專利名稱：：聚合物涂層及其形成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)各種基材材料(包括有機(jī)和無機(jī)基材)的表面進(jìn)行改性的方法和工藝。更具體而言，本發(fā)明涉及利用聚合物來至少部分地涂覆基材表面以便為基材表面賦予與該基材其余部分的功能性質(zhì)明顯不同的功能性質(zhì)。例如，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，賦予基材表面的功能性質(zhì)可以是誘導(dǎo)特定生物應(yīng)答的能力。
背景技術(shù)：
：在許多應(yīng)用中，重要的是使材料或裝置的主體特性與該材料或裝置的表面特性之間有所區(qū)別。主體或基材材料提供了一組適用于預(yù)期應(yīng)用的主體性質(zhì)，如機(jī)械性質(zhì)或折射性質(zhì)。然而，在許多應(yīng)用中，基材材料的表面性質(zhì)對(duì)于預(yù)期應(yīng)用來說并不適合或者并不理想。因此，對(duì)于這些基材材料，需要進(jìn)行表面改性以掩蔽可能會(huì)妨礙基材使用的基材表面性質(zhì)。例如，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，掩蔽主體材料性質(zhì)的表面改性是有用的。諸如聚合物角膜覆蓋物或金屬髖部植入物等植入體的主體材料是針對(duì)折射和/或機(jī)械性質(zhì)來選擇的。然而，主體材料的表面性質(zhì)可能會(huì)妨礙所需的生物應(yīng)答(如細(xì)胞附著)，或者可能會(huì)激起不需要的生物應(yīng)答(如蛋白質(zhì)結(jié)垢)。此外，表面改性可用于實(shí)現(xiàn)對(duì)所述材料或裝置的生物應(yīng)答的一定程度的控制，這種控制是通過主體材料的自身性質(zhì)所不能實(shí)現(xiàn)的。能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物應(yīng)答的控制的途徑的例子包括在裝置表面上展示諸如肽或藥物等特定生物活性信號(hào)，或者阻止裝置表面與周圍生物介質(zhì)之間的非特異性相互作用。表面上固定聚合物。通常，這已經(jīng)通過吸附或共價(jià)連接而以不同程度的成功度和完成度實(shí)現(xiàn)。吸附是將高分子固定在表面上的最簡(jiǎn)單的方法。然而，吸附涂層可能會(huì)在某些條件下脫附，這限制了吸附在諸多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中作為表面改性技術(shù)的適用性。例如，諸如植入體等的設(shè)計(jì)為在生理?xiàng)l件下保持較長時(shí)間的裝置可能會(huì)失去其功能性表面涂層，使得聚合物流失到其環(huán)境中。此外，簡(jiǎn)單吸附并不易適用于很多種類的基材材料，這是因?yàn)榛牡男再|(zhì)并不適合吸？1和保持涂層聚合物?；男再|(zhì)是否合適也取決于所要涂覆的聚合物類型。WO03/042724描述了一種基于吸附的更復(fù)雜的材料表面涂覆工藝，該工藝包括以下步驟a)提供無機(jī)或有機(jī)主體材料；b)提供一種或多種多離子分子(polyionicmolecule),這些多離子分子中的至少一個(gè)具有共價(jià)連接的自由基聚合引發(fā)子側(cè)鏈部分(pendantcovalentlyboundinitiatormoietiesforradicalpolymerization);c)將步驟(b)的多離子材沖+涂覆到步驟(a)的主體材料上，由此在主體材料表面上形成親水層；和d)將親水性的單體或大分子單體接枝聚合到所述多離子材料上。該方法的缺點(diǎn)包括如對(duì)吸附表面改性技術(shù)所描述的涂層脫附的可能性。此外，對(duì)接枝聚合物涂層結(jié)構(gòu)的控制是有限的。另一種可選方式，聚合物通過共價(jià)鍵接來固定在基材表面上。已經(jīng)描述了多種不同的在固體基材上得到接枝聚合物涂層的工藝。此技術(shù)的一些例子包括1)EP1095711A2描述了可用于生物醫(yī)學(xué)基材材料涂層的傳統(tǒng)自由基聚合物引發(fā)子對(duì)基材的共價(jià)附著。該方法通常導(dǎo)致引發(fā)子在整個(gè)基材表面上的密度不確定和不一致，而這通常是不希望的。此外，不利地是，用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)的引發(fā)子密度是有限的。最后，對(duì)隨后的接枝涂層結(jié)構(gòu)的控制僅僅是有限的。2)也已使用含有引發(fā)子的自組裝單層。例如，Boven等，[Boven,G.,Folkersma,R.,Challa，G.,Schouten，A丄，Polym.Co讓un.32(1991)50]用3-氨基丙基三乙氧基硅烷處理玻璃小珠以在表面上得到氨基官能團(tuán)。然后，通過在g-APS改性的表面和酰氯官能化的含氮引發(fā)子之間形成酰胺鍵來將含氮引發(fā)子固定在表面上。隨后的表面引發(fā)自由基聚合反應(yīng)生成了系留PMMA鏈(tetheredPMMAchain)。該方法的缺點(diǎn)也包括在基材整個(gè)表面上的引發(fā)子密度不確定、不一致和受限制。此外，該方法采用多步表面涂覆方法，這限制了其對(duì)二氧化硅材料的適用性和有效性。3)Sugawara，T.,Matsuda,T.，Macromolecules27(1994)7809描述了在聚(對(duì)苯二曱酸乙烯酯)(PET)基材上接枝聚(丙烯酰胺)。首先，使用已經(jīng)用光反應(yīng)性苯基疊氮基基團(tuán)進(jìn)行部分衍生化的聚(烯丙胺)來涂覆基材。胺化聚合物隨后經(jīng)UV輻射而結(jié)合到PET基材表面上。然后通過縮合反應(yīng)將羧基化含氮引發(fā)子固定在聚胺改性表面上。單體溶液中的自由基聚合最后形成系留聚合物(tetheredpolymer)。該技術(shù)也采用了限制其適用性的多步表面涂覆方法。該方法的其它缺點(diǎn)也包括在基材整個(gè)表面上的引發(fā)子密度不確定、不一致和受限制，以及對(duì)接枝涂層結(jié)構(gòu)的控制有限。4)通過在含有引發(fā)子的溶液中簡(jiǎn)單的溶脹并隨后在含有引發(fā)子的溶液中接枝聚合也可將接枝聚合引發(fā)子固定在固體基材上。美國專利6,358,557公開了這種原理。此外，WO03/083040教導(dǎo)了摻入引發(fā)子的底漆涂層的使用。該方法也可用于不能溶脹的固體基材。除基材依賴性問題，此方法的缺點(diǎn)也包括在基材整個(gè)表面上的引發(fā)子密度不確定、不一致和受限制，以及對(duì)接枝涂層結(jié)構(gòu)的控制有限。此外，缺乏共價(jià)連接將導(dǎo)致涂層的部分脫附。接到二氧化硅表面，且通過含有硫醇基團(tuán)的ATRP引發(fā)子與金表面的反應(yīng)已將ATRP引發(fā)子共價(jià)地連接到金表面[Pyun,J.,Kowalewski,T.Matyjaszewski,K.,MacromolecularRapidCommunications,24(2003)1043]。然而，對(duì)使用諸如二氧化硅和金等基材的依賴限制了該技術(shù)的適用性。此外，其它缺點(diǎn)包括，由硅烷形成的自組裝層顯示出一定的不穩(wěn)定性[Wang，A.等，JournalofColloidandInterfaceScience,291(2005)438]和不可再現(xiàn)性[Halliwe11,CM.,Cass，A.E.G.,AnalyticalChemistiy73(2001)2476]，并且在金和硫醇(非共價(jià)相互作用)之間形成的自組裝層已顯示出隨時(shí)間而不穩(wěn)定[Willey,T.M.等，SurfaceScience576(2005)188]。此外，這些改性表面的形成相對(duì)復(fù)雜(要求基材完全清潔和干燥)，且表面涂層可能在基材上分布不均。諸如引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑(iniferter)等其它引發(fā)子的共價(jià)連接也已用于在諸如二氧化硅(通過硅烷)[Lee,H丄，Nakayama,Y.,Masuda,T.,Macromolecules32(1999)6989]和聚苯乙烯(通過4汙生化反應(yīng))[Nakayama,Y.,Matsuda,T"Langmuir15(1999)5560;Kawaguchi,H.,Isono,Y.Tsugi,S.,MacromolecularSymposia179(2002)75]之類的基材上形成接枝聚合物層。然而，正如之前所討論的，為諸如二氧化硅和聚苯乙烯等特定基材設(shè)計(jì)的表面改性方案嚴(yán)重地限制了該技術(shù)的適用性。在本說明書中，對(duì)任何現(xiàn)有技術(shù)的提及都不是也不應(yīng)被認(rèn)為是確域中的^^知常識(shí)的一部分或者本領(lǐng)域技術(shù)人員能合理地預(yù)計(jì)到該現(xiàn)有技術(shù)是確定的、可被理解的或者被認(rèn)為是相關(guān)的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種替代性的、穩(wěn)定的、廣泛適用的在基材表面上形成聚合物涂層的方法。有利的是，本發(fā)明涉及一種形成聚合物表面涂層的方法，其可靠地實(shí)現(xiàn)預(yù)定的表面涂層特征，諸如密度、均勻度和厚度。該優(yōu)點(diǎn)在第一水平上通過對(duì)與基材表面共價(jià)連接的高分子上的聚合引發(fā)子的密度和分布加以控制，且在第二水平上通過對(duì)由通過自聚合引發(fā)子接枝而進(jìn)行的側(cè)鏈聚合物的形成加以控制來實(shí)現(xiàn)。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種將聚合引發(fā)子可控地定位在基材表面上的方法，所述方法包括將高分子共價(jià)地連接到所述表面，其中所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種將聚合引發(fā)子可控地定位于基材表面上的方法，所述方法包括通過大量共價(jià)鍵來將高分子共價(jià)地連接到所述表面，其中所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。在還一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種將聚合引發(fā)子可控地定位于基材表面上的方法，所述方法包括將其上共價(jià)連接有預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子的高分子共價(jià)連接到所述基材表面上。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。本說明書和權(quán)利要求書中使用的與將聚合引發(fā)子定位在表面上有關(guān)的術(shù)語"可控(controllable)，，是指應(yīng)用所述方法來指導(dǎo)？1發(fā)子在表面上的位置或相對(duì)位置特征(如均勻度、密度和引發(fā)子可接近性)的能力。調(diào)節(jié)或調(diào)控諸如此類的因素的能力的限制是在本領(lǐng)域中改進(jìn)基材表面改性的常見限制。當(dāng)這些因素在某種程度上可受控制時(shí)(就較低密度或可接近性而言)，這將傾向于降低最終產(chǎn)品的相關(guān)性質(zhì)。本發(fā)明涉及有利地調(diào)控這些因素以提高最終產(chǎn)品性質(zhì)。本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語"聚合引發(fā)子(polymerizationinitiator)"或"引發(fā)子(initiator)"是指引發(fā)聚合或能夠產(chǎn)生引發(fā)聚合的反應(yīng)性物種的任何化合物。本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語"預(yù)定，'是指選擇足以實(shí)現(xiàn)所希望的聚合引發(fā)劑在與基材表面共價(jià)連接的高分子上的密度和分布的聚合引發(fā)子的摩爾比。預(yù)定摩爾比表明引發(fā)子比例是可控的，并且，如實(shí)施例所示，可以是變化的和預(yù)先確定的。術(shù)語"摩爾比"是高分子上聚合引發(fā)子密度的量度。該術(shù)語用于指代高分子中每稀釋劑單體單元中聚合引發(fā)子的數(shù)目的比例。在高分子中控制引發(fā)子基團(tuán)的摩爾比使得可以在具有該高分子涂層的基材上控制引發(fā)子的表面密度。因此，高分子涂層中引發(fā)子的密度可由高分子中引發(fā)子基團(tuán)的預(yù)定摩爾比來控制。由于這提供了對(duì)隨后的聚合物涂層的更高水平的控制，能夠可靠地由可預(yù)測(cè)的引發(fā)子表面密度來產(chǎn)生聚合物涂層的密度，因此這是有利的。另一種可選方式，可通過在基材上沿梯度改變與所述表面連接的高分子的量來控制存在于基材表面上的引發(fā)子基團(tuán)的密度，這將影響隨后的側(cè)鏈聚合物分子的性質(zhì)。高分子可通過大量共價(jià)鍵連接到基材表面。采用大量共價(jià)鍵將高分子連接到基材表面能提高高分子涂層的穩(wěn)定性。另一種可選方式，可采用層對(duì)層連接技術(shù)來將高分子涂覆至基材上，隨后交聯(lián)以形成層間共價(jià)鍵和與基材表面的共價(jià)鍵。與簡(jiǎn)單的層對(duì)層涂覆相比，這樣的工藝提高了高分子涂層的穩(wěn)定性和不溶性。高分子可以是適用于預(yù)期的基材最終用途并適用于所選的涂覆高分子的方法的任何高分子。聚合引發(fā)子可以是陰離子、陽離子或自由基引發(fā)子。優(yōu)選所述引發(fā)子是活性聚合引發(fā)子(livingpolymerizationinitiator)。更優(yōu)選所述引發(fā)子是受4空的自由基聚合引發(fā)子(controlledfreeradicalpolymerizationinitiator)。這樣的引發(fā)子包括引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑、衍生的RAFT試劑、ATRP、三芳基曱烷和烷氧基胺(硝基氧介導(dǎo)的)引發(fā)子?？赏ㄟ^在聚合時(shí)引入，例如通過與稀釋劑單體(diluentmonomer)共聚從而將聚合引發(fā)子共價(jià)地連接到高分子。另一種可選方式，引發(fā)子可以與預(yù)先形成的高分子上的側(cè)鏈官能團(tuán)(flmctionalpendantgroup)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。在高分子共價(jià)地連接到基材表面之前進(jìn)行引發(fā)子的引入。任選地，所述方法還包括確定一種或多種聚合引發(fā)子位置特征的初始步驟。例如，可確定高分子涂層中引發(fā)子的期望密度，這隨后將指導(dǎo)高分子中聚合引發(fā)子的合適摩爾比的確定。本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種在基材表面上制備可控聚合物表面涂層的方法，所述方法包括將高分子共價(jià)地連接到表面，其中所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)；并且含有從至少一些聚合引發(fā)子上接枝出的側(cè)鏈聚合物。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。優(yōu)選通過受控的自由基活性聚合而由聚合引發(fā)子接枝出側(cè)鏈聚合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括提供接枝到側(cè)鏈聚合物的其它聚合物。本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種在基材表面上制備可控聚合物表面的方法，所述方法包括通過大量共價(jià)一睫將高分子共價(jià)地連接到所述9表面，其中所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子；并且含有從至少一些聚合虧1發(fā)子上接枝出的側(cè)鏈聚合物。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。優(yōu)選通過受控的自由基活性聚合而從聚合引發(fā)子接枝出側(cè)鏈聚合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括提供接枝到側(cè)鏈聚合物的其它聚合物。本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種在基材表面上制備可控聚合物表面涂層的方法，所述方法包括將其上共價(jià)連接有預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子的高分子共價(jià)連接到所述基材表面上；并且從至少一些聚合引發(fā)子上接枝出側(cè)鏈聚合物。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。優(yōu)選通過受控的自由基活性聚合而從聚合引發(fā)子接枝出側(cè)鏈聚合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括提供接枝到側(cè)鏈聚合物的其它聚合物。本說明書和權(quán)利要求書中使用的與將聚合引發(fā)子定位在基材表面上相關(guān)的術(shù)語"可控"是指通過如上所論述般指導(dǎo)引發(fā)子在表面上的定位以及指導(dǎo)側(cè)鏈聚合物和所得涂層的特征(如密度、厚度、均勻度、化學(xué)和結(jié)構(gòu))來應(yīng)用所述方法指導(dǎo)聚合物表面涂層的特征的能力。調(diào)節(jié)或調(diào)控諸如此類的因素的能力的限制是在本領(lǐng)域中改進(jìn)基材表面改性的常見限制。本發(fā)明涉及有利地調(diào)控這些因素以提高最終產(chǎn)品性質(zhì)。優(yōu)選聚合引發(fā)子是活性聚合引發(fā)子，而從聚合引發(fā)子接枝的聚合過程是活性聚合過程。并且更優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子，而所述從聚合引發(fā)子接枝的聚合過程是受控的自由基活性聚合過程。有利的是，采用活性聚合為使用該方法的人提供了更大程度的對(duì)所得聚合物涂層的控制，這是活性聚合特性的結(jié)果。例如，活性聚合提供了對(duì)側(cè)鏈聚合物的多分散性的更大程度的控制。這點(diǎn)與從基材表面上的？1發(fā)子接枝相結(jié)合，提供了指導(dǎo)具有受控厚度的均勻致密涂層的能力，所述受控厚度足以掩蔽位于其下的基材的主體性質(zhì)?；钚跃酆弦彩谷藗兡軌蛴欣卣{(diào)控或調(diào)節(jié)側(cè)鏈聚合物層的結(jié)構(gòu)。例如，活性聚合可用于形成側(cè)鏈聚合物層中的嵌段或梯度，從而為單一涂層賦予多重性質(zhì)或特征。結(jié)果為，在由基材接枝側(cè)鏈聚合物中使用活性聚合提供了制備高度受控涂層(包括受控的側(cè)鏈聚合物結(jié)構(gòu))的能力。任選地，所述方法還包括確定一種或多種聚合物表面涂層特征的初始步驟。例如，聚合物涂層的所需密度、所需梯度(即，一片區(qū)域里密度的變化)或涂層厚度。在本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種含有高分子的可控聚合物表面涂層，所述可控聚合物表面涂層與基材表面共價(jià)地連接，所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)；并且含有從至少一些聚合引發(fā)子上接枝出的側(cè)鏈聚合物優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。優(yōu)選通過受控的自由基活性聚合而從聚合引發(fā)子接枝出側(cè)鏈聚合物。所述可控聚合物表面還可含有接枝到側(cè)鏈聚合物的其它聚合物。所述可控聚合物表面涂層還包括連接到側(cè)鏈聚合物的至少一種生物活性成分。當(dāng)超過一種的生物活性成分連接到側(cè)鏈聚合物時(shí)，所述生物活性成分可具有協(xié)同作用或互補(bǔ)作用。優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物具有受控結(jié)構(gòu)。優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控生物應(yīng)答。最優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控細(xì)胞附著。優(yōu)選所述可控聚合物表面涂層在使用(包括存儲(chǔ))環(huán)境中在長時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解的，術(shù)語"穩(wěn)定"是在表面涂層使用環(huán)境的背景下使用的，而并非必須指所述表面涂層是不確定地穩(wěn)定。在本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種含有高分子的可控聚合物表面，其通過大量共價(jià)鍵共價(jià)地連接到基材表面，所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子；并且含有從至少一些聚合引發(fā)子接枝的側(cè)鏈聚合物。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。優(yōu)選通過受控的自由基活性聚合而從聚合引發(fā)子接枝側(cè)鏈聚合物。所述可控聚合物表面還可含有接枝到側(cè)鏈聚合物的其它聚合物。所述可控聚合物表面涂層還包括連接到側(cè)鏈聚合物的至少一種生物活性成分。當(dāng)超過一種的生物活性成分連接到側(cè)鏈聚合物時(shí)，所述生物活性成分可具有協(xié)同作用或互補(bǔ)作用。優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物具有受控結(jié)構(gòu)。優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控生物應(yīng)答。最優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控細(xì)胞附著。優(yōu)選所述可控聚合物表面涂層在使用(包括存儲(chǔ))環(huán)境中在長時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解的，術(shù)語"穩(wěn)定"是在表面涂層使用環(huán)境的背景下使用的，而并非必須指所述表面涂層是不確定地穩(wěn)定。在本發(fā)明的在一個(gè)方面提供了一種含有其上共價(jià)連接有預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子的高分子的可控聚合物表面涂層，其中所述高分子共價(jià)連接到基材表面；側(cè)鏈聚合物通過聚合引發(fā)子而共價(jià)連接到高分子，其中所述側(cè)鏈聚合物形成均勻、致密和/或厚的層。優(yōu)選所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。優(yōu)選所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。優(yōu)選通過受控的自由基活性聚合而從聚合引發(fā)子接枝側(cè)鏈聚合物。所述可控聚合物表面還可含有接枝到側(cè)鏈聚合物的其它聚合物。所述可控聚合物表面涂層還包括連接到側(cè)鏈聚合物的至少一種生物活性成分。當(dāng)超過一種的生物活性成分連接到側(cè)鏈聚合物時(shí)，所述生物活性成分可具有協(xié)同作用或互補(bǔ)作用。優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物具有受控結(jié)構(gòu)。優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控生物應(yīng)答。最優(yōu)選所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控細(xì)胞附著。優(yōu)選所述可控聚合物表面涂層在使用(包括存儲(chǔ))環(huán)境中在長時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解的，術(shù)語"穩(wěn)定"是在表面涂層使用環(huán)境的背景下使用的，而并非必須指所述表面涂層是不確定地穩(wěn)定。術(shù)語"受控結(jié)構(gòu)"是指通過控制聚合以形成不同類型聚合物的能力。