胺基鄰苯二甲酰亞胺；c、巰基化，15~20g的4-胺基鄰苯二甲酰亞胺和1520g的硫氰酸鈉溶于200~300mL的甲醇溶液中，冰浴中冷卻至05"C;另將1518mL液溴溶于150mL的甲醇置于滴液漏斗中；當(dāng)燒瓶中溶液溫度達(dá)到05'C時，開始逐滴滴加溴的甲醇溶液；滴加完后，繼續(xù)在零度下攪拌兩小時，然后室溫反應(yīng)810小時；用布氏漏斗抽率得黃色沉淀，真空干燥得產(chǎn)品4-胺基-6-巰基鄰苯二甲酰亞胺；加入巰基時所采用的試劑為硫氰化鈉；反應(yīng)溫度05'C，并且在含液溴的甲醇溶液中攪拌進(jìn)行；d、酰肼化，由4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰亞胺制備4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰肼AMHP;反應(yīng)恒溫在607(TC進(jìn)行，加入的試劑為85%水合肼；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾得到粗產(chǎn)品，再用無水乙醇重結(jié)晶，得中間產(chǎn)物4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰肼；e、合成，將4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰肼分別與4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羥基苯甲醛、3，5-二溴-2-羥基苯甲醛、3，5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3，4，5-三溴苯甲醛縮合，得到終產(chǎn)物4-(4-溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3,5-二溴-2-羥基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼、4-(3，5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼和4-(3，4，5-三溴苯)苯并噻唑鄰二甲酰肼；反應(yīng)時，分別將4-胺基-5-巰基鄰苯二甲酰肼和4-溴苯甲醛、3,5-二溴-4-羥基苯甲醛、3,5-二溴-2-羥基苯甲醛、3,5-二溴-4-甲氧基苯甲醛及3,4，5-三溴苯甲醛溶于N，N-二甲基甲酰胺，反應(yīng)恒溫在506(TC進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明屬于有機(jī)合成的范疇，具體為具有溴代苯并噻唑結(jié)構(gòu)的發(fā)光試劑及制備方法。以鄰苯二甲酰亞胺為原料，經(jīng)硝化(HNO₃/H₂SO₄)、還原(SnCl₂)、巰基化(NaSCN/Br₂)和酰肼化反應(yīng)(NH₂NH₂/CH₃CH₂OH)合成4-胺基-6-巰基苯二甲酰肼(AMHP)。AMHP分別與4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羥基苯甲醛、3，5-二溴-2-羥基苯甲醛、3，5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3，4，5-三溴苯甲醛反應(yīng)制備不同的2-溴代苯并噻唑類發(fā)光試劑(依次簡稱為p-Br-AMHP，DB-p-H-AMHP，DB-o-H-AMHP，DB-p-MO-AMHP和TB-AMHP)。通過對試劑光譜行為研究表明，苯并噻唑類發(fā)光試劑的化學(xué)發(fā)光性能明顯高于傳統(tǒng)發(fā)光試劑—魯米諾，尤其是DB-p-H-AMHP發(fā)光強(qiáng)度超過魯米諾的230倍，可廣泛應(yīng)用于食品安全中的免疫化學(xué)檢測定，大大降低方法的檢出限。文檔編號C09K11/06GK101240166SQ20081001849公開日2008年8月13日申請日期2008年2月15日優(yōu)先權(quán)日2008年2月15日發(fā)明者孫秀蘭,李在均,驥胡申請人:江南大學(xué)