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，具有受控結(jié)構(gòu)的聚合物可設(shè)計(jì)為具有形態(tài)學(xué)上的各種類型或變化(包括但不限于直鏈、支鏈、星形、組合網(wǎng)絡(luò))；組成上的變化(包括但不限于嵌段共聚物、無規(guī)共聚物、均聚物、接枝共聚物、標(biāo)記或梯度共聚物)；交聯(lián)密度的變化；和/或功能性的變化(包括但不限于末端、位點(diǎn)、特異、遠(yuǎn)螯、多官能大分子單體)。本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語"生物應(yīng)答"是指受控聚合物表面中側(cè)鏈聚合物調(diào)控生物應(yīng)答的性質(zhì)。這樣的應(yīng)答包括但不限于抗生素應(yīng)答(antibioticresponse),抗微生物劑應(yīng)答、促進(jìn)或抑制細(xì)胞附著、促進(jìn)或抑制蛋白質(zhì)吸附。任選為，所述可控聚合物表面涂層提供至少一種預(yù)定的生物作用。術(shù)語"受控的自由基聚合引發(fā)子"是指引發(fā)受控或活性的自由基聚合或者能夠產(chǎn)生引發(fā)可控或活性的自由基聚合的反應(yīng)性物種的任何化合物。在本發(fā)明的另一方面提供了一種可控聚合物表面涂層，所述可控聚合物表面涂層含有能夠通過大量共價(jià)鍵與基材表面共價(jià)連接的高分子，所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子；并且含有從至少一些聚合引發(fā)子接枝的側(cè)鏈聚合物。術(shù)語"從……接枝，，是指從系留聚合引發(fā)子(tetherpolymerizationinitiator)來生長聚合物鏈。"從……接枝，，區(qū)別于"接枝到"，后者涵蓋將預(yù)先形成的聚合物連接到基材表面的官能團(tuán)上。在以下討論中，術(shù)語"聚合物涂層"是指包括具有聚合引發(fā)子的高分子層和接枝于其上的側(cè)鏈聚合物的涂層。相反，術(shù)語"高分子層"僅指在發(fā)生側(cè)鏈聚合物接枝之前就涂覆在基材上并共價(jià)連接到基材表面上的含有聚合引發(fā)子的高分子層。在本說明書全文中，術(shù)語"活性聚合"和"受控聚合，，可互換使用。活性聚合和受控聚合是本領(lǐng)域的術(shù)語。此形式的聚合的有用參考文獻(xiàn)是Moad,G.,Solomon,D.H.,T7zeC7zem&^y。/ia血a//Wymw^aWo"，2ndEd,(fullyrevised),Elsevier:Boston,2006。本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語"包括"(或其語法變化)等價(jià)于術(shù)語"包含"，并且不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是排除存在其它元素或特征。1圖l:由Si-HAPP樣品表面獲得的代表性高解析度(a)Cls和(b)NIsXPS譜圖。圖2:由Si-HAPP-PI樣品表面獲得的代表性高解析度CIsXPS譜圖。圖3:由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))樣品表面獲得的代表性Cls高解析度XPS譜圖。圖4:由Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖5:由Si-HAPP-PI-P(葡糖苷MA)樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖6:由Si-HAPP-PI-P(季胺MA)樣品獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖7:顯示在24小時(shí)培養(yǎng)之后，HeLa細(xì)胞結(jié)合至(a)Si-HAPP-PI-P(葡糖芬MA)和(b)TCPS對(duì)照表面的代表性區(qū)域。圖8:由(一)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475》和(---)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖9:由(一)Si國HAPP-PI-P(PEGMA(475))和(--畫)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-6-P(丙烯酰胺)樣品表面獲得的代表性高解析度C1sXPS譜圖。圖10:由(一)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和(一)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-PEGMA(475))涂覆樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖11:由(一)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和(…)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-季胺MA)樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖12:由(一)Si-HAPP-PI陽P(PEGMA(475))和(陽—)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-b-(P(丙烯酰胺)-共孑(？￡01\4八(475)))樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖13:由(一)Si-ALAPP和(一)Si-ALAPP-PI樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS語圖。圖14:(a)在過夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素結(jié)合蛋白溶液(在HEPES緩沖液中50pg/ml)之后由(一)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)、(—)Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5%生物素MA)、(......)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)樣品以及(——)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素1\^)樣品表面的代表性高解析度0lsXPS譜圖；和(b)在暴露于(——)人類血清白蛋白(HAS,PBS中100嗎/ml,37°C，2小時(shí))和(......)NeutrAvidinTM(在HEPES緩沖液中50呢/ml，室溫，過夜)之前和之后由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)(一)獲得的代表性高解析度CIsXPS譜圖。圖15:由(一)Si-HAPP、(一)Si畫HAPP-PATRPI和(---)Si-HAPP誦PATRPI-P(PEGMA(475))樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖16:由(一)Si-HAPP-PI(PI)(該曲線下的虛線表示曲線擬合部分)、(......)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)(PAAm)、(一)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%NHSA)(10%NHS)和(---)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/t)NHSA)(20。/。NHS)表面獲得的代表性高解析度ClsXPS語圖。標(biāo)記A和B指分別與C二0/N-C-0和0-CK)相關(guān)的結(jié)合能。圖17:顯示在24小時(shí)培養(yǎng)之后，BCEp細(xì)胞結(jié)合至(a)與KDGEA肽共價(jià)偶聯(lián)的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA),(b)與KDGAA肽共價(jià)偶聯(lián)的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA),(c)水解后的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/0NHSA)和(d)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面的示范性區(qū)域。圖18:顯示在24小時(shí)培養(yǎng)之后，BCEp細(xì)胞結(jié)合至TCPS對(duì)照表面的示范性區(qū)域。圖19:由Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品在高溫加壓之前(一)和之后(…)獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。也包括在內(nèi)的是由非高溫加壓樣品獲得的曲線擬合譜圖部分(......)。圖20:由(A)PET和(B)PET-PI(疊氮化物)共價(jià)-P(丙烯酰胺)樣品獲得的代表性高解析度ClsXPS語圖。圖21:由(a)Si畫ALAPP,(b)Si陽ALAPP-HDI,(c)Si-ALAPP-星形-PEG-PI和(d)Si-ALAPP-HDl-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖22:由(a)Si-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA)和(b)Si-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA)-TFAB樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖23:在Si-ALAPP-PI涂覆玻璃載物片上PTFE圓形掩模(陰影圓形)的示意性指示位置。圖24(a):由PTFE半球下區(qū)域獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖和(b):由PTFE半球周圍區(qū)域獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖25:顯示在由Si-ALAPP-PI涂覆玻璃載物片表面上P(PEGMA(47")的接枝聚合期間，HeLa細(xì)胞結(jié)合至(關(guān))掩蔽和(口)區(qū)域的示范性區(qū)域(4倍物鏡放大)。灰色方塊指示與整個(gè)載物片比較的圖像區(qū)域。圖26:由(a)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和(b)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖27:由(a)Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))和(b)Si隱ALAPP-PI-P(PEGMA075)-共-MA-GlyGly)樣品表面獲得的代表性高解析度C1sXPS譜圖。圖28:由(a)Si-ALAPP,(b)Si-ALAPP-PI和(c)Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖29:由(a)PS，(b)PS-ALAPP,(c)PS-ALAPP-PI，(d)PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)，(e)PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA),(f)PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)-NA樣品表面獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖30:由含有PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)的孔的ABTS顯影溶液得到的吸收值(405nm)，其中加入有(i)NeutrAvidinTM生物素結(jié)合蛋白、生物素化IgG和Ig-HRP軛合物(+NA、+l°Ab、十2。Ab)，(ii)生物素化IgG和Ig-HRP軛合物(-NA、+l°Ab、+2°八1)和(化)僅有1￡-111^扼合物(-NA、-l°Ab、+2°Ab)。圖31:在UV輻射期間，在Si-ALAPP-PI涂覆玻璃載物片(空白)上UV非透明掩模(陰影矩形)的示意性指示位置。箭頭指示移動(dòng)掩模的方向以進(jìn)行后續(xù)UV輻射步驟。圖32:作為UV輻射時(shí)間的函數(shù)的由梯度聚合物涂覆的Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))纖維載物片的XPS分析測(cè)定的元素比(。)0/C和(')N/C。圖33(a):由載物片的區(qū)域(a)未接受任何UV輻射(7cm)，(b)接受10分鐘UV照射的含有Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475》梯度接枝聚合物涂層(5cm)和(c)接受15分鐘UV照射的含有Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475》梯度接枝聚合物涂層(4cm)獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖。圖34:顯示在細(xì)胞培養(yǎng)中18小時(shí)之后，HeLa細(xì)胞結(jié)合到梯度接枝大)。所述區(qū)域代表暴露于UV輻射(a)5分鐘，(b)10分鐘，(c)20分鐘以及(d)TCPS對(duì)照表面的區(qū)域。具體實(shí)施例方式現(xiàn)在參考具體實(shí)施方式和實(shí)施例描述本發(fā)明。以下討論中無一旨在限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的聚合物涂層可應(yīng)用于大范圍的基材。適合的基材的例子包括但不限于無機(jī)或有機(jī)基材，諸如玻璃、石英、陶瓷、二氧化硅礦物、硅膠、金屬、金屬氧化物、諸如石墨等木碳材料或玻璃碳、天然或合成的有機(jī)聚合物。聚合物基材包括但不限于由鏈增長或逐步增長聚合制成的那些聚合物基材。鏈增長聚合物包括但不限于由自由基、基團(tuán)轉(zhuǎn)移、陽離子或陰離子方法制成的那些。鏈增長聚合物的例子是由丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯或苯乙烯型單體或它們的混合物制成的那些聚合物。逐步增長聚合物包括但不限于諸如聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、硫醇-烯聚合物和聚氨酯。這些有機(jī)聚合物可含有相當(dāng)數(shù)量的無機(jī)成分，如硅氧烷形式的硅。基材可以是上述材料的復(fù)合物、層壓物或摻合物。要被涂覆的基材可以采用較寬范圍內(nèi)的任何形式。例如，基材可以是任何類型和尺寸的模制品，如生物醫(yī)學(xué)模制品或工業(yè)模制品、小珠、微粒、包括納米顆粒和微顆粒的顆粒、膠嚢、管子、纖維、薄膜或膜?；囊部梢允嵌嗫撞牧希缰Ъ?、織造或非織造纖維、多孔聚合塊料或交聯(lián)水凝膠?；牡谋砻婵梢允瞧秸?、不平整或彎曲的。聚合物涂層與基材共價(jià)連接?；谋砻娴墓倌軋F(tuán)可用于與高分子上的互補(bǔ)官能團(tuán)反應(yīng)。如果基材不具有合適的表面官能團(tuán)，基材表面可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的引入官能團(tuán)的方法進(jìn)行官能化。這些方法包括等離子處理和等離子聚合。通過這些方法引入到表面的官能團(tuán)可任選地按需要進(jìn)行修飾，從而使得高分子上的官能團(tuán)與基材表面上的官能團(tuán)共價(jià)4走合(直接或通過其它分子)。適用于本發(fā)明的高分子化合物含有共價(jià)連接的聚合引發(fā)子。所述高分子也可以含有用于將高分子與基材表面共價(jià)連接的稀釋劑單體和官能團(tuán)。聚合引發(fā)子在所述高分子與基材表面共價(jià)連接之前與高分子共價(jià)連接。當(dāng)存在于所述高分子中時(shí)，稀釋劑單體可以是(曱基)丙烯酸烷基酯、(曱基)丙烯酸羥烷基酯、(曱基)丙烯酸鹵代烷基酯、(曱基)丙烯酸烷氧基烷基酯、任選地單-N-取代或雙-N-取代的氨基烷醇(曱基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸環(huán)烷基酯、(甲基)丙烯酸苯氧基酯、烷基二醇(曱基)丙烯酸酯、聚烷基二醇(曱基)丙烯酸酯、(曱基)丙烯酰胺、(曱基)丙烯酰胺^f汙生物、富馬酸酯、馬來酸和馬來酸酐和馬來酸酯、N-乙烯?？ㄟ颉-乙烯吡咯烷酮、乙烯吡啶、丙烯酸苯曱酯、曱基丙烯酸苯甲酯及兩種或兩種以上單體的共聚物。術(shù)語(曱基)丙烯酸酯既包括丙烯酸酯也包括曱基丙烯酸酯。適合的稀釋劑單體包括丙烯酸、丙烯酸曱酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸己酯、丙烯酸異己酯、丙烯酸環(huán)己酯、丙烯酸異水片酯、丙烯酸乙氧基乙酯、丙烯酸烯丙酯、丙烯醛、丙烯酰胺、丙烯酰氯、聚(乙二醇)丙烯酸酯、曱基丙烯酸、曱基丙烯酸曱酉旨、曱基丙烯酸乙酯、曱基丙烯酸丙酯、曱基丙烯酸丁酯、曱基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸異己酯、曱基丙烯酸環(huán)己酯、曱基丙烯酸異冰片酯、曱基丙烯酸乙氧基乙酯、曱基丙烯酰胺、曱基丙烯酰氯、曱基丙烯酸烯丙酯、曱基丙烯酸lH,lH，2H,2H-全氟代癸酉旨(及其它曱基丙烯酸氟化烷基酯)、曱基丙烯酸lH，lH,2H,2H-全氟代癸酯、曱基丙烯酸184,4,5,5,6,6,7,7,8,9,9,9-十二氟-2隱羥基畫8-(三氟曱基)壬酉旨、曱基丙烯酸3，3,4,4,5,5,6,6，7,8,8,8-十二氟-7-(三氟曱基)辛酉旨、曱基丙烯酸3，3,4，4，5，5,6,6,7,7，8,8,9,9，10，10,11,12，12,12-二十氟-11-(三氟曱基)十二烷基酯、曱基丙烯酸苯曱酯、曱基丙烯酸2-丁氧基乙酯、曱基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、3-丁氧基曱基丙烯酸丁酯、9//-咔唑-9-乙基曱基丙烯酸酯、曱基丙烯酸3-氯-2-羥基丙酯、曱基丙烯酸環(huán)己酯、曱基丙烯酸癸酯、曱基丙烯酸3-(二乙氧基曱基曱硅烷基)丙酯、曱基丙烯酸2-(二乙基氨基乙酯)、曱基丙烯酸2-(二曱基氨基)乙酯、曱基丙烯酸3-(二曱基氯甲硅烷基)丙S旨、分散紅1曱基丙烯酸酯、分散紅13曱基丙烯酸面旨、分散黃7曱基丙烯酸酯、乙二醇二環(huán)戊烯基醚甲基丙烯酸酯、乙二醇曱基丙烯酸酯磷酸酯、乙二醇曱基醚曱基丙烯酸酯、乙二醇單乙酰乙酸酯單曱基丙烯酸酯、熒光-O曱基丙烯酸酯、曱基丙烯酸縮水甘油酯、3-[(3，5,7，9，11,13,15-七環(huán)戊基五環(huán)[9.5丄13'9.15'5.17'3]八硅氧烷-1-基氧)-二曱基曱硅烷基]丙基曱基丙烯酸酯(二曱基曱硅烷基氧(丙基)曱基丙烯酸酯-POSS)、曱基丙烯酸2-羥基乙酯、曱基丙烯酸羥基乙酯、曱基丙烯酸羥基丙酯、曱基丙烯酸異冰片酯、曱基丙烯酸異癸酯、曱基丙烯酸月桂酸酯、乙酰乙酸2-(曱基丙烯酰氧基)乙酯、p-(曱基丙烯酰氧基)乙基]二曱基-(3-硫丙基)氬氧化銨、曱基丙烯酸酯2-萘酯、曱基丙烯酸2-(4-硝基苯氧基)乙酯、曱基丙烯酸五溴苯曱酯、曱基丙烯酸2,2，3,3，3-五氟丙酯、曱基丙烯酸3-硫丙酯鉀鹽、曱基丙烯酸2-(叔丁基氨基)-乙酯、曱基丙烯酸四氫糠酯、曱基丙烯酸2,4,6-三溴苯酯、曱基丙烯酸三癸酯、曱基丙烯酸3-(三曱氧基曱硅烷基)丙酯、曱基丙烯酸3,3,5-三曱基環(huán)己酯、曱基丙烯酸三曱基曱硅烷酯、曱基丙烯酸3-[三(三曱基硅氧基)曱硅烷基]丙酯、曱基丙烯酸3-[三(三曱基硅氧基)曱硅烷基]丙酯、ZONYL⑧TM氟單體、2-曱基丙烯酰胺曱基丙烯醛、乙烯基曱基酮、3-曱基-3-丁-2-酮、2-甲基丙烯酰氯、(聚乙二醇)山崳醚甲基丙烯酸酯、(聚乙二醇)曱基丙烯酸酯、(聚乙二醇)曱基醚、馬來酰亞胺、苯乙烯、苯乙烯類、丙烯腈、曱基丙蹄腈、二曱基丙烯酰胺馬來酸酐及其兩種或兩種以上單體的共聚物。不限于其中引發(fā)(initiation)由光化學(xué)、化學(xué)或熱刺激觸發(fā)(triggered)的化合物。優(yōu)選聚合引發(fā)子是自由基引發(fā)子。更優(yōu)選所述自由基引發(fā)子是受控或活性的自由基聚合引發(fā)子。受控的自由基聚合引發(fā)子包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)引發(fā)子、RAFT試劑衍生引發(fā)子、引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑、三丙烯基曱烷和烷氧基胺(氮氧化物調(diào)節(jié))控制劑。引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑包括硫代羰基化合物諸如二硫酯、三硫碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、二硫代氨基曱酸酯諸如N,N-二乙基二硫代氨基曱酸酯三水合物和黃酸鹽。受控的自由基引發(fā)子在明確條件下有利地被活化。例如，引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑是可由UV光輻射觸發(fā)的光引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑。ATRP引發(fā)子是由銅催化體系觸發(fā)。這些引發(fā)子在本領(lǐng)域內(nèi)已知。聚合引發(fā)子可通過聚合而共價(jià)地引入到高分子中。在該方法中，聚合引發(fā)子與諸如乙烯類不飽和基團(tuán)的可聚合基團(tuán)相偶聯(lián)，經(jīng)修飾的單體通過與稀釋劑單體的共聚引入到高分子中。聚合引發(fā)子通過共同反應(yīng)官能團(tuán)與以上列出的適用于此目的的稀釋劑單體共價(jià)連接。例如，引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑可以與曱基丙烯酸酯或丙烯酸酯基團(tuán)連接。為了將引發(fā)子共聚用單體引入到高分子中，本領(lǐng)域中已知的聚合方法可用于將引發(fā)子共聚用單體與稀釋劑單體，以及與任選的帶有用于共價(jià)連接表面的官能團(tuán)的單體進(jìn)行共聚。例如，引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑-曱基丙烯酸單體和丙烯酸酯稀釋劑單體的聚合可以采用偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)子進(jìn)行熱引發(fā)。如果以此方式引入聚合引發(fā)子，優(yōu)選為側(cè)鏈聚合引發(fā)子在高分子聚合條件下不被活化。例如，如果通過熱引發(fā)合成高分子，則選定的側(cè)鏈引發(fā)子將是熱穩(wěn)定的。另一種可選方式，如果高分子的聚合是光《f發(fā)的，則側(cè)鏈聚合引發(fā)子是非光活化的。使受控的自由基引發(fā)子活化的確定條件有助于在聚合高分子時(shí)避免引發(fā)子的活化。例如，如果聚合引發(fā)子與曱基丙烯酸使用AIBN在溫和條件下共聚，則適合的聚合引發(fā)子將包括ATRP、烷氧基胺和引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑，優(yōu)于大多數(shù)RAFT試劑衍生的引發(fā)子。所得聚合物將含有沿高分子骨架分布的活性聚合引發(fā)子。另一種可選方式，高分子聚合條件可經(jīng)選擇使得側(cè)鏈聚合引發(fā)子被活化。這些條件將形成具有分枝結(jié)構(gòu)的高分子。這樣的方法與傳統(tǒng)引發(fā)子相比更適合側(cè)鏈活性聚合引發(fā)子。在那樣的情況下，即使側(cè)鏈引發(fā)子在高分子聚合期間反應(yīng)，高分子涂層的最終功能性也不受影響，這是因?yàn)橐l(fā)子一旦合成將大量地重新連接到高分子上，并因此可繼續(xù)提供給后續(xù)活化。采用這種將聚合引發(fā)子引入到高分子中的方法，高分子中的引發(fā)子的摩爾比可通過典型共聚技術(shù)進(jìn)行控制。優(yōu)選高分子的化學(xué)計(jì)量為高分子鏈上1至50mol。/。的側(cè)鏈基團(tuán)被引發(fā)子部分取代。更優(yōu)選所述化學(xué)計(jì)量為1至25moP/。，并再更優(yōu)選為2至15mol°/。。用于將共價(jià)連接的引發(fā)子引入高分子的另一種方法是合成具有聚合引發(fā)子結(jié)合位點(diǎn)的高分子。這些通常是能與聚合引發(fā)子上的互補(bǔ)官能團(tuán)反應(yīng)的側(cè)鏈官能團(tuán)。通過將預(yù)先形成的高分子上的官能團(tuán)與聚合引發(fā)子反應(yīng)，所述引發(fā)子能夠共價(jià)地連接至高分子。采用該方法，可通過在高分子聚合期間控制具有官能團(tuán)的單體的摩爾比從而控制高分子中的引發(fā)子基團(tuán)的摩爾比。高分子也含有用于將所述高分子共價(jià)連接到基材表面的官能團(tuán)。這些官能團(tuán)可位于稀釋劑單體上，或者位于引入所述高分子的其它單體上。用于將高分子共價(jià)連接到基材的合適基團(tuán)包括但不限于氨基、羧基、羥基、苯基疊氮基、硫基、卣化、活化羧酸酯(如N-羥基琥珀酰亞胺酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯)、縮水甘油基、炔基、醛基或酮基或者它們的衍生物，或者能參與到"點(diǎn)擊(click)"反應(yīng)中的基團(tuán)。這些官能團(tuán)可以與諸如碳二亞胺等其它偶聯(lián)試劑一起使用。另一種可選方式，可使用催化劑以有助于將高分子與基材相結(jié)合。所述高分子可以合成為直鏈、星形或支鏈聚合物。它可以是無規(guī)共聚物或嵌段共聚物，用于連接高分子的官能團(tuán)和引發(fā)子位于不同的嵌段中。所述高分子可以通過大量共價(jià)鍵共價(jià)地連接至基材。在基材和高分子之間存在大量的共價(jià)鍵提供了高分子涂層的穩(wěn)定性。高分子和基材之間的共價(jià)鍵可在特別為此目的的特殊反應(yīng)中形成。用于將高分子涂覆到基材上的合適方法的例子是釆用疊氮活化聚(乙烯亞胺)(PEI-A)和聚(丙烯酸共二乙基二硫代氨基曱酸4-乙烯基-苯曱酯)共聚物的多層涂層的構(gòu)建。在黑暗中，在固體聚合基材材料上由PEI-A開始，隨后是聚(丙烯酸共二乙基二硫代氨基曱酸4-乙烯基-苯曱面旨)共聚物從而構(gòu)建逐層(LBL)涂層。在多層涂層的構(gòu)建后，對(duì)基材材料進(jìn)行輻射，所采用的波長能誘發(fā)由于疊氮-硝基苯曱酸殘基的光分解導(dǎo)致的交聯(lián)以及LBL層的共價(jià)表面固定，但卻不活化引入到高分子中的引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑分子。相同方法的另一個(gè)例子包括僅在LBL涂層組裝的最后涂覆步驟中使用引發(fā)子修飾高分子。另一種可選方式，可在側(cè)鏈聚合物形成的同時(shí)將高分子共價(jià)地連接至基材。例如，具有特定摩爾比的受控的自由基聚合引發(fā)子的衍生化高分子如聚(乙烯亞胺)(PEI)或聚(丙烯酸)(PAAC)也可以經(jīng)衍生化使得它們帶有特定摩爾比的光反應(yīng)基團(tuán)。后述衍生化的例子是能產(chǎn)生疊氮活化的PEI(PEI-A)或帶有苯基疊氮苯胺的PAAC衍生化的聚(乙烯亞胺)(PEI)與5-疊氮-2-硝基苯曱酸AA羥基琥珀酰亞胺酯的反應(yīng)。在黑暗中將這樣的高分子吸附到固體基材上和后續(xù)的清洗步驟之后，高分子涂覆基材材料轉(zhuǎn)移到單體溶液中并進(jìn)行輻射，所采用的波長能誘導(dǎo)通過在此過程中產(chǎn)生的氮烯基團(tuán)進(jìn)行的高分子的共價(jià)表面固定。此外，輻射將引起基材表面上的受控的自由基聚合。聚合引發(fā)子連接至高分子以及隨后結(jié)合至基材避免了基材上官能團(tuán)與引發(fā)子的必需的1:1的比例。高分子上與基材的多點(diǎn)結(jié)合可將大量引發(fā)子連接至基材。該優(yōu)點(diǎn)使得能夠更好地用引發(fā)子覆蓋基材。此外，由于高分子可穿過孔或其它表面起伏，即使在整個(gè)多孔基材上也能得到一致的平整涂層。一旦按照上述討論的各種方式涂覆高分子涂層，可通過從與高分子結(jié)合的聚合引發(fā)子接枝來形成側(cè)鏈聚合物。從系留？1發(fā)子接枝的技術(shù)，與接枝到表面上的官能團(tuán)相比，能夠得到更致密更厚的聚合物涂層，這是由于從引發(fā)子接枝無需通過提高密度的聚合物膜的預(yù)形成聚合物的擴(kuò)散。因此，采用從引發(fā)子接枝的技術(shù)提供了對(duì)所得聚合物涂層的更高程度的控制。優(yōu)選聚合物涂層的最終結(jié)構(gòu)是低多分散性的聚合物刷(polymerbmsh)的結(jié)構(gòu)。另一種可選方式，可在接枝聚合溶液中采用會(huì)導(dǎo)致側(cè)鏈聚合物交聯(lián)的多官能單體。側(cè)鏈聚合物的平均分子量?jī)?yōu)選為1,000至2,000,000。然而，側(cè)鏈聚合物的最優(yōu)選平均分子量將取決于聚合物涂覆基材的最終用途。3,000至l,00O,O0O或者3,OO0至50O，O00的平均分子量通常是有用的。聚合物涂層的平均厚度為干燥狀態(tài)下2nm至lnm。然而，聚合物涂層的最優(yōu)選厚度也將取決于基材的最終用途。干燥狀態(tài)下3nm至500nm的厚度或者干燥狀態(tài)下5nm至100nm的平均厚度通常是有用的。在其中活性聚合物引發(fā)子共價(jià)連接至高分子的應(yīng)用中，由分子量與分子數(shù)量之比(Mw/M。確定的側(cè)鏈聚合物鏈的多分散性優(yōu)選為小于5。更優(yōu)選所述多分散性小于3，并且最優(yōu)選小于1.5。優(yōu)選采用活性聚合來從高分子涂層接枝側(cè)鏈聚合物。在側(cè)鏈聚合物的生長中采用活性聚合是有利的，這是因?yàn)樵试S更大程度地控制側(cè)鏈聚合物的分子量和多分散性?；钚跃酆弦材芸刂苽?cè)鏈聚合物鏈的末端基團(tuán)。在活性聚合中，末端基團(tuán)是由引發(fā)子(或RADT試劑衍生引發(fā)子)的結(jié)構(gòu)確定。對(duì)末端基團(tuán)的控制使得活性聚合技術(shù)提供了對(duì)聚合物涂層特殊結(jié)構(gòu)的控制。例如，可通過在側(cè)鏈聚合物鏈末端生長另外的聚合物嵌段來合成多嵌段涂層，優(yōu)選三個(gè)以下的嵌段。這樣的結(jié)構(gòu)使得能夠?qū)⒍喙倌芡繉咏Y(jié)構(gòu)涂覆到基材上。例如，多嵌段涂層允許形成這樣的涂層，該涂層包括與基材相鄰并防止蛋白吸附和細(xì)胞附著的第一嵌段和存在特定生物活性部分的第二嵌段。另一種可選方式，也可以合成梯度共聚物。受控的自由基聚合引發(fā)子的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于特殊分子能與其共價(jià)偶聯(lián)。由于引發(fā)子位于側(cè)鏈聚合物的末端，在側(cè)鏈聚合物鏈末端引入的生物活性化合物遠(yuǎn)離基材表面。用于形成側(cè)鏈聚合物的單體的選擇取決于所需的涂層特性和活性，而這決定于涂覆基材的最終用途。本發(fā)明的一種用途是涂覆基材的三維或二維圖案。例如，不透明材料的表面化學(xué)的三維圖案可如下進(jìn)行，即使用不透明的多孔3D材料并共價(jià)地將含有引發(fā)子的高分子錨定到3D結(jié)構(gòu)的表面上，或者貫穿整個(gè)結(jié)構(gòu)或者僅在表面上(通過輻射)。后續(xù)的在單體中浸泡以及輻射僅僅導(dǎo)致在所述3D裝置的外表面上形成聚合物涂層。采用光掩模的基材表面化學(xué)的二維或三維圖案在本領(lǐng)域中已知，并可與本發(fā)明的聚合物涂層聯(lián)合使用。如此的一種應(yīng)用是使用光掩模，分別沿x和y方向在二維基材上移動(dòng)光掩模，在隨后使用不同單體或共聚單體的自由基接枝反應(yīng)中，可形成二維梯度表面。本發(fā)明的方法也可用于將梯度涂層涂覆至基材。用高分子進(jìn)行表共聚，所述高分子具有用于錨定在基材表面上的合適官能團(tuán)和用于后續(xù)的受控自由基聚合的側(cè)鏈引發(fā)子。這樣的條件包括在聚合中改變單體浴的組成從而使得聚合物鏈在靠近基材材料一側(cè)富含一種成分，在涂層的周邊富含其它成分。這樣的涂覆能用于在表面涂層內(nèi)形成梯度交聯(lián)密度。在這樣的涂覆中，至少一種共聚單體帶有能被隨后的交聯(lián)反應(yīng)接觸到的官能團(tuán)，從而形成位于基材表面的法向上的交聯(lián)密度梯度。本發(fā)明的再一種用途是通過表面固定信號(hào)分子來控制細(xì)胞附著?？蛇M(jìn)行含有諸如活性酯基團(tuán)或環(huán)氧基團(tuán)等活性官能團(tuán)的單體的聚合或共聚以形成帶有這些官能團(tuán)的涂層。在后續(xù)步驟中，帶有用于形成共價(jià)鍵的合適官能團(tuán)的肽、蛋白和其它生物分子可與涂層中存在的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)。另一種可選方式，生物分子可經(jīng)化學(xué)修飾從而含有聚合基團(tuán)，并在共聚過程中引入到側(cè)鏈聚合物中(例如在實(shí)施例中描述的可聚合生物素衍生物)。在此情況下，通過在可聚合基團(tuán)和生物分子之間提供共價(jià)連接的間隔子分子能提高生物分子的活性。生物分子是產(chǎn)生所需生物效果的分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子是肽、抗生素、抗微生物劑或細(xì)胞信號(hào)分子。另一種用途是形成可聚合生物素涂層?；牟牧鲜怯酶叻肿有揎椀谋砻?，所述高分子具有用于共價(jià)錨定的合適官能團(tuán)和用于后續(xù)的受控自由基聚合的側(cè)鏈引發(fā)子。含有特征為與諸如生物素等的另一種分子的高結(jié)合常數(shù)的基團(tuán)的單體的后續(xù)聚合/共聚形成帶有這些基團(tuán)的涂層。在后續(xù)步驟中，匹配化合物(matchingcompound)與涂層一起保溫形成穩(wěn)定鍵。一個(gè)例子是在生物素化涂層和鏈親合素之間形成鍵。通過這些特定分子固定在匹配化合物(如鏈親合素)上，或者通過使用能夠與表面結(jié)合的匹配化合物(如鏈親合素)連接的生物素化特定化合物，則可能將特定分子結(jié)合到涂層上。所述涂層可通過表面結(jié)合的匹配化合物(如抗微生物蛋白>或特定化合物的量化而在體外進(jìn)行表征。這可通過例如匹配化合物(如鏈親合素)的銪標(biāo)記或生物素化特定化合物的銪標(biāo)記而實(shí)現(xiàn)。以下實(shí)施例提供了本發(fā)明的更進(jìn)一步的非限制性范例。簡(jiǎn)言之，實(shí)施例l描述了使官能團(tuán)分布在基材上以制備用于高分子結(jié)合的表面。實(shí)施例2是具有共價(jià)連接的可聚合基團(tuán)的引發(fā)子(引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑)的合成，其與稀釋劑單體共聚為實(shí)施例3中的高分子。實(shí)施例4示范了將實(shí)施例3的高分子共價(jià)連接到實(shí)施例1的功能化基材上。實(shí)施例5至8例舉了從實(shí)施例4的高分子涂覆基材上接枝不同的均聚物。所得涂覆基材然后在實(shí)施例9中使用，以示范所述涂層提供可控生物應(yīng)答(即減少細(xì)胞附著)的能力。實(shí)施例10至14例舉了從實(shí)施例4的高分子涂覆基材上接枝不同的共聚物。具體而言，這些實(shí)施例示范了可采用本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)受控結(jié)構(gòu)。實(shí)施例15示范了含有可共聚生物素的另一種涂層，其包括用于制備涂層的可聚合生物素衍生物的合成。實(shí)施例16例舉了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式采用通過共聚引入到高分子中的ATRP引發(fā)子來制造涂層的方法。實(shí)施例17示范了含有可共聚的N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺的另一種涂層的合成，以及使用這樣的涂層結(jié)合五肽從而調(diào)控涂覆基材的細(xì)胞結(jié)合性質(zhì)。實(shí)施例18提供了由含有不同密度的引發(fā)子部分的高分子涂層合成的聚合物涂層間的比較。實(shí)施例19示范了根據(jù)本發(fā)明制造的涂層的穩(wěn)定性。實(shí)施例20例舉了用于將高分子結(jié)合到基材上從而形成高分子涂層的另一種方法。實(shí)施例21示范了采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合的另一種涂層的合成。實(shí)施例22示范了采用星形聚合物引發(fā)子的另一種涂層的合成。25實(shí)施例23示范了可用于采用點(diǎn)擊化學(xué)軛合分子的另一種涂層的合成。實(shí)施例24示范了進(jìn)行接枝聚合的同時(shí)掩蔽樣品的效果。實(shí)施例25示范了引入交聯(lián)的涂層的合成。實(shí)施例26示范了含有共聚寡肽的另一種涂層的合成。實(shí)施例27示范了根據(jù)本發(fā)明制備的涂層的一致性和均勻性。這種涂層。實(shí)施例29示范了表面梯度接枝聚合物涂層的合成。實(shí)施例實(shí)施例l在硅晶片基材上沉積正庚胺射頻輝光放電(RFGD)薄膜在2%RBS表面活性劑溶液中超聲30分鐘，隨后用Milli-QTM水和乙醇徹底沖洗，從而清潔尺寸為lcmx1cm的硅晶片(Si)。在用高速純N2氣流干燥后，立即將晶片放入在他處已描述的射頻輝光放電等離子反應(yīng)器中[GriesserHJ.，Vacuum39(1989)485]。在20W功率，200KHz頻率和0.150Torr起始單體壓力下，進(jìn)行30秒的正庚胺等離子聚合物(HAPP)薄膜的沉積。表1中列出的是HAPP薄膜沉積前后的元素比。由采用X-射線光電子譜(XPS)得到的兩個(gè)樣品的表面組成計(jì)算元素比。第一關(guān)注點(diǎn)是Si/C比例在表面改性后由12.10減少至0.00,表明HAPP薄膜至少與XPS取樣深度(約IOnm)—樣厚，并且涂層沒有針孔。由于在從等離子室中取出時(shí)自由基的猝滅使得薄膜中存在氮(N/C比例為0.086)以及少量氧。與改性前在si晶片表面上的原有氧化物涂層中存在的o/c比例相比，由于在薄膜中存在的少量氧原子而使表面改性后的0/C比例減小。HPAA薄膜本質(zhì)上主要是碳質(zhì)的，并且碳主要是脂肪族的(由高解析度Cls譜推斷(參見圖l(a))，其中主要部分集中在285eV的結(jié)合能)。膜中存在的氮幾乎全部源自于表面氨基基團(tuán)。這可由高解析度Nls譜的結(jié)合能，即399.39eV(參見圖l(b))進(jìn)行推斷。HAPP薄膜表面上存在氨基可用于后續(xù)高分子的共價(jià)連接。表1:由XPS分析測(cè)定的原子組成計(jì)算而得的經(jīng)HAPP薄膜沉積進(jìn)行硅晶片樣品表面改性前后的元素比例<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例2二乙基二疏代氨基甲酸4-乙烯基-苯曱酯的合成將三水合二乙基二硫代氨基曱酸鈉(3.5g,1.55xl(T2mol)在20ml乙醇中的溶液加入到配有攪拌器、滴液漏斗和回流冷凝器的燒瓶中。在0。C經(jīng)過0.5小時(shí)的時(shí)間，向此溶液中逐滴加入4-乙烯基苯曱酰氯(3.0g,1.96xl(T2mol)和乙醇(5ml)。所得溶液在室溫?cái)嚢?4小時(shí)，然后導(dǎo)入大量水中，并用二乙基醚萃取。醚相用水清洗三次，硫酸鈉干燥，并最終經(jīng)蒸發(fā)除去二乙基醚。殘留物從曱醇中重結(jié)晶三次得到2.6克的產(chǎn)率(83%)。!HNMR(CDCl3)57.36(s，4H,C6H4),6.70(dd，/=11.6和17.5Hz，1H，C7/=CH2),5.73(d,/=17.5Hz，1H，CH=CH2)，5.24(d,/=11.5Hz，1H，CH=C//2),4.54(s,2H，C//2S),4.04(q，/=7.3Hz,2H,NC//2)，3.73(q,J^6.6Hz,2H，NC/f2)，1.19(t,J-ca.7.0Hz，6H，CH2C//》.實(shí)施例3含有羧酸部分和引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分的聚合物的合成丙烯酸(3.0g，4.16xl(T2mol，無水，F(xiàn)luka)溶解在6ml二甲基曱酰胺(DMF)(BDHchemicals)中，隨后將溶液通過含有抑制劑去除劑的柱子(Aldrich)從而除去抑制劑。向所述丙烯酸溶液中加入l.lg二乙基二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯(4.38xlo-2mol)(來自實(shí)施例2)和150mgAIBN，隨后所述溶液用氮吹掃10min并密封。在6(TC加熱過夜，導(dǎo)致形成不透明的粘性凝膠，隨后再加入20ml的DMF稀釋。含有共聚物的溶液針對(duì)DMF透析(SpectmmSpectra/Porl分子多孔膜管，截至MW6000-8000)過夜。在透析期間更換兩次DMF。透析管中內(nèi)容物隨后轉(zhuǎn)移到燒瓶中并補(bǔ)足至50mL最終體積。最終的聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯曱酯)共聚物(PI)經(jīng)定量)3CNMR進(jìn)行表征。(13CNMR(DMFH7/DMFD7，500MHz;"0.7，11.4,32.7,39.78,40.66，41.01,41.44,46.03,48.59,127.41,128.61,133.5,142.6,169.7(C=0)，171.55(C=0)，173.79(C=0)，175.67(C=0),193.66(C=S))。通過對(duì)應(yīng)于C-S(來自二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯)和00(來自丙烯酸)殘基的峰積分，得到二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯與丙烯酸殘基的相對(duì)比例。該方法給出1.0:10.7的C-S:CK)比例，這對(duì)應(yīng)于含有8.5:91.5mol。/。的二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯:丙烯酸的聚合物。實(shí)施例4聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯)與HAPP修飾硅晶片的共價(jià)偶聯(lián)(Si-HAPP-PI)經(jīng)合成具有大約9:91mol。/。的二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯丙烯酸的來自實(shí)施例3的PI共聚物的共價(jià)固定是通過將實(shí)施例1的HAPP涂覆硅晶片與PI共聚物溶液進(jìn)行保溫而實(shí)現(xiàn)的(參見以下內(nèi)容)。向含有6mLDMF和1mLMilli-QTM水的混合物中加入2mL含有8.2。/。(w/v)共聚物(PI)的DMF溶液。然后將IOOmgiV-(3-二曱基氨基丙基)-iV-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(Sigma)(EDC)溶解在所述溶液中，并加入新制的HAPP涂覆硅晶片。在室溫保溫過夜，隨后在DMF和Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表2中列出在PI共聚物的共價(jià)固定之后通過HAPP修飾硅晶片的XPS分析得到的元素比例，與HAPP修飾的硅晶片相比。0/C比例明顯高于HAPP修飾硅晶片。這部分由于HAPP層的氧化，并且也由于在共價(jià)偶聯(lián)的PI共聚物中存在丙烯酸殘基。此外，N/C比例減小并且在PI共聚物層中檢測(cè)到硫。表2:由Si-HAPP和Si-HAPP-PI樣品的XPS分析得到的元素比例。O/CN/Cs/cSi-HAPP0.0400.0860.000Si畫HAPP-PI0.3850.055o駕在圖2中也顯示了由Si-HAPP-PI樣品表面獲得的代表性高解析度Cls譜圖，其含有位于下方的HAPP基材和共價(jià)固定PI共聚物層的典型特征，尤其是由于羧酸殘基的存在而在Cls譜圖中存在特征部分(289.2eV結(jié)合能)。實(shí)施例5Si-HAPP-PI表面上PEGMA(475)單體的接枝聚合將實(shí)施例4的Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了分子量為475的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(PEGMA(475))在Milli-QTM水中的10。/。(v/v)溶液，已從其中除去S1發(fā)子，并將純氮?dú)鈱?dǎo)入其中以從單體溶液中除去氧氣。然后將小室以10cm的距離放置在Electro-liteEL-C800UY/可見光源下。UV聚合進(jìn)行30分鐘(30mWcm^雖度；主要為365nm波長)。在輻射后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表3列出了在表面接枝P(PEGMA(475))之前和之后由Si-HAPP-PI樣品的XPS分析得到的元素比例。此處，接枝后的0/C比例由于P(PEGMA(475))組成中大量的氧(理論0/C=0.667)而明顯增加。還纟企測(cè)到由于在Si-HAPP-PI基材頂部存在P(PEGMA(475))層則N/C比例下降。表3:由Si-HAPP-PI和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))樣品的XPS分析測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>通過高解析度C1s譜圖中大量分布的醚(C-O)碳(參見圖3中286.6eV的結(jié)合能)可以確定P(PEGMA(475))涂層的存在，其厚度在此情況下非常接近于XPS取樣深度。實(shí)施例6Si-HAPP-PI表面上丙烯酰胺單體的接枝聚合將實(shí)施例4的Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了丙歸酰胺在Milli-QTM水中的5。/o(v/v)溶液。將小室以IOcm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行20分鐘(大約280mWcn^強(qiáng)度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表4:經(jīng)P(丙烯酰胺)接枝進(jìn)行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI樣品的<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例7Si-HAPP-PI表面上葡糖苷MA單體的接枝聚合將實(shí)施例4的Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了2-曱基丙烯酰氧基乙基葡糖苷(葡糖苷MA，Polysciences)在Milli-QTM水中的10%0)溶液，已從其中除去引發(fā)子。將小室以IOcm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行20分鐘(大約280mWcm々強(qiáng)度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表5:經(jīng)P(葡糖苷MA)接枝進(jìn)行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI樣品的XPS分析得到的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表5中歹'J出的是經(jīng)P(葡糖苷MA)接枝進(jìn)行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI樣品表面得到的元素比例。接枝反應(yīng)對(duì)表面元素比例的影響清楚地表現(xiàn)為o/c比例的顯著增力口(由于涂層中大量的位于每個(gè)葡萄糖殘基上的羥基)以及由于Si-HAPP-PI基材頂部存在P(葡糖苷MA)涂層導(dǎo)致的N/C比例下降。通過獲得高解析度Cls謙圖可確認(rèn)涂覆過程的成功，譜圖的代表性例子顯示在圖5中。所述譜圖包含位于286.7eV結(jié)合能的由于鍵接于羥基的碳形成的特征部分。實(shí)施例8Si-HAPP-PI表面上季胺MA單體的接枝聚合將實(shí)施例4的Si-HAPP-PI樣品放置在用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了[3-(曱基丙烯酰氧基氨基)丙基]-三曱基氯化銨(季胺MA,Aldrich)在Mim-QTM水中的10。/o(v/v)溶液，已從其中除去引發(fā)子。在通入10分鐘氮?dú)庖詮膯误w溶液中除去溶解的氧之后，將小室以IOcm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行20分鐘(大約280mWcm^雖度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表6中列出的是經(jīng)P(季胺MA)接枝進(jìn)行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI樣品表面得到的元素比例。接枝反應(yīng)對(duì)表面元素比例的影響清楚地表現(xiàn)為O/C比例的顯著增加以及由于Si-HAPP-PI基材頂部的P(季胺MA)涂層中存在氮導(dǎo)致的N/C比例下降。表6:經(jīng)P(季胺MA)接枝聚合進(jìn)行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI樣品的XPS得到的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>通過獲得高解析度C1S譜圖可確認(rèn)涂覆過程的成功，譜圖的代表性例子顯示在圖6中。所述語圖包含位于286.6eV結(jié)合能的接枝層中的C-N鍵形成的特征部分，以及Nls譜圖中季胺所特有的高結(jié)合能部分(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例9細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)將HeLa細(xì)胞接種在一系列尺寸為lcmx1cm的硅晶片上。每種表面改性采用三份重復(fù)樣品。在細(xì)胞附著試驗(yàn)之前，4°C,將樣品浸在24-孔組織培養(yǎng)支架的單獨(dú)孔中的2xpen/strep(100/200嗎/mL)中過夜。然后將HeLa細(xì)胞以每孔2x105細(xì)胞的密度進(jìn)行接種并培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)的最后四小時(shí)用MTT代謝地標(biāo)記三份重復(fù)樣品。細(xì)胞附著結(jié)果以相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)底物組織培養(yǎng)聚苯乙烯(TCPS)進(jìn)行表示。如表7所示，對(duì)于所有接枝聚合物實(shí)現(xiàn)了所希望的受控生物應(yīng)答，即，與TCPS對(duì)照表面相比細(xì)胞附著的明顯降低。不僅在接枝聚合物上細(xì)胞數(shù)目減少，而且保持附著的那些細(xì)胞也不能有效鋪展，如其圓形形態(tài)所表明(圖7)。此外，還應(yīng)注意到Si、Si-HAPP和Si-HAPP-PI對(duì)照表面均顯示出相對(duì)于TCPS的高細(xì)胞附著(75.2%和86.5%之間)。表7:24小時(shí)后以。/。表示的相對(duì)于TCPS的HeLa細(xì)胞附著結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例IOSi-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)共聚物涂層的制備孝為、丄'^",合華法#(^^/"〃>^衍_^*「磁磁凝2-/"2-(2-/"2-/2-(2-^^_《舉瘋真4)-乙真4/-乙真4/-乙真差)-乙真4/_乙差凝2-真-3-f3-真7"差>2//-悉雄-4-差游丌華法^M"的合成。華法林(3.93g，12.8mmol)在室溫懸浮于二氯曱烷(50mL)中。加入三乙胺(1.9mL，1.4g，13.9mmol)導(dǎo)致華法林的溶解。在二氯曱烷(ca.10-15mL)中的聚(乙二醇(360))曱基丙烯酸酯琥珀酸酯(5.43g，11.6mmol)的鹽酸化物在室溫逐滴加入到華法林溶液中，攪拌約1小時(shí)。反應(yīng)混合物用水清洗(除去未反應(yīng)的華法林)，在干燥(硫酸鎂)前用鹽酸和鹽水稀釋。經(jīng)蒸發(fā)除去溶劑得到淺色油狀產(chǎn)品(9.1g)。這似乎含有痕量的未反應(yīng)華法林和二氯曱烷。油狀物溶解在醚和最少量的二氯曱烷中，用1M氫氧化鈉清洗兩次，用稀鹽酸清洗兩次并用鹽水清洗一次，隨后干燥并通過蒸發(fā)除去溶劑。'HMNR(CDCl3,200MHz)5.93(s，曱基丙烯酸曱酯，3H)，2.14(s.曱基，3H),2.82(mult，2H)，3.06(mult，H),3.44(d,J7.3Hz,華法林CH2，2H),3.62(s,PEGCH2)，3.72(br.s，PEGCH2,2H)，4,26(表觀上tJca.5Hz,PEGCH2，2H),4.80(brs，1H),5.54(br,s，CH,1H),6.10(br,s,=CH,1H),7.16-7.40(multi，芳香氪)，7.43-7.53(multi.芳香氬)ppm。&'-"尸尸-尸/或面J:尸五GM4~75卩和爭(zhēng)法W:M4的;遂合參的接炎果合將Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了在20mLDMF中含有1.06g(2.23xl(T3mol)PEGMA(475)、0.41g(5.66xl(T4mol)華法林MA的溶液(PEGMA(475)與華法林MA的摩爾比為8:2)。在通入15分鐘氮?dú)夂螅瑢⑿∈乙?0cm的距離放置在Electro-liteEL-C800UV/可見光源下。利用UV輻射進(jìn)行30分鐘聚合(30mWcm々強(qiáng)度，主要為365nm)。然后從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表8:經(jīng)Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si畫HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)樣品的XPS分析得到的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表8中列出的是在表面上接枝P(PEGMA(475)-共-華法林MA)涂層之前和之后，Si-HAPP-PI樣品的XPS分析得到的元素比例。還包括在內(nèi)進(jìn)行比較的是由接枝P(PEGMA(475))均聚物涂層獲得的數(shù)據(jù)。所得0/C比例處在由Si-HAPP-PI和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)樣品獲得的0/C比例之間，正如可由同時(shí)含有PEGMA(475)(理論0/C=0.477)和華法林MA(理論0/C=0.359)的接枝共聚物層所預(yù)測(cè)的。根據(jù)N/C比例，P(PEGMA(475)-共-華法林MA)層的脫水厚度似乎略小于P(PEGMA(475))層。圖8中顯示的是由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)樣品表面獲得的高解析度ClsXPS譜圖。至于0/C比例，由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)樣品獲得的Cls譜圖特性應(yīng)處于由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI樣品獲得的特性(參見實(shí)施例4)之間。區(qū)別于圖7中所顯示的譜圖的特征是對(duì)由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-華法林MA)樣品獲得的譜圖有貢獻(xiàn)的脂肪族烴類和酯的相對(duì)強(qiáng)度的增加。對(duì)譜圖的各種貢獻(xiàn)的更詳細(xì)分析指出PEGMA(475)與華法林MA的摩爾比接近于在單體原料中存在的摩爾比。實(shí)施例llSi-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-6-丙烯酰胺)雙嵌段共聚物涂層的制備將Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了在Milli-Qtm水中的PEGMA(475)的10。/。(v/v)溶液，已從其中除去引發(fā)子。在通入10分鐘氮?dú)夂螅瑢⑿∈乙?0cm的距離放置在Electro-liteEL-C800UV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行30分鐘(約30mWcm^強(qiáng)度)。然后從小室中取出樣品并在Mmi-QTM水中仔細(xì)清洗。對(duì)于第二階段聚合，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))樣品再次放置在干凈小室中，并充滿在Milli-QTM水中的丙燁酰胺的5。/o(w/v)溶液。在通入10分鐘氮?dú)夂?，再次將小室以IOcm的距離放置在Electro-liteEL-C800UV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行30分鐘(約30mWcm^雖度)。最后從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表9:Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-b-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。樣品O/CN/Cs/cSi-HAPP-PI0,3850.0550.028Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))0.4760扁0細(xì)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-6-P(丙烯酰胺)0.3950.1680扁表9中列出的是由XPS分析測(cè)定的樣品表面組成計(jì)算而得的元素比例。此處我們可以看到兩階段涂覆過程形成初步P(PEGMA(475))涂層(增加的0/C，減少的N/C)，隨后是第二成功的P(丙烯酰胺)涂層(減少的0/C和增加的N/C)。在第一層頂部形成第二聚合層的能力證實(shí)了在此情況下聚合的活性性質(zhì)(即，在涂覆過程的第一階段中引發(fā)子位于P(PEGMA(475))鏈的末端并可供用于引發(fā)第二階段中P(丙烯酰胺)鏈的聚合。在圖9中顯示的是相比純P(PEGMA)均聚物涂層的代表性高解析度ClsXPS譜圖。此處我們可以看到由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-b-AAm)獲得的譜圖是P(丙烯酰胺)涂層的合理表示，但來自位于下方的P(PEGMA(475))涂層的特征(醚碳)依然是明顯的，表明實(shí)施例12Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-PEGMA(475))雙嵌段聚合物涂層的制備35將Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了在Milli-QTM水中的丙烯酰胺的5。/。(v/v)溶液。在通入IO分鐘氮?dú)夂?，將小室?0cm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行20分鐘(約280mWcm^強(qiáng)度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。對(duì)于第二階段聚合，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品再次放置在干凈小室中，所述干凈小室充滿了在Milli-QTM水中的PEGMA(475)的10。/。(w/v)溶液，已從其中除去31發(fā)子。在通入10分鐘氮?dú)夂?，再次將小室以IOcm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行20分鐘(約280mWcm—2強(qiáng)度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表10:由Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-PEGMA(475))樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>以與以上實(shí)施例11中所示的類似方式，在表10中列出的是通過對(duì)制備Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-PEGMA(475))雙嵌段聚合物涂層的兩階段涂覆過程的XPS分析測(cè)定的元素比例。在此情況下，涂覆過程的順序與實(shí)施例ll中所述的相反。在丙烯酰胺單體溶液中的表面引發(fā)聚合形成初始P(丙烯酰胺)涂層(減少的0/C和增加的N/C)。用P(PEGMA(475))的第二階段涂層導(dǎo)致增加的0/C和減少的N/C值。在第一層頂部形成第二聚合層的能力證實(shí)了在此情況下聚合的活性性質(zhì)(即，在涂覆過程的第一階段中引發(fā)子位于P(丙烯酰胺)鏈的末端并可供用于引發(fā)第二階段中P(PEGMA(475))鏈的聚合。在圖10中顯示的是由Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-PEGMA(475))涂層獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖，并且與P(丙烯酰胺)涂層相比。此處我們可以看到所述語圖是P(PEGMA(475))涂層的合理表示，但來自位于下方的P(丙烯酰胺)涂層的特征依然是明顯的(較高的較低結(jié)合能脂肪族和酰胺碳部分)，表明XPS對(duì)位于P(PEGMA)層以下的P(丙烯酰胺)涂層進(jìn)行了取樣。實(shí)施例13Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-季胺MA)雙嵌段聚合物涂層的制備將Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了在Milli-QTM水中的丙烯酰胺的5。/。(v/v)溶液。在通入IO分鐘氮?dú)夂?，將小室以IOcm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行20分鐘(約280mWcm^強(qiáng)度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-Q水中仔細(xì)清洗。對(duì)于第二階段聚合，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品再次放置在干凈小室中，所述干凈小室充滿了在Milli-QTM水中的[3-(曱基丙烯酰氧基氨基)丙基]-三甲基氯化銨(季胺MA，Aldrich)的10。/o(w/v)溶液。在通入10分鐘氮?dú)夂?，再次將小室?0cm的距離放置在SpectrolineSB-100C/FUV/可見光源下。UV聚合再次進(jìn)行20分鐘(約280mWcm々強(qiáng)度)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表ll:由Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-季胺MA)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>考慮表ll中所列的數(shù)據(jù)，表明實(shí)現(xiàn)了p(丙烯酰胺)的成功接枝，在第一步中脫水層厚度為10nm量級(jí)，由接枝后N/C從0.055增加至0.228,以及0/C值減少所表明。根據(jù)降低的0/C和N/C比例，第二階段聚(季胺MA)層的聚合物接枝也是成功的。然而，元素比例表明P(季胺MA)脫水層厚度小于10nm。由于顯示了P(丙烯酰胺)和P(季胺MA)層的特征部分(酰胺和C-N碳)，如圖ll所示的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-季胺MA)表面Cls高解析度譜圖支持根據(jù)表面涂層各個(gè)階段的元素比例得出的結(jié)論。包含酰胺(來自P(丙烯酰胺)層)和季胺(來自P(季胺MA)層)特征部分的高解析度XPSN1s譜圖(未示出)也提供了進(jìn)一步的證據(jù)。實(shí)施例14Si畫HAPP-PI-P(PEGMA(475)-6-(丙烯酰胺-共-PEGMA(475)))雙嵌段共聚物涂層的制備將Si-HAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。小室中充滿了在Milli-QTM7JC中的PEGMA(475)的10。/。(v/v)溶液，已從其中除去引發(fā)子。在通入10分鐘氮?dú)夂?，將小室?0cm的距離放置在Electro-liteEL-C800UV/可見光源下。UV聚合進(jìn)行30分鐘(約30mWcm^強(qiáng)度；主要為365nm波長)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。對(duì)于第二階段聚合，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))樣品再次放置在干凈小室中，所述干凈小室充滿了在Milli-QTM水中的摩爾比為8:2的丙烯酰胺和PEGMA(475)的5。/0(w/v)溶液。在通入10分鐘氮?dú)夂?，再次將小室以IOcm的距離放置在Electro-liteEL-C800UV/可見光源下。UV聚合再次進(jìn)行30分鐘(約30mWcm^強(qiáng)度；主要為365nm波長)。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中仔細(xì)清洗。表12:由Si畫HAPP畫PI、Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP畫PI-P(PEGMA(475)-6-(丙烯酰胺-共-PEGMA(475)))樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>在表2中列出的是從接枝聚合物表面改性的兩個(gè)階段的樣品的XPS分析得到的原子比例。對(duì)于第一階段，即Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))均聚物涂層的制備，所得的0/C和N/C比例表明得到的P(PEGMA(475))涂層具有XPS取樣深度量級(jí)的脫水厚度。第二階段是摩爾比為80:20的丙烯酰胺和PEGMA(475)的共聚。得到的N/C比例增加和0/C比例減少表明在初始P(PEGMA)層頂部的第二嵌段的成功聚合，并且該層具有摻入其中的丙烯酰胺。由于在兩層中均存在PEGMA,因此不可能估計(jì)第二嵌段的厚度?；谠乇壤龜?shù)據(jù)的結(jié)論可由兩個(gè)樣品的高解析度Cls譜圖(參見圖12)的對(duì)比而確認(rèn)。由第二階段獲得的譜圖清楚地包含可由PEGMA(強(qiáng)的醚貢獻(xiàn))和丙烯酰胺(增加的脂肪族烴類和酰胺貢獻(xiàn))預(yù)期到的特征。實(shí)施例15Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)共聚物涂層的制備^"菜合蘭*;#衍_^*(2-f差-^舉虔2-卩-"-(2-真-六產(chǎn)-^勞、#/"3,^/^^^-差>茂凝瘋4/-乙真4/_乙差幾)(^參,M"的合成。6-(5-乙基-2-氧-咪唑啉-4-基)-6-巰基-己酸[2-(2_羥基-乙氧基)-乙基]-酰胺(生物素化醇)按照文獻(xiàn)中報(bào)道的方式合成(Qi，K等，J.Am.Chem.Soc,2004,126,6599,補(bǔ)充信息部分)。將該化合物(1.60g,4.85mmol)、甲基丙烯酸(0.927g，10.77mmol)、4-(二曱基氨基)處啶(1.347g，11.02mmol)、1,3-二環(huán)己基碳二亞胺(4.056g，15.29mmol)(DCC)和二氯曱烷(125mL)放入配備有磁力攪拌器的250mL圓底燒瓶。反應(yīng)在35°C,N2下攪拌5天。反應(yīng)混合物經(jīng)過濾，濾出液在氯仿(200mL)和鹽水(200mL)間分配。分離氯仿層，干燥(MgS04)并蒸發(fā)至干得到白色糊狀物。該白色糊狀物用二乙基醚很好地進(jìn)行清洗，并棄去清洗物。剩余固體還有產(chǎn)物和一些DCC-尿素副產(chǎn)物。然后將該固體產(chǎn)物溶解在最少量的二氯曱烷中并通過含有硅膠(硅膠8385)的色譜柱，所述色譜柱用5%曱醇的氯仿溶液進(jìn)行預(yù)處理。DCC-尿素副產(chǎn)物先^L洗脫，隨后是所需的可聚合生物素衍生物。所使用的洗脫溶劑系統(tǒng)是5%曱醇的氯仿溶液。收集的所有餾分經(jīng)薄層色譜(硅膠，含有可聚合生物素的餾分碘染色后呈淡棕色)分析。在合并含有純凈產(chǎn)物的餾分前獲取所有單獨(dú)餾分的iHNMR譜圖以檢查純度。在蒸發(fā)至干得到白色固體之前，于該階段中將穩(wěn)定劑(4-曱氧基苯酚，2mg于二氯曱烷中)加入到純產(chǎn)物中(1.30g,產(chǎn)率66.4°/。)。NMR(MeOD，400MHz"1.39-1.78(m,6H,CH7C/T2CH2CH2CON),1,94(s，3H,2.20(t，J^7.27Hz，2H,Ci/2CON),2.70(d，/=12.73Hz,1H,生物素單元中的一個(gè)C^S),2.90(dd,J=4.60Hz和12.73Hz,1H,生物素單元中的一個(gè)C^2S),3.173-3.221(m,1H，生物素單元的C好S),3.34畫3.37(m,2H,Ciy2N),3.55-3.57(m,2H,C樂O),3.70-3.73(m，2H,C恥)，4.27-4.31(m，3H，生物素單元的C/TCHS和C/T20)，4.47-4.50(m，1H,生物素單元的C/7CH2S),5.63(br.s，1H,CH"乙烯基)，6.11(br.s，1H，Ci/乙烯基)ppm。13CNMR(MeOD，400MHz》18.59，26.99,29.64,29.89，36.88，40.46，41.18,48.51,48.73,48.94,49.15，49.36，49.58,49.79，57.14,61.78,63.52,65.23,70.06，70.77ppm.命為^:J^4P尸-尸/《面J:丙雄應(yīng)廢和i參,M4的;遂合務(wù)的接戎,合。除使用丙烯胺替代正庚胺之外，按照實(shí)施例l(針對(duì)Si-HAPP)制備Si-ALAPP表面。在20W功率，200kHz和0.25Torr起始單體壓力，進(jìn)行30秒丙烯胺等離子聚合物(ALAPP)薄膜的沉積。按照實(shí)施例4進(jìn)行PI共聚物的共價(jià)固定以制造Si-ALAPP-PI表面。將其放入用戶定制的配有石英玻璃蓋的PVDF室中。向小室中加入含有(i)82mg可聚合生物素、300mg丙烯酰胺和6mlDMF(5mol.%;Si-ALAPP-PI-P(丙晞酰胺-共-5。/o生物素MA))或(ii)174mg可聚合生物素，300mg丙烯酰胺和6mLDMF(10mol.%;Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA))的溶液。在每種情況下的單體溶液中鼓入純凈氮?dú)?0分鐘以除去溶解的氧。在鼓氣后，關(guān)閉入口和出口閥門。使用EXFOArticure400燈將樣品暴露于UV輻射(320-500nm波長；50mWcm々強(qiáng)度)30分鐘。在輻射后，取出樣品在DMF中清洗三次，2小時(shí)，浸泡在新鮮DMF中過夜，然后放置于新鮮DMF中兩天，偶爾進(jìn)行晃動(dòng)。最后，在5小時(shí)的時(shí)間段里，將樣品在MilliQTM水中清洗五次。在室溫，將Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)樣品液過夜暴露于生物素結(jié)合蛋白(50嗎/mL，HEPES緩沖液中)，隨后用1MNaCl(兩小時(shí)內(nèi)兩次，然后過夜)和HEPES緩沖液(兩小時(shí)內(nèi)3次)，并最終在干燥前，在半小時(shí)時(shí)間段里，在MilliQTM水中沖洗五次。HEPES40緩沖液含有150mMNaCl和20mM[4-(2-羥基乙基)-l-哌漆乙烷磺酸，鈉鹽](HEPES)并用1MNaOH溶液調(diào)至pH7.2。表13中列出的是由Si-ALAPP樣品和Si-ALAPP-PI樣品的XPS分析得到的元素比例。可以觀察到Si-ALAPP樣品僅含有C、O和N，且所得到的0/C比例極低。Si-ALAPP表面上含有引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分(聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯))的高分子的共價(jià)偶聯(lián)導(dǎo)致加入明顯更多的氧(0/C=0.186),減少的氮含量以及由于存在引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分而加入的硫。由Si-ALAPP-PI-P(丙蜂酰胺-共-5%生物素MA)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)表面得到的0/C和N/C元素比例明顯高于Si-ALAPP-PI表面，這表明在兩種情況下聚合反應(yīng)都是成功的。此外，由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)獲得的N/C比例低于Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-5%生物素MA),這表明正如預(yù)測(cè)一樣在聚合中更少的丙烯酰胺加入到聚合物鏈中。由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-5。/。生物素MA)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)表面獲得的元素比例明顯不同于Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面，表明生物素成功地加入到涂層中。還包括在表13中的是在暴露于生物素結(jié)合蛋白NeutrAvidin之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)表面獲得的元素比例。如果加入到接枝聚合物鏈中的生物素部分是生物活性的(即能通過配體受體相互作用與NeutrAvidin分子相互作用)，則在與NeutrAvidin溶液保溫后，NeutrAvidinTM分子將非常強(qiáng)地結(jié)合至Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共陽生物素MA)表面。在與NeutrAvidinTM保溫前后由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)樣品得到的元素比例的比較(增加的O/C、N/C和減小的S/C)清楚地表明有大量與聚合物涂層相結(jié)合的NeutrAvidin,并且在大量沖洗過程后依然存在。由樣品的高解析度XPS分析能得到更多的信息。由Si-ALAPP和Si-ALAPP-PI樣品表面獲得的代表性高解析度Cls譜圖顯示在圖13中。對(duì)于兩個(gè)樣品所獲得的峰形非常不同。具體而言，在Si-ALAPP-PI的鐠圖中存在較高結(jié)合能特征部分，是羧酸的典型特征，表明含有引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分(PI共聚物)的高分子偶聯(lián)至Si-ALAPP表面是成功的，支持了以上敘述的低解析度分析(參見表13)。此外，不同高解析度Cls譜圖之間的差異可通過經(jīng)曲線擬合程序進(jìn)行的各種譜圖特征部分的去巻積而進(jìn)行量化(見表14)。在此表中，各種譜圖貢獻(xiàn)部分標(biāo)為Cl+C2/C(烴)，C3(C-0/C-N)，C4(CK))和C5(0-CK)),具有相應(yīng)越來越高的結(jié)合能。在表14(a)中列出由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)、Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5°/。生物素MA)、Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)樣品以及過夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素MA結(jié)合蛋白溶液(50ji/mL，HEPES緩沖液中)之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)樣品得到的譜圖的比較。表13:由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)、Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5。/。生物素MA)、Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)樣品以及過夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素MA結(jié)合蛋白溶液(50M/mL，HEPES緩沖液中)之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例才羊品O/C"N/Cs/cSi-ALAPP0.0360.176o細(xì)Si-ALAPP-PI0.1670,1200.001Si-ALAPP-P(丙烯酰胺)0.2900.2370.001Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5。/。生物素MA)0.2910.2370.014Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)0.3170.1880.023Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)-NA0.3150.2400.007在由每個(gè)樣品獲得并顯示在圖14(a)中的譜圖的形狀之間都有明顯不同。例如，Si-ALAPP-P(丙烯酰胺)樣品在285和288.2eV具有兩個(gè)主要的特征部分。生物素部分的加入導(dǎo)致C3特征部分的增加，這在加入的生物素量由5mol。/。增加至10mol。/。時(shí)更加顯著。Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10°/(>生物素MA)樣品暴露于NeutrAvidinTM溶液導(dǎo)致C3和C4特征部分的增加，這是存在蛋白質(zhì)的典型結(jié)果。這些差異已經(jīng)過曲線擬合程序進(jìn)行量化，并列在表14中便于比較。對(duì)于Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品，暴露于NeutrAvidinTM溶液(室溫過夜，50嗎/mL，HEPES緩沖42液中)未明顯改變高解析度Cls譜圖(參見圖14(b)),指出是由于存在生物素部分而導(dǎo)致NeutrAvidinTM的結(jié)合。此外，通過暴露于人血清白蛋白(HAS,100嗎/mL,在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，37°C，2小時(shí))進(jìn)一步說明了Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)對(duì)蛋白吸附的抵抗。由圖14(b)可以看到三張譜圖(Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品，暴露于人血清白蛋白(HSA)前后的樣品，暴露于NeutrAvidinTM前后的樣品)幾乎完美地重合，指出用XPS技術(shù)沒有蛋白吸附可被檢測(cè)到(<~10ng/cm2)。表14:由Si-ALAPP，Si-ALAPP-PI，Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)，Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5。/。生物素MA),Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%生物素MA)樣品以及過夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素MA結(jié)合蛋白溶液(50fo/mL，HEPES緩沖液中)之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10。/。生物素MA)樣品得到的曲線擬合ClsXPS譜圖得到的高解析度Cls譜圖特征部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例16采用ATRP引發(fā)的Si-ALAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))涂層的制備甲果^477^//發(fā)"^2-f差-丙雄凝-(2-^-2-f差-丙教真差」-乙差游;的合成將2-溴異丁酰溴(5.79g，0.0252mol,l.l摩爾當(dāng)量(ME))的乙酸乙酯溶液(15mL)逐滴加入到預(yù)先在N2下冷卻至0。C的三頸圓底燒瓶中的曱基丙烯酸2-羥基乙酯(HEMA)(2.978g，0.02289mol,1ME)和三乙胺(2.77g，0.0275mol，1.2ME)的乙酸乙酯溶液(50mL)。反應(yīng)混合物加熱至室溫并攪拌過夜。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，溶解在二氯曱烷(50mL)中，清洗(2。/oK2C03)并通過硅膠圓柱體(1.09385.1000，Merck)。濾出液蒸發(fā)至干得到透明無色油狀產(chǎn)物(4.3g,67.4%產(chǎn)率)。加入4-曱氧基苯酚(MEHQ)(lmg)作為抑制劑。^NMR(CDCl3,400MHz>51.91(s，6H，(OT3)2C(Br)COO-)，1.93(s，3H,Ci73C(CH2)COO-),4.40(br.s，4H,-OCi^2Ci720-)，5.57(s,1H，乙烯基CH0，6.12(s,1H,乙烯基C用ppm。13CNMR(CDC13，400MHz)18.17，30.59,30.68，55.29,61.84，63.46，126.06,135.81,166.90，171.34ppm。命為、S:含^"凌^^^77Pf/發(fā)f命為、的^^參(7M77P/^菜一勿的合成將丙烯酸(1.5g，2.08xl0-2摩爾，無水)加入到5mL二曱基曱酰胺(DMF)中，隨后通過將溶液流經(jīng)含有抑制劑去除劑(Aldrich)的柱子除去抑制劑。在加入0.581g(2.0815xl(y3mol)2-甲基-丙烯酸-(2-溴-2-曱基-丙酰氧基)-乙基酯(10mol%)和75mg2-2'-偶氮二異丁腈(AIBN)之后，溶液中鼓入氮?dú)?0分鐘并密封。在60。C加熱過^f^形成白色沉淀，通過再加入IOmlDMF而溶解。含有共聚物的溶液隨后針對(duì)DMF透析(SpectrumSpectra/Porl分子多孔膜管，截至MW6000-8000)過夜。在透析期間更換兩次DMF。透析管中內(nèi)容物隨后轉(zhuǎn)移到燒瓶中并補(bǔ)足至25mL最終體積。得到所得共聚物的定量^CNMR譜圖13CNMR(DMFH7/DMFD7，500固z)318.10，19.44，41.32,45.91,56.94，60.15，62.03，63.65，171.07,171.87,176.05。通過獲得在171.87(OC-0)和176.05(O=C-OH)ppm的羰基峰的積分比例，共聚物的化學(xué)計(jì)量為92.8:7.2丙烯酸:ATRP引發(fā)子孝分C..果卩丙雄^-^-」77i5〃發(fā)"^^,偶^i&'-7^尸尸衷面(^，尸尸-i^mp/入制備含有20:70H20(pH5):二曱基曱酰胺(DMF)和2mg/mLPATRPI共聚物的溶液，并均分到一系列清潔玻璃小瓶中。向每個(gè)小瓶44中加入經(jīng)稱重的合適量的l-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)以制得濃度為2.07mg/mL的溶液。輕微晃動(dòng)小瓶以確保EDC完全溶解，并將Si-HAPP樣品(參見實(shí)施例1)置于小瓶中(HAPP膜是剛沉積的)。小瓶輕孩么晃動(dòng)過夜，然后用2:7H20:DMF(v/v)溶液沖洗六次(沖洗間隔為至少15分鐘)，隨后用pH4的MilliQTM純凈水沖洗，并最終用MilliQTM水沖洗三次。Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI的XPS分析結(jié)果列在表15中。此處，顯而易見的是PATRPI共聚物接枝到Si-HAPP表面上導(dǎo)致引入大量的氧(0/C由0.188變至0.394)以及溴，引入的大部分氧來自于聚合物中的丙烯酸殘基，溴來自于ATRP引發(fā)子。由Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI樣品獲得的代表性高解析度ClsXPS譜圖的例子顯示在圖15中。此處，可以清楚地看到，來自Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI樣品的譜圖的形狀差異，具體而言，存在對(duì)應(yīng)于引入到表面的丙烯酸殘基的高結(jié)合能譜圖特征部分(約289eV的結(jié)合能)，證實(shí)了偶聯(lián)反應(yīng)是成功的。舉》A'/Z^P戶-戶J77/Y4面2果C("乙二寧f崖/^^趁游」fVZ5」」的凝戎,合Si-HAPP-PATRPI表面上聚(聚(乙二醇曱基丙烯酸酯)(475)的接枝聚合過程主要來自于文獻(xiàn)(Feng，W.等，Macromol.RapidCommun.2005,26,1383),有少量輕微變化。PEGMA(475)按收到時(shí)原樣使用；然而，經(jīng)過含有抑制劑去除樹脂(Aldrich)的色譜柱除去抑制劑。制備PEGMA(475)曱醇溶液(2M)(總共16mL)，含有23.0mgCu(l)Br(0.16mmol)和4.6mg2,2'-聯(lián)吡啶(0.03mmol)。在轉(zhuǎn)移到充滿高純度N2的手套箱之前通過鼓入20分鐘的N2氣泡除去溶液中的氧氣。輕微攪拌下向該溶液中加入氮?dú)怙柡偷?-溴異丁酸乙酯(23.5mL,0.16mmo1)。該溶液的等分試樣轉(zhuǎn)移到裝有Si-HAPP-PATRPI表面的玻璃管中，用塞子塞上試管，并使接枝反應(yīng)在室溫下反應(yīng)兩小時(shí)。通過從手套箱中取出試管并導(dǎo)入02從而終止反應(yīng)。樣品用曱醇沖洗四次，用MilliQTM水沖洗四次，隨后用高純度N2氣流干燥以用于XPS分析。列在表15和圖15中的是由Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(W5))樣品的XPS分析得到的元素比例和高解析度ClsXPS譜圖。根據(jù)所觀察到的0/C比例的增加和N/C比例的減少，接枝反應(yīng)是成功的。然而，存在的氮信號(hào)表明所形成的涂層在真空干燥時(shí)厚度小于IOnm。該論斷可由Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))樣品的高解析度Cls譜圖的形狀證實(shí)，當(dāng)與由Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI得到的語圖相比，由于涂層中C-O基團(tuán)的存在而引入明顯的特征部分(結(jié)合能286.6eV)。表l5:由Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI和Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(^")表面的XPS分析測(cè)定的元素比例<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)施例17采用可聚合NHS酯的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-NHSA)涂層的制備5V-7i4P尸-尸/^面J:,卩丙雄應(yīng)應(yīng)-AA//5々的凝在果合按照實(shí)施例l制備了Si-HAPP表面。按照實(shí)施例4進(jìn)行PI共聚物(來自實(shí)施例3)的共價(jià)固定從而制成Si-HAPP-PI表面。將這些放入用戶定制的帶有石英玻璃蓋的PVDF室中。向小室中加入含有(i)59mgiV-丙酰氧基琥珀酰亞胺(NHSA),250mg丙烯酰胺和5mLDMF(IOmol.%;Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-100/。NHSA))或(ii)120mgNHSA，250mg丙烯酰胺和5mLDMF(20mol.%;Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20%NHSA))的溶液。每種情況下的單體溶液中鼓入10分鐘的純氮?dú)庖殉ト芙獾难?。在鼓氣后，關(guān)閉入口和出口閥門，使用EXFOArticure400燈將樣品暴露于UV輻射(320-500nm波長；50mWcm^強(qiáng)度)30分鐘。在輻射后，取出樣品在DMF中清洗三次，2小時(shí)，浸泡在新鮮DMF中過夜，然后再放置于新鮮DMF中一天，偶爾進(jìn)行晃動(dòng)。最后，樣品經(jīng)干燥用于XPS分析和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)(參見部分B)。列在表16中的是由Si-HAPP-PI樣品，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%NHSA)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20%NHSA)樣品，以及用作XPS分析和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)照的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)均聚物樣品的XPS分析得到的元素比例。由兩個(gè)NHSA涂層得到的元素比例與由Si-HAPP-PI樣品得到的元素比例的比較表明樣品的接枝涂覆是成功的，例如N/C比例增力口(由Si-HAPP-PI樣品的0.055分別增加至10。/o和20%NHSA情況下的0.220和0.202，以及增加至丙烯酰胺情況下的0.274)。對(duì)于10。/。的情況而言N/C值也更高，這表明所述涂層相比20%NHSA樣品含有更多的丙烯酰胺，并且兩種含有NHSA的涂層具有比聚(丙烯酰胺)均聚物更低的N/C。表16:由Si-HAPP-PI，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-100/。NHSA),Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20%NHSA)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>為了得到關(guān)于涂層的更多信息，也獲取了高解析度C1sXPS譜圖。在圖15中顯示了由Si-HAPP-PI，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%NHSA)，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品獲得的代表性譜圖。在Si-HAPP-PI譜圖的情況下，也包括了通過曲線擬合程序得到的去巻積語圖特征部分。譜圖特征部分按結(jié)合能增加標(biāo)為C1至C5。在圖16中可以觀察到不同語圖間的顯著不同。例如，Si-HAPP-PI樣品具有非常獨(dú)特的高結(jié)合能特征部分(C5BE=289.25eV)，對(duì)應(yīng)于O-CO基團(tuán)。另一方面，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)譜圖具有獨(dú)特的特征部分(C4，BE=288.1eV)，對(duì)應(yīng)于C二0/N-00基團(tuán)(后者對(duì)于聚(丙烯酰胺)更加重要)。NHSA涂層當(dāng)然含有兩種官能類型的元素。在NHSA涂層的譜圖中，可以觀察到C4和C5特征部分的相對(duì)強(qiáng)度根據(jù)涂層中或多或少的丙烯酰胺或NHSA而變化。高解析度Cls譜圖的譜圖特征部分的量化也包括在表17中。表17:由Si-HAPP-PI，Si-HAPP-PI-P(丙蹄酰胺)，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10%NHSA)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA)得到的曲線擬合ClsXPS譜圖得到的高解析度Cls譜圖特征部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在具有可控非特異性吸附性質(zhì)，可控接枝密度、分子量和結(jié)構(gòu)聚合物的聚合物涂層中提供NHS反應(yīng)性基團(tuán)使之能固定諸如肽等含有胺的化合物。在涂層中含有這些肽可提供培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)表面的應(yīng)答的控制(參見部分B)舉敘.勿/錄#試-發(fā)為測(cè)試iV-丙雄瘋真差諒^瘋亞辨NHSA)共聚到P(丙烯酰胺)涂層中之后NHS部分的反應(yīng)性的功效，選擇了五肽Lys-Asp-Gly-Glu-Ala(KDGEA)。KDGEA是在I和IV型"交原質(zhì)中找到的a2pl整合素的細(xì)胞結(jié)合識(shí)別序列，并且已顯示出有效阻斷牛角膜上皮(BCEp)細(xì)胞附著至膠原質(zhì)模擬表面。通過采用NHS部分將KDGEA固定至P(丙烯酰胺)表面，細(xì)胞附著的不良載體上，可以預(yù)計(jì)接種到該表面上的BCEp細(xì)胞將能通過錨定的五肽進(jìn)行附著和擴(kuò)散。KDGEA的非細(xì)胞支持性類似物，Lys-Asp-Gly-AIa-Ala(KDGAA)用作比較。尤其重要的是為了區(qū)分KDGEA和KDGAA對(duì)細(xì)胞附著的作用，在聚合支架上的附著必須低。這可通過采用其中簡(jiǎn)便地控制聚合物鏈的聚合鏈接枝密度、分子量、多分散性、組成和構(gòu)象的方法學(xué)制造支架從而最好地實(shí)現(xiàn)。其中所描述的方法學(xué)將理想地適用于實(shí)現(xiàn)該控制。Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA)樣品轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)聚苯乙烯培養(yǎng)板(TCPS,24孔)，然后測(cè)試按照以下方式中的一種進(jìn)行處理后其支持24小時(shí)附著的能力以及牛角膜上皮(BCEp)細(xì)胞的擴(kuò)散(a)37。C,浸沒在含有500嗎/mL五肽Lys-Asp-Gly-Glu-Ala(KDGEA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)溶液中1小時(shí)；(b)37。C，浸沒在含有500嗎/mL五肽Lys-Asp-Gly-Ala-Ala(KDGAA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH7.4)溶液中l(wèi)小時(shí)；(c)37。C，浸沒在PBS(pH8.0)溶液中1小時(shí)使NHS部分失活，和(d)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)對(duì)照樣品也在37。C浸沒在pH7.4或pH8.0的PBS中，同時(shí)，TCPS用作參比對(duì)照表面。在各種浸沒方式之后，移去溶液，并用無菌PBS(pH7.4)清洗每個(gè)樣品。然后將濃度為2xl()S細(xì)胞/孔的BCEp細(xì)胞加入到每個(gè)樣品孔中由添加有10%(v/v)牛胚胎血清(FBS)的Dulbecco'sModifiedEaglesMedium/Ham'sF12(DMEM/F12，50:50)組成的培養(yǎng)基中。在37。C,空氣中含有5%C02的潮濕氛圍中將細(xì)胞保溫24小時(shí)。為了顯現(xiàn)出不透明Si-晶片類樣品上的細(xì)胞，在保溫的最后一小時(shí)用CellTrackerTM綠(InvitrogenCorp.)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。在用吸收波長488nm的熒光顯微鏡觀察之前用4。/。曱醛-鹽水溶液固定細(xì)胞。數(shù)字記錄每個(gè)樣品上細(xì)胞的代表性圖像。在Si-HAPP-PI-P(丙晞酰胺-共-200/。NHSA)-KDGEA表面(圖17a，KDGEA)上觀察到具有很好的分布形態(tài)學(xué)的優(yōu)異細(xì)胞附著，類似于TCPS對(duì)照表面(圖18a和b)。相比KDGEA樣品，在Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA)-KDGAA樣品(圖17b，KDGAA)上觀察到最小的細(xì)胞附著，但略微多于沒有使用肽的對(duì)照表面上的細(xì)胞數(shù)目(圖17c和d)。然而，存在的這些細(xì)胞均顯示出圓形形態(tài)。這是未曾預(yù)料到的，因?yàn)樵谛蛄兄袃H有一個(gè)氨基酸發(fā)生變化，應(yīng)當(dāng)存在BCEp細(xì)胞膜a2pl整合素對(duì)KDGAA的微弱親合力。在pH8.0進(jìn)行水解的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20%NHSA)樣品上觀察到非常低的細(xì)胞附著(圖17c，NHSpH8.0)。在暴露于pH8.0的PBS的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)對(duì)照表面上發(fā)現(xiàn)最少的細(xì)胞附著(圖17d,pAAmpH[8.0])。這些結(jié)果表明Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA)表面的表面密度和構(gòu)象完整足夠以提供該表面上的良好細(xì)胞附著的方式共價(jià)固定49KDGEA肽。不僅BCEp大量附著，而且它們?cè)谂囵B(yǎng)24小時(shí)后保持良好分歉形態(tài)的同時(shí)仍大量附著。非細(xì)胞結(jié)合類似物KDGAA未能提供相似的BCEp細(xì)胞附著錨定點(diǎn)，并有效地等同于無非支持的，水解的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20。/。NHSA)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)對(duì)照。實(shí)施例18由含有不同組成的羧酸部分和引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分的共價(jià)偶聯(lián)高分子制備Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)J^"不^7,^化的二乙差二碗/七^差f凝^-乙雄差-^:f游和丙雄凝的果f二乙差-二孩/七'^:f凝4-乙雄差末f麵W顛鄉(xiāng),。摩爾比的丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯。丙烯酸(4.0g,5.55xl0-2摩爾，無水，F(xiàn)luka)溶解在8mL二曱基甲酰胺(DMF)(BDHchemicals)中，隨后通過將溶液流經(jīng)含有抑制劑去除劑(Aldrich)的柱子除去抑制劑。向丙烯酸溶液中加入0.60g二乙基-二硫代氨基曱酸4-乙烯基-苯曱酯(2.26x10-3mol)(來自實(shí)施例2)和200mgAIBN，隨后所述溶液中鼓入氮?dú)?0分鐘，并密封。在60。C加熱過夜導(dǎo)致不透明粘性凝膠的形成，進(jìn)一步加入20mLDMF而溶解。含有共聚物的溶液針對(duì)DMF透析(SpectrumSpectra/Por1分子多孔膜管，截至MW6000-8000)過夜。在透析期間更換兩次DMF。透析管中內(nèi)容物隨后轉(zhuǎn)移到燒瓶中并補(bǔ)足至100mL最終體積。PI(2)共聚物經(jīng)定量130NMR進(jìn)行表征。該組成對(duì)應(yīng)于含有3.4:96.6mol.%二乙基-二硫代氨基曱酸4-乙烯基-苯甲酯:丙烯酸的共聚物。該組成可與實(shí)施例3中合成的組成為8.5:91.5mol。/。二乙基-二硫代氨基曱酸4-乙烯基-苯曱酯:丙烯酸的共聚物(PI(l))相比較。命為A;菜^丙,趁-^-二乙差-二碗/七苯f虔4-乙雄差笨f參々/^尸尸/##磁^^的共,偶聯(lián)(57-/￡4尸尸-尸"按照實(shí)施例4中概述的方法進(jìn)行P1(2)共聚物與實(shí)施例1的HAPP涂覆硅晶片的偶聯(lián)。列在表18中的是Si-HAPP，Si-HAPP-PI(l)(來自實(shí)施例4)和Si-HAPP-PI(2)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。由增加的0/C和減少的N/C比例(相比于Si-HAPP樣品)，與Si-HAPP-PI(1)樣品相近的N/C以及硫的存在(由S/C比例表明)可以表明，該共聚物的共價(jià)偶聯(lián)是成功的。對(duì)于Si-HAPP-PI(2)樣品所得的S/C比例低于Si-HAPP-PI(l)樣品，表面共價(jià)接枝層含有更少的加入的引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分。假定兩種共聚物在Si-HAPP樣品表面上均勻覆蓋，在共價(jià)偶聯(lián)共聚物中減少的摩爾比的二乙基-二硫代苯曱酸4-乙烯基苯曱酯將導(dǎo)致用于接枝聚合的引發(fā)位點(diǎn)之間的更大間3巨。率為、C.'//y4尸尸-尸/(7;和&'-/^尸尸-尸/0《面J:丙雄教展卓沐的凝戎果合按照實(shí)施例6中概述的方法進(jìn)行Si-HAPP-PI(2)樣品表面上聚(丙烯酰胺)的接枝聚合，然而，在向單體溶液中鼓入氮?dú)饬髦螅肟诤统隹陂y門關(guān)閉，采用EXFOArticure400燈將樣品暴露于UV輻射(320-500nm波長，強(qiáng)度為50mWcm,30分鐘。列在表18中的是由Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析得到的元素比例，相比于Si-HAPP-PI(l)-P(丙烯酰胺)樣品。如以上扭克述，兩個(gè)Si-HAPP-PI(l)和(2)樣品將有用于接枝聚合？1發(fā)位點(diǎn)間距之間的差異。假定聚合反應(yīng)形成具有相近分子量的聚合物，在Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)樣品的情況下接枝鏈之間的距離小于Si-HAPP-PI(1)-P(丙烯酰胺)樣品，接枝到Si-HAPP-PI(2)的聚(丙烯酰胺)的質(zhì)量將低于由Si-HAPP-PI(l)樣品得到的那些聚(丙烯酰胺)。在干燥樣品并放置于XPS儀器的超高真空室中后，Si-HAPP-PI(2)樣品上的接枝層的厚度將小于接枝到Si-HAPP-PI(l)樣品的那些接枝層。在表18中列出的XPS元素比例結(jié)果的分析也證實(shí)了該效果。此處，可以看到由Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)樣品獲得的0/C和N/C比例低于由Si-HAPP-PI(l)-P(丙烯酰胺)樣品獲得的0/C和N/C比例，與Si-HAPP-PI(2)樣品上的聚(丙烯酰胺)接枝層的厚度實(shí)際上小于由Si-HAPP-PI(l)樣品獲得的接枝層的厚度相一致。表18:由Si-HAPP，Si-HAPP-PI(l)(來自實(shí)施例4),Si-HAPP-PI(2)，Si-HAPP-PI(l)-P(丙烯酰胺)和Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析得到的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實(shí)施例19涂層穩(wěn)定性高壓加熱的作用按照實(shí)施例6中所描述的方法制備Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)涂層。涂覆表面的樣品放置在高壓釜中，并將高壓釜置于正常滅菌循環(huán)中。取出樣品并用MilliQTM水沖洗八次，隨后干燥用于XPS分析。也經(jīng)MilliQ水充分沖洗的未經(jīng)高壓加熱處理的樣品也經(jīng)干燥并用XPS分析以進(jìn)行比較。從表19中列出的數(shù)據(jù)清楚地看到由高壓加熱處理前后的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面得到的元素比例非常相近。由于樣品在高壓加熱期間經(jīng)受了高溫和高壓，且組成沒有變化，這是很好的證據(jù)證實(shí)涂層是穩(wěn)定的并且在滅菌時(shí)例如不會(huì)分層。表19:由高壓加熱處理前后的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)涂層的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>顯示在圖19中的是由高壓加熱處理前后的Si-HAPP-PI(丙烯酰胺)樣品獲得的高解析度ClsXPS鐠圖。在兩種情況下得到的譜圖非常相似，證實(shí)了所述樣品對(duì)高壓加熱過程穩(wěn)定。還包括在圖19中的是由高壓加熱前Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)樣品獲得的Cls譜圖的曲線擬合i普?qǐng)D特征部分。該過程使之能量化與不同官能團(tuán)或化學(xué)環(huán)境相關(guān)的化學(xué)變化所引起的對(duì)整個(gè)譜圖的貢獻(xiàn)。出于清楚的目的未在圖19中包括由高壓加熱后樣品獲得的Cls譜圖的曲線擬合語圖特征部分。然而，兩種樣品均列在表20中。再次，兩個(gè)樣品的相應(yīng)特征部分非常相似，證實(shí)了高壓加熱時(shí)涂層的穩(wěn)定性。表20:由高壓加熱前后Si-HAPP-PI-P(丙蹄酰胺)涂層的曲線擬合程序獲得高解析度XPSCls譜圖特征部分。由最低結(jié)合能至最高結(jié)合能，Cl和C2來自于烴類，C3來自于C-0/C-N，C4來自fC=0/N-C=0,而C5來自于O-CO物種。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>實(shí)施例20聚合基材的涂層疊氮化物類表面固定^^:fi求^^^^^的戶/^果參的衍i化在黑暗室內(nèi)條件下進(jìn)行，5.0mL含有4.1。/。PI共聚物(在實(shí)施例3中所述)的DMF溶液與0.5mLPBS緩沖溶液相混合。向此溶液中加入IOOmg疊氮苯胺鹽酸鹽和200mg7V-(3-二曱基氨基丙基)-TV-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在室溫黑暗室內(nèi)條件下，反應(yīng)混合物用^F茲力攪拌器攪拌1小時(shí)。所得疊氮苯胺纟務(wù)飾PI[PI(疊氮化物)]共聚物溶液可無需進(jìn)一步純化而用于后續(xù)試驗(yàn)。率為^:尸/fJ"扇化參):4果浙的4面萄;t聚(對(duì)苯二曱酸乙二酉旨)(PET)膜用作PI(疊氮化物)共聚物的表面固定的基材。PET膜按收到時(shí)原樣使用并切割為1cmxl.5cm尺寸。然后按照實(shí)施例15b所描述的過程沉積丙燁胺等離子聚合物。然后室溫黑暗中，樣品與上述含有PI(疊氮化物)的溶液保溫30分鐘。共價(jià)固定[PET-PI(疊氮化物)共價(jià)]樣品用9:l(v/v)DMF/水溶液簡(jiǎn)要地清洗，干燥并暴露于輻射(EXFOArticure400,400-500nm濾鏡，50W)10秒。在UV暴露期間，由于高反應(yīng)性氮烯基團(tuán)的形成及其與PET基材聚合物的反應(yīng)，PI(疊氮化物)聚合物共價(jià)地錨定在基材表面。對(duì)照樣品包括用9:l(v/v)DMF/水溶液(30分鐘5次)和用水(30分鐘5次)反復(fù)清洗，在如上PI(疊氮化物)吸附后干燥的樣品[PET-PI(疊氮化物)吸附]。尸五r-尸/(^f^化^)^/介表面J:^雄應(yīng)展卓伴的凝戎,合。PET-PI(疊氮化物)共價(jià)樣品裝入到充滿5%(w/v)丙烯酰胺水溶液的聚合室中(如前述實(shí)施例所描述)。隨后通過UV輻射(EXFOArticure400,320-500nm濾鏡，50W)30分鐘進(jìn)行連接有引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分的表面上的丙烯酰胺的接枝聚合。UV聚合后，用水(30分鐘，3次，以及額外16小時(shí))清洗樣品，隨后干燥(PET-PI(疊氮化物)共價(jià)-P(丙蜂酰胺》。列在表12中的是由這些樣品的XPS獲得的元素比例。表21:由PET，PET-PI(疊氮化物)吸附，PET-PI(疊氮化物)共價(jià)和PET-PI(疊氮化物)共價(jià)-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析獲得的元素比例。樣品0/CN/Cs/cPET0.3850細(xì)o細(xì)PET-PI(疊氮化物)吸附0.3660扁o細(xì)PET-PI(疊氮化物)共價(jià)0.2560.1190扁PET-PI(疊氮化物)共價(jià)-P(丙烯酰胺)0.2820.272o細(xì)54結(jié)果顯示PET的典型組成，并且清楚地表明如果樣品未經(jīng)輻射則吸附的PI(疊氮化物)被完全清洗掉。PET-PI(疊氮化物)共價(jià)樣品相比而言則顯示出N/C比例的顯著增加和0/C比例顯著減少，正如由P1(疊氮化物)共聚物的結(jié)構(gòu)所預(yù)測(cè)。該樣品中出現(xiàn)硫則給出了PI(疊氮化物)共聚物成功共價(jià)固定的另一證據(jù)。由高0/C和N/C比例以及不存在硫信號(hào)所預(yù)示，PET-PI(疊氮化物)共價(jià)-P(丙烯酰胺)樣品得到的分析結(jié)果則表明涂層厚度超過10nm(XPS方法的分析深度)的P(丙烯酰胺)成功接枝。該結(jié)果進(jìn)一步由上述樣品的Cls高解析度XPS譜圖所支持。由PET-PI(疊氮化物)共價(jià)-P(丙烯酰胺)樣品表面得到的代表性高解析度C1s譜圖(在圖20(A)顯示)顯示了厚P(丙烯酰胺)涂層的典型特征。用于比較在圖20(B)中顯示了由PET得到的代表性高解析度Cls譜圖。由0.016或更少的N/C比例所預(yù)示，通過在丙烯酰胺溶液中PET和PET-PI(疊氮化物)吸附樣品的輻射而進(jìn)行的對(duì)照試驗(yàn)(數(shù)據(jù)未在此處示出)未導(dǎo)致任何明顯的接枝。實(shí)施例21采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合制備Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)接枝涂層將丙烯酸(4.0g，5.6xl(T2mol,無水，F(xiàn)luka)溶解在12mL二曱基曱酰胺(DMF,BDHChemicals)中，隨后將溶液通過含有抑制劑去除劑的柱子(Aldrich)。向該溶液中加入l-(氯曱基)-4-乙烯基苯(CMVB，0.84g，5.5xl0'3mol，Aldrich)。該溶液中鼓入干燥氮?dú)馐昼?，隨后加入0.2g偶氮二異丁腈(AIBN)。裝有反應(yīng)混合物的燒瓶用橡膠膜密封，再鼓入五分鐘干燥氮?dú)獠⒆罱K在60。C加熱過夜。在聚合溶液冷卻后，將其轉(zhuǎn)移到透析管(SpectrumSpectra/Porl分子多孔膜管，截至MW6-8kDa)中，并針對(duì)DMF進(jìn)行透析兩天，期間多次更換DMF。該溶液放入10mmNMR管并獲得定量13C諳圖13CNMR(125.77MHz，DMF-/77)5177.9-172.2(8.3C，C=0),145.3匿143.8(1C,ArC)，136.2(1H,ArC)，129.2(2C,ArCH)，128.5(2C,ArCH)，46.6(1C,CH2C1),42.4-40.9，(9.3C,VBC骨架CH,AA骨架CH2)，38.5-34.8(AA骨架CH,VBC骨架CH2,被DMF部分掩蔽)。由各個(gè)峰得到的積分分析表明聚合物的組成為89:11丙烯酸:CMVB殘基，與所用的單體原料比例很好地相符。舉為、力乙差三《《/t'^差f凝厲岸f的合^'在氮?dú)夥諊拢伊虼?1.46g，23.5x10-3mol,Aldrich)和二硫化碳(2.69g，35.4x10-3mol，AjaxChemicals)加入到圓底燒瓶中的20mL氯仿中。向該溶液中逐滴加入三乙胺(2.80g,27.7xl(T3mol,Aldrich)。反應(yīng)混合物攪拌兩小時(shí)，然后放置在室溫反應(yīng)過夜。率》C.舍l凌^率分和T逆》"成-錄襲鏈脊移,i/部為、的:#果#fP/L4Kr#^*」^合成向以上部分A中形成的共聚物溶液中加入14mL在部分B中形成的乙基三硫代氨基曱酸鹽溶液。反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢鑳尚r(shí)，隨后轉(zhuǎn)移至透析膜(SpectrumSpectra/Porl分子多孔膜管，截至MW6-8kDa)中，并針對(duì)DMF進(jìn)行透析兩天，期間多次更換DMF。透析管中的聚合物溶液為黃色。該顏色在透析期間保持。在透析時(shí)間段結(jié)束時(shí)，透析液中未觀察到黃色。移取透析管中的聚合物溶液并加入DMF補(bǔ)足至40mL總體積。取一份該聚合物溶液的樣品進(jìn)行定量"CNMR分析13CNMR(125.77MHz，DMF-/z7)5225.2(1C，C=S),178.2-173.4(9.3C，C=0)，146.4-144.0(1C，ArC)，133.6(1H，ArC)，130.2(2C,ArCH)，129.1(2C,ArCH),46.6(1C,CH2C1),43.4-41.2,(VBR骨架CH，AA骨架CH2，CH2CH3)，38-35(AA骨架CH,VBR骨架CH2，partiallyobscuredbyDMF)，13.7(1C，CH3).由譜圖得到的積分分析表明(i)共聚物鏈上CMVB部分和乙基三硫代氨基曱酸陰離子之間的反應(yīng)幾乎是定量的，(ii)共聚物鏈上丙烯酸和乙基三硫代氨基曱酸殘基之間的化學(xué)計(jì)量與在部分A中得到的丙烯酸:CMVB殘基比例相同。卑分D:JU尸尸修謬在^々(5V-^L4/^-尸i^F7)丄戶i^Fr兵,錄的共,偶聯(lián)56按照實(shí)施例15制備Si-ALAPP表面，并按照實(shí)施例14進(jìn)行將PRAFT共聚物共價(jià)偶聯(lián)到Si-ALAPP表面上。簡(jiǎn)言之，將五片ALAPP處理硅晶片(大約lcmx1cm)放置在含有1.5mL的在部分C中制備的PRAFT共聚物溶液、H2O(0.8mL)和iV-(3-二曱基氨基丙基:HV-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,0.075g,Sigma)的溶液中。反應(yīng)進(jìn)行過夜，隨后在DMF(—天內(nèi)兩次，隨后清洗過夜)和水(一天內(nèi)三次)中清洗硅晶片，隨后在層流拒中干燥。通過XPS分析確認(rèn)PRAFT共聚物共價(jià)地偶聯(lián)至Si-ALAPP基材。在表22中，可以看到由Si-ALAPP-PRAFT樣品獲得的0/C比例明顯高于由Si-ALAPP對(duì)照樣品獲得0/C比例(源自于在PRAFT共聚物中存在高比例的羧酸殘基)。此外，Si-ALAPP-PRAFT樣品的N/C比例減少(表明在Si-ALAPP頂部存在不含有N的覆蓋層)以及S的存在(來自于共聚物中的三硫代氨基甲酸酯)。此外，XPS高解析度譜圖分析表明在表面上存在羧酸基團(tuán)，與存在含有丙烯酸基團(tuán)的高分子涂層相一致。命為、E.J^L4尸尸-尸iL4Fr*面丄丙舉瘋屋W#戎果合將Si-ALAPP-PRAFT處理硅晶片放入裝有l(wèi)OmL5重量％丙烯酰胺單體溶液的小瓶中。在加入2,2'-偶氮二-(2-咪基丙烷)二鹽酸鹽(Vaso⑧50,0.025g)之前用氮?dú)饷摎?分鐘。溶液中再鼓入五分鐘氮，隨后密封小并瓦并在35。C加熱30分鐘。樣品清洗三次，浸沒在水中兩天，隨后在MilliQTM純凈水中進(jìn)行最后沖洗。最后，在XPS分析之前，樣品在層流拒中用干燥經(jīng)過濾的高速氮?dú)饬鞲稍?。列在?2中的是由Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析得到的結(jié)果。由N/C原子比例從0.046增加至數(shù)值0.114證實(shí)Si-ALAPP-PRAFT樣品表面上聚(丙烯酰胺)的成功接枝。應(yīng)當(dāng)注意的是，在聚(丙烯酰胺)接枝之前和之后，所得S/C比例非常接近，表明相近量的S依然存在于涂層中。這證實(shí)了聚合反應(yīng)通過RAFT機(jī)理進(jìn)行，這是由于丙烯酰胺單體以將活性RAFT基團(tuán)留在聚合物鏈末端的方式加到聚合物鏈上。由于在XPS分析中釋放的光電子強(qiáng)度由于覆蓋層的存在而被削弱，S必須位于聚合物鏈的末端(即，在聚(丙烯酰胺)涂層的最夕卜面。表22:由Si-ALAPP,Si-ALAPP-PRAFT和Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>聚(丙烯酰胺)接枝反應(yīng)成功的再一個(gè)證據(jù)是由高解析度XPS分析獲得。對(duì)于Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)樣品，高解析度ClsXPS譜圖含有由于酰胺官能性的存在而形成的特征部分，而其并不存在于由Si-ALAPP-PRAFT樣品獲得的譜圖中。應(yīng)當(dāng)注意的是，聚(丙烯酰胺)接枝涂層的厚度小于XPS取樣深度的厚度，這可能是由于相比引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑(參見實(shí)施例6)而言，RAFT聚合動(dòng)力學(xué)更慢。實(shí)施例22Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)涂層的制備Coatings7-(T二乙差羞差f碗教磁)f4)^^^的合成4-氯曱基苯曱酸(4g,0.0234mol，l.O當(dāng)量)溶解在溫?zé)嵋掖?20mL)中。三水合二乙基二硫代氨基曱酸鈉鹽(7.92g,0.0328mol,1.5當(dāng)量)也獨(dú)立地溶解在溫?zé)嵋掖?20mL)中。然后將氨基甲酸溶液加入到羧酸溶液中。所得化合物隨后在40-50。C加熱2小時(shí)，然后在室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并在二氯曱烷和鹽水中分離。分離水相并用濃HC1酸化至pH值2。酸化中形成的沉淀經(jīng)過濾和空氣干燥得到白色固體，4.1g(產(chǎn)率62%)。！HNMR(丙酮-d6,400固z)51.26，br.s,6H，2xCH3;3.82,br.s，2H，CH2N;4.5，br.s,2H,CH2N;4.67，s,2H，CH2S;7.56(d，J=8Hz，2H,芳香氫)；7.98(d，J=8Hz,2H，芳香氫)ppm。"CNMR(丙酮-4,400MHz)511.78,12.98,41.53，47.55,50.45,130.26,130.45,130.69,143.74，167.40，194.94ppm.命為^:7-(T二乙差歲差f碗教碗)f4)苯f魔覆的合成l-((二乙基氨基曱硫酰硫)曱基)苯曱酸(O.lg)在thionylchloride(lmL,過量)和二氯曱烷(10mL)的溶液中回流2小時(shí)。反應(yīng)隨后蒸發(fā)至干并得到為淡黃色液體的產(chǎn)物(產(chǎn)率100%)。產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋至l.OOmL體積(0.353M標(biāo)準(zhǔn)溶液)以備后續(xù)與OH端終止星形-PEGMW116,000(見下文)的反應(yīng)。由觀察到起始材料是在二氯甲烷中部分不溶解的白色固體，而產(chǎn)物是在二氯曱烷中完全溶解的淡黃色液體可進(jìn)一步證實(shí)羧酸至酰氯的轉(zhuǎn)變。'HNMR(CD2Cl2,400畫z)51.27-1.29(br.m，6H,2xCH3)，3.76(br.q，J=7.0Hz,2H,CH2N)，4.04(br.q，J=7.0Hz,2H，CH2N)，4.66(s,2H，CH2S),7.53(d，J=8.4Hz,2H，芳香氬，8.04(d,J=8.4Hz,2H，芳香氫)ppm。13C(CD2C12，400MHz)S11,8，12.9,41.3，47.5，50.5,53.5，53.7，54.0,54.3,54.5,130.4,132.0,132.5,146.6,168.4，194.3ppm.部為Y:端終A產(chǎn)形-i^G的化夢(mèng)修謬以水入刃發(fā)#移終2刺命為、(^參尸五G-尸/)羥基端終止星形-PEG,MW116，000(星形-462,24臂，ShearwaterPolymers,Inc.)(0.5g,0.0043mmol聚合物)在N2氛圍下溶解于二氯甲烷(15mL)。所得溶液在冰浴中冷卻并加入三乙胺(0.0053g，12.6當(dāng)量)。然后將l-((二乙基氨基曱硫酰硫)曱基)苯甲酰氯(160.5(iL含有o.oonig的0.0353M溶液)逐滴加入到容器中。反應(yīng)攪拌過夜并蒸發(fā)至干得到淡橙色粉末。該粉末經(jīng)FTIR分析并由僅在反應(yīng)產(chǎn)物譜圖中存在的酯OO伸縮吸收峰(1720cm-1)確認(rèn)星形-PEG的端OH基團(tuán)和酰氯之間的反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)注意到，根據(jù)星形-PEG中的羥基摩爾數(shù)，大約0.5當(dāng)量的l-((二乙基氨基曱硫酰硫)曱基)苯甲酰氯加入到反應(yīng)混合物中，留下大約一半的端羥基供其它反應(yīng)(見下文)。59舉為、Z):j丄j尸尸-尸/《面丄W丙舉應(yīng)麼卓#^#炎果尺寸為lcmxlcm的硅晶片(Si)按實(shí)施例15B用ALAPP薄膜涂覆(Si-ALAPP)。ALAPP沉積前后的樣品的XPS分析的數(shù)據(jù)(元素比例)列在表23中用于比較。應(yīng)當(dāng)注意的是在表面改性后Si/C比例由12.10減少至0.00,表明HAPP薄膜至少與XPS取樣深度(約10nm)—樣厚，并且涂層沒有針孔。由于在從等離子室中取出時(shí)自由基的猝滅使得薄膜中存在氮(N/C比例為0.149)以及氧。相比改性前在Si晶片表面上的原有氧化物涂層中存在的O/C比例，由于在薄膜中存在的少量氧原子使得表面改性后的0/C比例減小。HPAA薄膜本質(zhì)上主要是碳質(zhì)的，并且碳主要是脂肪族的(由高解析度C1s譜推斷(參見圖21(a)),其中主要部分集中在285eV的結(jié)合能)。膜中存在的氮幾乎全部源自于表面氨基基團(tuán)。這可由高結(jié)合能的高解析度Nls峰(399.4eV)(數(shù)據(jù)未示出)進(jìn)行推斷。所述方法中的下一階段是將分子共價(jià)連接到既能與Si-ALAPP表面上的游離氨基也能與引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑修飾的星形-PEG(星形-PEG-PI)上的羥基反應(yīng)的官能團(tuán)。至此，Si-ALAPP樣品在形成后立即放入六亞甲基二異氰酸酯(HDI,Fluka)。室溫，樣品在不含水的密封容器中放置過夜。隨后，樣品用干燥乙腈(Merck)清洗三次十分鐘，并在氮?dú)饬飨赂稍?。?jīng)HDI修飾的Si-ALAPP基材(Si-ALAPP-HDI)的XPS分析得到的元素比例證實(shí)HDI與Si-ALAPP表面的成功共價(jià)偶聯(lián)。例如，觀察到N/C比例的微小增力口(由0.149至0.160)。由于在表面上僅存在一薄層的HDI,當(dāng)比較由Si-ALAPP和Si-ALAPP-HDI表面獲得的XPSCls高解析度譜圖(參見圖21(a)和21(b))時(shí)，幾乎沒有觀察到變化。通過將在乙腈(Merck)中含有星形-PEG-PI聚合物(4mg/mL)的溶液在45。C與剛制備的Si-ALAPP-HDI表面保溫16小時(shí)從而進(jìn)行來自部分C的星形-PEG-PI在Si-ALAPP-HDI樣品表面上的共價(jià)表面固定。為清洗掉未結(jié)合的聚合物，隨后用MilliQTM純凈水清洗兩次達(dá)l小時(shí)并過夜，隨后在氮?dú)饬飨赂稍?。由Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI表面的XPS分析得到的元素組成計(jì)算而得的元素比例(表23)描述了相比Si-ALAPP-HDI表面，0/C比例的顯著增力口(由0.155至0.222)和N/C比例的顯著減少(0.160至0.108),表明星形-PEG-PI聚合物的成功表面固定。(i)星形-PEG的確被引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑部分官能化和(ii)星形-PEG-PI共價(jià)固定在Si-ALAPP-HDI樣品表面的進(jìn)一步證據(jù)由星形-PEG-PI固定后在表面上存在S(S/C比例0.003)而給出。.表23:硅晶片樣品經(jīng)ALAPP薄膜沉積進(jìn)行表面改性前后，由XPS分析測(cè)定的原子組成計(jì)算而得的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>由Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI樣品表面獲得的代表性高解析度C1s譜圖也證實(shí)星形-PEG-PI聚合物在Si-ALAPP-HDI樣品表面上的共價(jià)固定(圖21(c)),具體描繪了C-0特征部分(286.5eV結(jié)合能)的明顯增力口。上述Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI樣品隨后轉(zhuǎn)移到用戶定制的用O型環(huán)密封并配有石英玻璃蓋的不銹鋼室中。小室中充滿5。/。(w/v)丙烯酰胺(AAM)的Milli-QTM水溶液。然后單體溶液中鼓入氮?dú)?5分鐘已從溶液中除去溶解的氧，并關(guān)閉入口和出口閥門。小室中的樣品隨后暴露于UV輻射(320-500nm波長；50mWcm^雖度)30分鐘。此后，從小室中取出樣品并在Milli-QTM水中清洗三次，并最終在Milli-QTM水中過夜除去未結(jié)合的聚合物和殘留的單體，隨后在XPS分析之前用氮?dú)饬鞲稍铩Ｔ诒?3中列出的是由Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)樣品的XPS分析得到的表面組成計(jì)算而得的元素比例。Si-ALA-HDI-星形-PEG-PI樣品表面上P(丙燁酰胺)的接枝聚合后，N/C比例增力口(由0.108至0.169)和O/C比例也增力口(由0.222至0.296),指示了成功的接枝聚合。也由高解析度ClsXPS譜圖(參見圖U(d))得到進(jìn)一步證據(jù)。此處，C-0峰(結(jié)合能286.5eV)的強(qiáng)度的減小以及出現(xiàn)在接枝聚合反應(yīng)之前不存在的對(duì)應(yīng)于酰胺的峰(結(jié)合能288eV)表明了P(丙烯酰胺)接枝層的存在。實(shí)施例23Si-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA)涂層的制備4-f2<f差丙雄魔真4)乙真_^」-4-真7"^的合4曱基丙烯酸2-幾基乙酯(25g,0.195mol)和琥珀酸苷(19.5g,0.195mol)在氮?dú)庀录尤氲蕉葧跬?200mL)中。隨后經(jīng)20分鐘逐滴加入三乙胺(28.5ml，20.72g,1.05當(dāng)量equiv.),反應(yīng)混合物回流1.5小時(shí)。反應(yīng)混合物隨后用二氯曱烷(200mL)稀釋，用2MHCl(150mL)洗滌，并最后用鹽水(100mL)洗滌。將有機(jī)相與水相分離，干燥(MgS04和Na2S04)并蒸發(fā)至干，形成粘稠無色液體(34.9g,77.8%產(chǎn)率)。^NMRS1.89(s,3H，CH3)，2.59-2.67(m，4H，2xCi^CO),4.31(br.s，4H,2xC恥CO)，5.55(s，1H，乙丈?；鵆H),6.08(s,1H,乙丈希基CH)。13CNMR517.96,28.64，28.73,62.15,62.29,126.12,135.79,167.11，171.90，177.73。命為、化4-或一-真T凝2Yf差丙雄教真差)乙,l5在以上部分A中得到的油狀產(chǎn)物(4-(2-(曱基丙烯酰氧基)乙氧基)-4-氧丁酸)與thionylchloride(54g,33mL,0.454moL,3當(dāng)量)在二氯曱烷(200mL)中回流2小時(shí)。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干從而形成澄清淡黃色液體(37.5g，99.6%產(chǎn)率)。'HNMRS1.92(s,3H，CH3)，2.68(t，/=6.6Hz，2H，CH2COO)，3.20(t,/=6.6Hz，2H,CH2COCl)，4.33(br.s，4H,2xCH20)，5.58(s,1H,乙烯基CH)，6.10(s，1H,乙烯基CH)。13CNMR518.12，29.16,41.60,62.11,62.74,126.06,135.79，166.96，170.59,172.82ppm。率為、C,2-ff差丙雄教真差)乙差丙-2-炎差磁^^^的合4丫^^丙炔醇(0.903g，l.O當(dāng)量，0.937mL)溶解在二氯曱烷(30mL)中。隨后將三乙胺(1.795g，l.l當(dāng)量，2.47mL)加入到溶液中。溶液冷卻至<0°C，并逐滴加入CH2Cl2(10mL)中的4-氯-4-氧丁酸2-(曱基丙烯酰氧基)62乙酯(4.0g,0.01613mol,1當(dāng)量)到溶液中。反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^夜，利用薄層色鐠監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。得到的粗反應(yīng)混合物隨后過濾，濾除物蒸發(fā)至干。所得暗黃色油狀物溶解在CH2Cl2中，用水(2x20mL)、稀釋HCl(2x20mL)和鹽水(2x20mL)清洗，干燥(Na2S04)并蒸發(fā)至干得到澄清無色油狀物。該油狀物進(jìn)一步經(jīng)過徑向色譜(硅力交)純化得到為澄清無色油狀物的所需產(chǎn)物(2.5g)。'HNMRS1.91(s，3H,CH3)，2.46(t，/=2.4Hz，1H，炔CH)，2.65(s，4H，2x(CH2CO),4.32(s,4H，2xCH2OCO)，4.66(d，/=2.4Hz，2H，OCH2CCH),5.56(br.s，1H，乙烯基CH)，6.09(s,1H，乙烯基CH)。13CNMRS18.19,28.76,28.78,52.16,62.26,62.41,74.99,77.40，126.01,135.87,167.02,171.31,171.74ppm。孝為、D:f4i苯f凝游(7K4"的合4三氟乙醇(l.Olg,0.72mL,0.010mol,1當(dāng)量)在N2氛圍下溶解在二氯曱烷(20mL)中。溶液冷卻至0。C并加入三乙胺(1.07g，1.48mL)。逐滴加入二氯曱烷(IOmL)中的4-(氯曱基)苯曱酰氯(2.0g，0.0106mol，1.05當(dāng)量)，反應(yīng)攪拌過夜。隨后反應(yīng)混合物用水(20mL)和鹽水(20mL)清洗。分離有機(jī)層，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)至干得到白色固體(2.40g)，經(jīng)iHNMR測(cè)定為95。/。純。'HNMR(CDCl3，400MHz)54.62(s,2H,CH2C1)，4.70(q,/=8.4Hz,2H,CH20)，7.50(d,/=8.4Hz，2H，芳香氫)，8.07(d，=8.4Hz,2H，芳香氬)ppm。13CNMR(CDC13,400MHz)545.41(CH2Cl)，6L12(q，JCF=37,23Hz，CH20),123.33(q，JCF=276.72Hz,CF3),128.57(芳香碳)，128.94(芳香碳)，130.70(芳香碳)，143.59(芳香碳)，164.68(-COO-)ppm。以上獲得的白色固體溶解在DMSO(30mL)中并加入KI(0.005g)。反應(yīng)在室溫?cái)嚢璨⒎峙尤氙B氮化鈉(2.18g,0.0336mol)。反應(yīng)然后攪拌過夜。通過加入水(200mL)逐漸反應(yīng)。用二氯曱烷(3x50mL)萃取有機(jī)部分，干燥(MgS04)并蒸除溶劑得到澄清無色油狀物。該油狀物經(jīng)徑向色譜(硅膠，汽油精:二氯曱烷，l:l)進(jìn)一步純化得到澄清無色油狀物。該油狀物最終經(jīng)徑向色譜(溶劑梯度，開始為汽油精40-60。:二氯甲烷，1:1并結(jié)束為二氯曱烷(100%)純化。得到的產(chǎn)物是澄清無色液體(2.05g)。'H畫R(CDCl3,400MHz)54.44(s，2H，CH2N3),4.71(q,J^8.4Hz,2H,CH20)，7.43(d,/=8.4Hz，2H,芳香氫)，8.10(d，J^8.4Hz,2H,芳香氫)。13CNMR(CDC13,400MHz)554.16(-CH2N3),60.83(q,JCF=36.74，-CH20-)，123.04(q，JCF=277.31,-CF3),128.06(芳香碳)，128.24(芳香碳)，130.52(芳香碳)，141.82(芳香碳)，164.74(-COO-)ppm。孝;戶/4面^,《去-爐卓沐W凝我果合尺寸為lcmxlcm的Si-ALAPP-PI表面按照實(shí)施例15進(jìn)行制備。新制備的Si-ALAPP-PI樣品轉(zhuǎn)移到用戶定制的用O型環(huán)密封并配有石英玻璃蓋的不銹鋼室中。小室中充滿10。/。(w/v)點(diǎn)擊-MA單體的二甲亞砜(DMSO)溶液。然后單體溶液中鼓入氮?dú)?5分鐘已從溶液中除去溶解的氧，并關(guān)閉入口和出口閥門。小室中的樣品隨后暴露于UV輻射(320-500nm波長；50mWcm^強(qiáng)度)30分鐘。此后，從小室中取出樣品并在DMSO中清洗三次，隨后用Milli-QTM清洗兩次，并最終在Milli-QTM水中過夜除去未結(jié)合的聚合物和殘留的單體，隨后用氮?dú)饬鞲稍铩Ｓ蒘i-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA)表面的XPS分析得到的元素組成計(jì)算而得的元素比例(表24)描述了相比Si-ALAPP-PI表面的O/C比例的明顯增力口(由0.161至0.390)和N/C比例的明顯減少(0.133至0.034)，表明點(diǎn)擊-MA單體的成功接枝聚合。由高解析度ClsXPS譜圖(參見圖22(a))得到點(diǎn)擊-MA單體的成功接枝聚合的進(jìn)一步證據(jù)。此處，在接枝聚合反應(yīng)前均未存在的C-O峰(結(jié)合能286.7eV)以及O-C二O(酯)峰(結(jié)合能289.1eV)的出現(xiàn)表明接枝聚合物層的存在。表24:XPS分析測(cè)定的原子組成計(jì)算得到的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>孝分F.'5*/-/^^尸尸-尸/-戶?！稉簟睹鍶:7K4B的4面^定(^""尸尸-尸/-尸(^擊-Mi)-7F,如上所述制備新制Si-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA))樣品。樣品浸沒在含有抗壞血酸鈉(40mM)、硫酸銅(11)(20mM)以及三氟-4-(疊氮曱基)苯曱酸面旨(TFAB)的4:l(v/v)Milli-QTM水:DMSO溶液中。在向溶液中鼓入15分鐘氮?dú)庖猿ト芙獾难踔螅瑢⒎磻?yīng)容器密封并在50。C,黑暗中保溫48小時(shí)。在反應(yīng)后，樣品在4:1(v/v)Milli-QTM水:DMSO溶液中清洗三次兩小時(shí)，用Mim-QTM水清洗兩次30分鐘，最后在Milli-QTM水中過夜，隨后用氮?dú)饬鞲稍?。由Si-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA)-TFAB表面的XPS分析得到的元素組成計(jì)算而得的元素比例(表24)明確地描述了銅媒介的表面上的端炔與溶液中的三氟-4-(偶氮曱基)苯曱酸酯的疊氮基團(tuán)的1,3-偶極環(huán)加成。相比Si-ALAPP-PI-P(點(diǎn)擊-MA)表面，N/C比例的明顯增力口(由0.034至0.105)和F/C比例的明顯增加(O.OOO至O.118)說明了成功的反應(yīng)。由高解析度ClsXPS譜圖(參見圖2^b))得到成功環(huán)加成反應(yīng)的進(jìn)一步證據(jù)。由于表面固定TFAB的三氟基團(tuán)出現(xiàn)在高結(jié)合能處的事實(shí)，該基團(tuán)在XPSCls高解析度語圖中清晰可見并可用作分析表面固定的標(biāo)記。此處，在固定反應(yīng)前未存在的CF3峰(結(jié)合能293.2eV)的出現(xiàn)清楚地表明TFAB標(biāo)記的表面固定。實(shí)施例24掩蔽和未掩蔽Si-ALAPP-PI表面上PEGMA(475)的接枝聚合部為、掩蔬和呆掩/^S/"^4尸尸-戶L^面_±的尸五GM4075J擺戎果合按照實(shí)施例15制備Si-ALAPP表面，按照實(shí)施例4進(jìn)行將PI共聚物共價(jià)偶聯(lián)到Si-ALAPP表面上。然而，在本實(shí)施例中，干凈玻璃顯樣"竟載玻片替代硅晶片用作基材。簡(jiǎn)言之，六片ALAPP處理的玻璃顯微鏡載玻片放置在含有9mLPI溶液(參見實(shí)施例3)，DMF(27mL)，MilliQ純化1120(4.5mL)和AK3-二曱基氨基丙基)-7V-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，0.45g,Sigma)的溶液中。反應(yīng)在室溫進(jìn)行過夜，隨后玻璃顯微鏡載玻片在DMF(—日內(nèi)兩次，隨后過夜清洗)和純凈水(一日內(nèi)三次)中清洗，隨后在層流拒中干燥。以上制備的Si-ALAPP-PI載玻片隨后放入配有o-環(huán)密封石英玻璃蓋的用戶定制不銹鋼室。向該室中加入已經(jīng)用氮脫氣30分鐘的單體溶液(去抑制的PEGMA(475)，10%w/v)。然后如圖23所示，在每片顯微鏡載玻片的中心放置千凈的PTFE(18mm直徑)圓形掩才莫(適用于防護(hù)位于下方的表面的UV輻射)。然后將小室密封并采用EXFOArticure400燈使樣品暴露于UV輻射(320-500nm波長；50mWcm-2強(qiáng)度)30分鐘。在輻射后，取出樣品，用MilliQ純化水充分地清洗，在MilliQTM純化水中浸泡兩天，其中間歇地更換，最后再用MilliQTM純化水沖洗。在XPS分析前，將樣品在層流柜中干燥。列在表25中的是由直接位于圓形PTFE掩模之下的區(qū)域以及由所述圓形PTFE掩模四周區(qū)域的XPS分析測(cè)定的元素比例。由此^:據(jù)清楚可見在兩塊區(qū)域得到的數(shù)據(jù)相差很大(即對(duì)于掩模下和掩模周圍，0/C;0.202相比0.447:N/C;0.122相比0.013)。此外，正如預(yù)期，Si-ALAPP-PI(來自于實(shí)施例15)和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))(來自于實(shí)施例5)樣品得到的元素比例。表25:由Si-ALAPP-PI(來自實(shí)施例15)，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))，PTFE半圓形掩模以下區(qū)域和PTFE半圓形壓模周圍區(qū)域的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>因此可以得出結(jié)論，Si-ALAPP-PI表面上P(PEGMA(475》的接枝聚合僅在PTFE掩模周圍發(fā)生。還可以得出結(jié)論，接枝聚合發(fā)生需要UV輻射，證實(shí)了共價(jià)連接至Si-ALAPP表面的PI共聚物上引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑基團(tuán)的存在導(dǎo)致引發(fā)了接枝聚合反應(yīng)。接枝聚合僅在這些區(qū)域發(fā)生的其它證據(jù)獲得自樣品兩塊不同區(qū)域的高解析度XPS分析。顯示在圖24(a)和(b)中的分別是由半圓形PTFE掩模以下和周圍區(qū)域得到的高解析度Cls譜圖。由得到的Cls形狀的比較可以容易地觀察到它們相差巨大。具體而言，來自掩模周圍區(qū)域的譜圖主要是在結(jié)合能286.5eV的譜圖貢獻(xiàn)，這對(duì)應(yīng)于存在大量的C-O官能性(即，來自于P(PEGMA(475))接枝聚合物涂層的醚。另一方面，由掩模以下區(qū)域得到的譜圖主要是中心位于結(jié)合能285.0eV的譜圖貢獻(xiàn)，這主要來自于ALAPP涂層的烴類。率#萬.'潛it和^掩蔬5V-ylL4戶尸-戶/-尸(？￡^細(xì)~75」,《面且嫂^ife丄a細(xì)應(yīng)胂者i弄的辦;t。具有掩蔽和未掩蔽區(qū)域的接枝聚合物涂覆玻璃載玻片(^-」丄^尸尸-尸/-尸(？五(771"~7》"轉(zhuǎn)移到4-室培養(yǎng)盤(Nunc，Roskilde，Denmark)并且在室溫，每片載玻片浸沒在含有青霉素和鏈霉素(分別為120嗎/mL和200嗎/mL)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)無菌溶液中四小時(shí)。取出以上步驟的無菌溶液，并將HeLa細(xì)胞以1x106細(xì)胞/室的密度接種在由添加有10%(v/v)牛胚胎血清(FBS)的Dulbecco'sModifiedEaglesMedium/Ham'sF12(DMEM/F12，50:50)構(gòu)成的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37°C，含有5%C02的潮濕空氣中保溫24小時(shí)。在18和24小時(shí)保溫后，通過相差顯樣i4竟(01ympus1x81，奧林巴斯，曰本)觀察HeLa細(xì)胞并電子記錄代表性圖像。顯示在圖25中的是演示了18小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)后HeLa細(xì)胞在位于圓形PTFE掩膜以下的區(qū)域(a)和掩膜周圍區(qū)域(b)中的細(xì)胞附著的代表性區(qū)域。由這些圖像清楚可見的是在P(PEGMA(475))接枝聚合期間被掩蔽的玻璃載玻片區(qū)域中存在高細(xì)胞附著密度，而在接枝聚合反應(yīng)期間未被掩蔽的區(qū)域中非常低的細(xì)胞附著。在被掩蔽區(qū)域的細(xì)胞附著和形態(tài)非常類似于用TCPS對(duì)照得到的(見過圖W(d)-梯度接枝聚合物實(shí)施例29)?；仡櫜糠諥,通過不同區(qū)域的XPS分析，證實(shí)了在接枝聚合期間位于掩膜之下的表面非常類似于Si-ALAPP-PI表面的組成和高解析度Cls譜圖，而在接枝聚合期間掩膜周圍的區(qū)域的組成和高解析度Cls譜圖非常類似于Si-ALAPP-P(PEGMA(475))表面。此外，此前在實(shí)施例9中已證實(shí)HeLa細(xì)胞容易地在Si-HAPP-PI表面上上附著和擴(kuò)展，但不在Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))接枝聚合物表面上附著或擴(kuò)展。因此，可以得出結(jié)論，由于缺少接枝P(PEGMA(475))涂層而HeLa細(xì)胞在被掩蔽區(qū)域中附著和擴(kuò)展，由于存在厚(干燥狀態(tài)下~10nm)接枝P(PEGMA0"))涂層而不在未掩蔽區(qū)域中附著和擴(kuò)展。實(shí)施例25Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)共聚物涂層的制備以及涂層中引入交聯(lián)按照實(shí)施例15制備Si-ALAPP表面，按照實(shí)施例4進(jìn)行將PI共聚物共價(jià)偶聯(lián)到Si-ALAPP表面上。ALAPP涂覆的硅晶片(1x1cm)放置在含有6mLPI溶液(參見實(shí)施例3)，DMF(18mL),MilliQTWWtH20(3mL)和7V-(3-二曱基氨基丙基)-7V-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,0.30g，Sigma)的溶液中。反應(yīng)在室溫進(jìn)行過夜，隨后硅晶片在DMF(—日內(nèi)兩次，隨后過夜清洗)和純凈水(一日內(nèi)三次)中清洗，隨后在層流拒中干燥。以上制備的Si-ALAPP-PI載玻片隨后放入配有o-環(huán)密封石英玻璃蓋的用戶定制不銹鋼室。向該室中加入單體溶液(丙烯酰胺和丙烯酸，總共為5。/。w/v，摩爾比丙烯酰胺:丙烯酸90:10)。單體溶液然后用氮?dú)饷撗鮨5分鐘，入口和出口閥門關(guān)閉，使用EXFOArticure400燈進(jìn)行十五分鐘樣品的UV輻射(320-500nm波長；50mWcm力。輻射后，取出樣品，用MilliQ純化水充分地清洗，在MilliQTM純化水中浸泡兩天，其中間歇地更換，最后再用MilliQ純化水沖洗。一部分Si-ALAPPi-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)樣品進(jìn)一步與六亞甲基二異氰酸酯(HDI)(Fluka)反應(yīng)從而形成接枝聚合物鏈之間的交聯(lián)。來自上述(Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸))的樣品交換到干燥DMF(每份樣品總體積lmL)中，加入HDI(0.5mL),反應(yīng)在45。C反應(yīng)過夜。向其加入HDI的樣品隨后在DMF(x3)中清洗，然后在DMF中浸泡8小時(shí)，不時(shí)攪拌。最后樣品在水中充分地清洗。隨后XPS分析前在層流拒中干燥樣口C70表26:由Si-ALAPP-PI,Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>列在表26中的是經(jīng)Si-ALAPP-PI，Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI的XPS分析測(cè)定的元素比例。元素比例分析使之確認(rèn)Si-ALAPP-PI樣品表面上的P(丙烯酰胺_共_丙烯酸)接枝共聚是成功的。相比由Si-ALAPP-PI樣品獲得的數(shù)值(0/C0.158，N/C0.132),由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)樣品得到增加的O/C和N/C值(分別為0.284和0.251)。成功接枝聚合的進(jìn)一步證據(jù)獲得自高解析度ClsXPS譜圖分析。在此情況下，觀察到在Si-ALAPP-PI樣品上不存在的(參見圖13,Si-ALAPP-PI樣品的代表性高解析度ClsXPS譜圖)由于存在酰胺官能性而出現(xiàn)的譜圖特征部分(參見圖^(a))。在HDI加到Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)樣品上后'注意到N/C比例的少量增加(值為0.275，相比HDI加入前得到的值，即值0.251)。該觀察到的增加與源自于HDI的異氰酸酯基團(tuán)與接枝聚合物鏈中的丙烯酸的酸基團(tuán)反應(yīng)的向所述涂層中加入N相一致。也注意到0/C比例的少量下降，與向涂層中引入更多的中性碳(來自于HDI的六亞曱基鏈)相一致。由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI樣品獲得的高解析度C1s譜圖非常類似于由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)獲得的譜圖，這是由于在與HDI交聯(lián)之后僅引入了酰胺和烴，二者均在原先的涂層中存在。實(shí)施例26采用寡肽單體形成的Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-寡肽)接枝涂層的制備,妖卓^Yf差丙雄教真差《/殿/>^戈脇《/>^/"的合成采用Drobnik,等(Drobnfk,J.等，Maybomo/.C/^肌，7976,M/,2833)的方法合成可聚合寡肽。簡(jiǎn)言之，將氫氧化鈉(0.1515g,0.0038mol，1.0當(dāng)量)加入到甘氨酰甘氨酸(glygly),(0.50g,0.0038mol，l.O當(dāng)量)水溶液(3mL)中。所得溶液冷卻至0。C。然后將曱基丙烯酰氯(0.396g，0.0038mol,1.0當(dāng)量)和氪氧化鈉(0.1515g,0.0038mol,l.O當(dāng)量，在3mL水中)同時(shí)逐滴加入到冷卻溶液中。反應(yīng)混合物在室溫再攪拌一小時(shí)，然后用濃HCl逐滴酸化至pH值2。加入乙酸乙酯(20mL)和水(10mL)并在分液漏斗中晃動(dòng)混合物。在分液漏斗中兩相界面處由溶液中沉淀出無色晶體。這些晶體經(jīng)過濾，用水清洗并空氣干燥。得到少量所需產(chǎn)物(0.06g)(產(chǎn)率8%)。從水相中回收未反應(yīng)的甘氨酰甘氨酸。NMR(DMSO-d6，200MHz"1.86(s，3H,CH3)，3.73(s,2H,CH2),3.76(s,2H,CH2)，5.36(s，1H,乙烯基CH),5.72(s,1H，乙烯基CH)，8.05-8.17(br.s，2H,2xNH),12.53(br.s,1H,COOH)ppm。13C(DMSO-d6,200MHz"18.97,41.04,42.56,120.15，139.89，168.00,169.77，171.58ppm。命為^.'5V-^L4尸戶-尸/《面J:尸(？五(M4(7》-^f茗丙謬應(yīng)-g/yg/力^菜參涂i的^戎菜合(^"Z^尸P-P/-PfP五GM4「475)-共-M4-g/少gW按照實(shí)施例15制備Si-ALAPP表面，按照實(shí)施例4進(jìn)行PI共聚物的共價(jià)偶聯(lián)。所得Si-ALAPP-PI表面然后轉(zhuǎn)移到載玻片隨后放入配有o-環(huán)密封石英玻璃蓋的用戶定制不銹鋼室。向該室中加入含有42mgMA-glygly,900mg去抑制PEGMA(475),10mL純凈水和l和mLDMF的溶液，得到單體摩爾比為10:90MA-glygly:PEGMA(475)。在配置單體溶液和加入到UV聚合室之前，PEGMA(475)單體通過含有抑制劑去除劑樹脂(Aldrich)的柱子去抑制。單體溶液用高純度氮鼓氣15分鐘以除去溶解的氧。在鼓氣后，入口和出口閥門關(guān)閉，使用EXFOArticure400燈將樣品暴露于UV輻射(320-500nm波長，50mWcm^強(qiáng)度)30分鐘。70在輻射后，從單體溶液中取出樣品，用純凈水(3x)清洗三次，浸沒在水中過夜，并最后再?zèng)_洗三次。在清洗后，用高速經(jīng)過濾的高純度N2流吹干樣品并在XPS分析前保存在層流拒中。此外，如上制備了Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))對(duì)照樣品，即沒有MA-glygly單體。表27:(PEGMA(475)-共-MA-glygly)和Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>列在表27中的元素比例分析使之能確認(rèn)兩種接枝聚合均成功。在Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))對(duì)照樣品的情況下，得到的0/C和N/C比例非常接近于在其它實(shí)施例(例如參見實(shí)施例5)中得到的那些，表明干燥狀態(tài)下接枝聚合物涂層厚于XPS取樣深度。此外，得到的高解析度ClsXPS譜圖非常接近于之前得到的那些，并且是厚度超過IOnm(干燥狀態(tài)下)的P(PEGMA(^乃))涂層的指示。具體而言，在結(jié)合能28&;5eV處的主要譜圖特征部分是含有高比例C-O的涂層的指示。由Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-glygly)接枝共聚物涂覆樣品得到的元素比例不同于由P(PEGMA(475))接枝共聚物涂覆樣品得到的那些元素比例，N/C比例明顯增加。這是在接枝聚合反應(yīng)中將肽單體(MA-glygly)引入到聚合物鏈中的證據(jù)。正如根據(jù)元素組成和比例所預(yù)期的，由Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-glygly)接枝共聚物涂覆樣品的高解析度ClsXPS譜圖(參見圖27(b))非常類似于由Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))涂層得到的那些譜圖。譜圖之間，在中性烴類區(qū)域(在285eV)存在一些細(xì)微差異。實(shí)施例27Si-ALAPP，Si-ALAPP-PI和Si-ALAPP-P(PEGMA(475))表面的制備均勻性和平整性的研究按照實(shí)施例15制備Si-ALAPP表面，并按照實(shí)施例4進(jìn)行將PI共聚物共價(jià)偶聯(lián)到Si-ALAPP表面上。簡(jiǎn)言之，通過在表面活性劑溶液(2%RBS35,PierceBiotechnology,Inc.)中超聲一'J、時(shí)從而清潔硅晶片，在MilliQTM純化水中充分地沖洗并使用高速經(jīng)過濾的氮?dú)饬鞔蹈伞Ｈ缓蟀凑諏?shí)施例15B用ALAPP薄膜涂覆硅晶片。然后將每片晶片放置在干凈的特氟龍小瓶和含有3.6mLPI溶液(參見實(shí)施例3),DMF(10.8mL),MilliQ純化1120(1.8mL)和iV-(3-二甲基氨基丙基)-A^乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,0.18g,Sigma)的溶液等分試樣中(小晶片為2mL,大晶片為4mL)。反應(yīng)在室溫伴隨輕微晃動(dòng)進(jìn)行過夜，隨后硅晶片在DMF(—日內(nèi)兩次，隨后過夜清洗)和純凈水(一日內(nèi)三次)中清洗，隨后在層流拒中干燥。ALAPP涂覆對(duì)照樣品放入以上不含有EDC或PI的溶液中，并按照以上概述的相同步驟進(jìn)行清洗。一亞組以上制備的Si-ALAPP-PI樣品載玻片隨后》文入配有o-環(huán)密封石英玻璃蓋的用戶定制不銹鋼室。向該室中加入單體溶液(去抑制的PEGMA(475)，(10%w/v)并密封小室。經(jīng)向溶液中通入氮?dú)?5分鐘以從單體溶液中除去氧。然后密封小室的入口和出口，然后將小室密封并采用EXFOArticure400燈使樣品暴露于UV輻射(320-500nm波長；50mWcm-2強(qiáng)度)30分鐘。在輻射后，取出樣品，用MilliQ純化水充分地清洗，在MilliQTM純化水中浸泡兩天，其中間歇地更換，最后再用MilliQTM純化水沖洗。在XPS分析前，將樣品在層流拒中干燥。表28:由Si-ALAPP(n(即，樣品點(diǎn)數(shù))=10，來自一個(gè)基材樣品)，Si-ALAPP-PI(n=10，來自三個(gè)基材樣品)和Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))(n=16,來自3個(gè)基材樣品)樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表28中列出的元素比例分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差量級(jí)證實(shí)了所形成的樣品是平整，組成上是均勻的。代表性高解析度CIsXPS鐠圖顯示在圖28中。應(yīng)當(dāng)指出的是，在本說明書列出的實(shí)施例中，在列出的元素比例中存在一些細(xì)微差異。這些細(xì)微差異源自于由XPS測(cè)定的元素組成是相對(duì)的。即所有元素的原子百分比必須相加為100%。因此，例如，ALAPP薄膜氧化的變化將影響所有其它元素的原子比例。此外，實(shí)驗(yàn)條件的變化對(duì)例如S/C比例也能有影響。實(shí)施例2896孔板中Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)共聚物涂層的制備以及在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中的使用:涂產(chǎn)^^Z^尸尸-^L4尸尸-尸"的果(^家乙#)^面J:丙舉丙;^瘋廢和蘭參#-M4的凝戎果合根據(jù)實(shí)施例15D中的方法用ALAPP薄膜涂覆96孔形式的組織培養(yǎng)聚苯乙烯(PS)板(Nunc，NunclonTMA處理，#167008)。通過XPS分析得到的PS和PS-ALAPP樣品的典型元素比例列在表29中。PS孔表面本質(zhì)上是碳質(zhì)的，在這些板的制造中所采用的表面改性而加入氧(o/c=0.152)。采用ALAPP薄膜的PS表面的涂覆導(dǎo)致N的引入(N/C0.155),這來自于在ALAPP層中的含氮基團(tuán)。此外，由于相比PS表面，ALAPP薄膜的較低氧化度，0/C比例減少(由0.1S2至0.099)。由高解析度ClsXPS語圖(參見圖29(a):注意到在更高結(jié)合能處芳香性'搖擺，峰的存在)可以確定聚苯乙烯屬性(具有適度的氧化度)。由于大量C、N和O物種的存在，在PS表面上的ALAPP薄膜的沉積導(dǎo)致更寬的高解析度Cls鐠圖。更高結(jié)合能處的芳香性'搖擺，峰由于ALAPP覆蓋層而消失從而證實(shí)了全厚度的XPS取樣深度(10nm)的涂層。除使用DMSO替代DMF作為溶劑并且未加入水作為共溶劑之外，按照實(shí)施例15B將PI共聚物共價(jià)地偶聯(lián)至PS-ALAPP樣品表面。通過XPS分析得到的PS-ALAPP-PI樣品的典型元素比例列在表29中。此處，可以觀察到相比PS-ALAPP樣品，0/C比例增加而N/C比例減少，這與PI共聚物共價(jià)地接枝到PS-ALAPP表面上的覆蓋層的存在相一致。此73外，來自PI共聚物中的半硫代氨基曱酸酯部分的S也存在于PS-ALAPP-PI樣品中，但不存在于PS-ALAPP樣品中，證實(shí)了共價(jià)連接。PI共聚物成功共價(jià)偶聯(lián)至PS-ALAPP樣品表面的其它證據(jù)通過高解析度ClsXPS譜圖(參見圖29(c))的分析得到，令人感興趣的主要特征是由于存在來自于共價(jià)連接PI覆蓋層的羧酸殘基而促成譜圖中高結(jié)合能的存在。該譜圖特征部分在由PS-ALAPP樣品(參見圖29(b))獲得的高解析度Clsi普?qǐng)D中并不存在。如上制備96孔板形式的PS-ALAPP-PI涂覆板。制備(i)丙烯酰胺單體(10%w/v,3mLDMSO中300mg)和(ii)3mLDMSO中的丙烯酰胺單體(150mg)和生物素-MA(87mg，按照實(shí)施例15B中所述的方法合成，并使用氮?dú)饷撗?0分鐘。然后密封裝有單體的燒瓶并連同用戶定制UV聚合室(配有o-環(huán)密封石英玻璃蓋的不銹鋼)和PS-ALAPP-PI涂覆96孔板轉(zhuǎn)移到手套箱中。然后將單體溶液等分試樣(IOO^L)用移液管轉(zhuǎn)移到PS-ALAPP-PI涂覆96孔板的小孔中。裝有單體溶液的96孔板隨后轉(zhuǎn)移到UV聚合室中，密封小室并從手套箱中取出。在UV聚合室(其中所述孔部分充滿單體溶液)中的PS-ALAPP-PI涂覆96孔板的四分之一(掩模覆蓋在板的其余四分之三上)然后依次采用EXFOArticure400燈進(jìn)行UY光輻射(320-500nm波長；50mWcm-2)30分鐘。在板的所有四分之一部分均用UV光輻射以后，打開小室并取出96孔板。然后用DMSO清洗板的每個(gè)孔兩次(每次清洗用250(iLDMSO1至1.5小時(shí))，然后在DMSO(每孔中250pL)浸泡過夜。最后，用MilliQTM純化水充分清洗(三次，l-1.5小時(shí))。所述板然后在XPS分析之前在層流拒中干燥。在一些情況下，用NeutrAvidin生物素結(jié)合蛋白(PierceBiotechnologyInc.)(HEPES緩沖液中50i!g/mL)部分充滿(100(iL)小孔，并在室溫保溫過夜。所述孔然后在lMNaCl(兩次，兩小時(shí)，然后過夜)和HEPES緩沖液(三次，兩小時(shí))中沖洗，最后在干燥前，在30分鐘時(shí)間里在MilliQTM純化水中沖洗五次。HEPES合成儀含有150mMNaCl和20mM[7V-2-羥乙基)-l-哌。秦-W-2-乙烷磺酸，鈉鹽](HEPES)并用1MNaOH溶液調(diào)整至pH7.2。對(duì)于XPS分析，使用特別設(shè)計(jì)的不銹鋼工具(從板下方)無污染地從板上移去每個(gè)孔的底部，然后安裝到避免加樣的特殊設(shè)計(jì)XPS樣品支架上。列在表29中的是由PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)和PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)樣品的XPS分析計(jì)算而得的元素比例。PS-ALAPP-PI樣品表面上P(丙烯酰胺)的接枝聚合導(dǎo)致0/C和N/C比例的增加，與P(丙烯酰胺)薄涂層的存在相一致。PS-ALAPP-PI樣品表面上P(丙烯酰胺-共-生物素MA)的接枝聚合導(dǎo)致N/C原子比例增加，再次與薄接枝共聚物涂層的存在相一致。此外，S/C比例在接枝聚合反應(yīng)后增加，表明來自生物素-MA單體的生物素加入到涂層中。應(yīng)當(dāng)注意的是接枝聚合物涂層薄于XPS取樣深度。通過與硅晶片基材上的相似涂層的XPS分析得到的組成(參見實(shí)施例15)進(jìn)行比較可對(duì)此進(jìn)行確認(rèn)。這可由相比平整硅晶片基材而言96孔板的孔中較低強(qiáng)度的UV輻射預(yù)計(jì)到。上述接枝聚合反應(yīng)成功的確認(rèn)可通過高解析度XPS圖語分析得到。在圖29(d)和(e)中顯示的是由PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)和PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)樣品表面得到的高解析度ClsXPS譜圖。兩張譜圖均含有與存在酰胺相一致的特征(來自結(jié)合能288eV處的丙烯酰胺單體的聚合)。由于涂層中生物素MA的存在，來自PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)樣品的譜圖中的酰胺峰不如來自PS-ALAPP-PI-P(丙蜂酰胺)的諉圖明顯。該趨勢(shì)也在實(shí)施例15中觀察到。也包括在表29中的是由在NA溶液中保溫后的PS-ALAPP-PI-(丙埽酰胺-共-生物素MA)樣品表面的XPS分析得到的元素比例。觀察到顯著的0/C和N/C比例增加，與NeutraVidinTM(NA)結(jié)合到PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)樣品上相一致。在顯示于圖29(f)中的該樣品的高解析度Cls譜圖中存在的特征是表面上存在蛋白(即NA)的特征。表29:由PS，PS-ALAPP，PS-ALAPP-PI，PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)，PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)和PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)-NA樣品的XPS分析計(jì)算而得的元素比例樣品O/CN/Cs/cPS0.1520.000o細(xì)PS陽ALAPP0.0990.1550細(xì)PS-ALAPP-PI0.2900.108o扁<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>命為^S:炎^7尸5^丄v4尸P-尸/-丙雄教展_#-_^凌覆96/6^的躇炎名瘦戎,試-繪(EZJ5^)如上制備其中孔涂覆有iY《舉教麼-4-^:參,Mi)^P6A多^;W凝諒定威。在測(cè)試的U個(gè)孔中的三個(gè)，如部分A所述也加入NeutrAvidinTM生物素結(jié)合蛋白(PierceBiotechnology,Inc.)(NA)。阻斷所有測(cè)試的孔。將等分試樣(200)aL)的TBS緩沖液(25mM2-氨基-2-羥甲基-l,3-丙二醇，136mMNaCl，2.7mMKC1，用1MHCl調(diào)節(jié)至pH8)中的牛血清白蛋白(BSA)阻斷溶液(10/。BSA)加入到所述板的孔中，并在4。C進(jìn)行過夜保溫。向裝有結(jié)合NA的孔和未裝有NA(生物素化IgG(l。Ab)對(duì)照)的四個(gè)其它孔中，移去BSA阻斷溶液并加入100pL生物素-SP-軛合山羊抗-小鼠IgG(JacksonImmunoResearch，存115-066-072)(l。Ab)溶液，所述溶液已經(jīng)用含有Tween20(0.05重量％)的1重量％BSA的TBS緩沖液溶液(TBST緩沖液)以1:1000稀釋至2嗎/mL的濃度，加入到板上的一些孔中。覆蓋裝有生物素化IgG(l。Ab)的孔并在室溫保溫4小時(shí)。從剩余的四個(gè)孔(未加入l。Ab)中移去生物素化IgG溶液和BSA阻斷溶液，并用TBST緩沖液清洗所述孔三次。然后向所有11孔中加入100猴抗山羊Ig-HRP軛合物(Silenus存UAH)溶液，所述溶液已經(jīng)用含有1重量。/。BSA的TBST合成儀以1:500進(jìn)行稀釋。在保溫1.5小時(shí)后，移去猴抗山羊Ig-HRP軛合物溶液并用TBST緩沖液清洗所述孔三次。等分試樣(100^L)的顯影劑(ABTS)隨后加入到所有測(cè)試的ll孔中。ABTS溶液含有溶解在檸檬酸緩沖液(10mL)中的2，2'-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(5mg),并向其加入20過氧化氫。所述溶液在制備后立即使用。15分鐘之后，從所有孔中移去ABTS溶液并轉(zhuǎn)移到新微滴定96孔板中以便于在BiotekELISA板讀數(shù)器中以405nm的波長進(jìn)行讀數(shù)。測(cè)試的孔指定如下(i)向其連接有NA并加入l。Ab和2。Ab的孑L(+NA,+l°Ab，十2。Ab)。(ii)不含有NA并加入l。Ab和2。Ab的孑L(-NA,十l。Ab，+2。Ab)。(iii)不含有NA，不加入l。Ab但假如2。Ab的孑L(-NA，-l。Ab,+2。Ab)。含有結(jié)合NA的孔按預(yù)期將與生物素化IgG(1°Ab)相結(jié)合并形成能通過使用ELISA板讀數(shù)器測(cè)量已顯影的溶液的吸光度而檢測(cè)到的HRP軛合物。針對(duì)測(cè)試孔得到的數(shù)據(jù)列在圖30中。此處，^l對(duì)于含有連接到P(丙烯酰胺-共-生物素MA)涂層上的NA的孔(+NA,+l。Ab,+2°Ab)而言測(cè)定的吸光度較高(1.05)。對(duì)于不含有結(jié)合NA但加入1。Ab的孔(-NA,+l°Ab,+2°Ab)，得到的低吸光度(0.089)證實(shí)了生物素化IgG(l。Ab)的低一夂特異性吸附。該數(shù)據(jù)是PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)涂層結(jié)合NA和l。Ab的非特異性吸附較低的明顯證據(jù)，NA可用ELISA試驗(yàn)進(jìn)行一企測(cè)。此外，對(duì)于2。Ab對(duì)照(-NA,-l°Ab，十2。Ab)得到的吸光度也很低(0.084),表明2。Ab在PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)涂層上的非特異性吸附也很低。實(shí)施例29Si-ALAPP-PI表面上PEGMA(475)的梯度接枝聚合:Sz'^Z^i^-PL^面J:尸五GM4075」的V^^凝戎果合按照實(shí)施例15制備Si-ALAPP表面，按照實(shí)施例4進(jìn)行將PI共聚物共價(jià)偶聯(lián)到Si-ALAPP表面上。然而，在本實(shí)施例中，干凈玻璃顯微鏡載玻片替代硅晶片用作基材。簡(jiǎn)言之，六片ALAPP處理的玻璃顯微鏡載玻片放置在含有9mLPI溶液(參見實(shí)施例3)，DMF(27mL)，MilliQTM純化H20(4.5mL)和AK3-二曱基氨基丙基)-AA-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,0.45g,Sigma)的溶液中。反應(yīng)在室溫進(jìn)行過夜，隨后玻璃顯纟鼓鏡載玻片在DMF(—日內(nèi)兩次，隨后過夜清洗)和純凈水(一日內(nèi)三次)中清洗，隨后在層流拒中千燥。以上制備的Si-ALAPP-PI載玻片隨后放入配有o-環(huán)密封石英玻璃蓋的用戶定制不銹鋼室。向該室中加入已經(jīng)用氮脫氣30分鐘的單體溶77液(去抑制的PEGMA(475),10%w/v)。然后將蓋住大部分不玻璃載玻片面積(1.5cm長度保持暴露)的UV不透明掩膜放置在石英玻璃窗頂部。掩膜和Si-ALAPP-PI樣品之間的距離是lcm。使用EXFOArticure400燈進(jìn)行五分鐘的玻璃載玻片的暴露區(qū)域的UV輻射(320-500nm波長；50mWcm々強(qiáng)度)。在輻射后五分鐘后，掩膜沿玻璃載玻片移動(dòng)lcm并再進(jìn)行5分鐘的UV輻射，等等，得到總共具有不同輻射時(shí)間的7個(gè)區(qū)域(參見圖31)。在載玻片的末端，1cm的區(qū)域未接受任何UV輻射。因此，在載玻片的中心，總UV輻射是15分鐘。在已經(jīng)進(jìn)行所有輻射處理之后取出樣品，用MilliQ純化水充分地清洗，在MilliQTM純化水中浸泡兩天，其中間歇地更換，最后再用MilliQTM純化水沖洗。在XPS分析前，將樣品在層流拒中干燥。列在表30中的是由與沿載玻片7cm處未暴露于UV輻射的對(duì)照區(qū)域相比的沿Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))涂覆載玻片的區(qū)域以及來自實(shí)施例5的全厚度Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))樣品的XPS分析測(cè)定的元素比例。此處，沿載玻片的6、5和4cm分別表示5、10和15分鐘的UV輻射。由這些數(shù)據(jù)可以明確在進(jìn)行分析的四個(gè)區(qū)域中得到的元素比例數(shù)據(jù)相差很大。隨著敷設(shè)時(shí)間增長，0/C比例增加而N/C比例減少。由于存在隨著輻射時(shí)間增長厚度逐漸增加的P(PEGMA(475))接枝層從而可以預(yù)計(jì)到這些趨勢(shì)。這些趨勢(shì)也存在于圖32中，其中空心圓圏表示0/C比例而實(shí)心圓圈表示N/C比例。應(yīng)當(dāng)指出的是沿載玻片輻射至多為15分鐘的所有點(diǎn)的P(PEGMA(475))涂層厚度均小于XPS取樣深度(10nm)(參見與表30中來自實(shí)施例5的全厚度數(shù)據(jù))。P(PEGMA(475)隨輻射時(shí)間具有不同厚度的進(jìn)一步證據(jù)也可由高解析度C1s谫圖分析得到(參見圖33(a)至(c))。此處可以看到Cls形狀以隨逐漸增長的UV輻射時(shí)間的漸變方式由0UV輻射時(shí)間時(shí)Si-ALAPP-PI表面(參見圖33(a))所預(yù)測(cè)的形狀的變化至由小于XPS取樣深度的Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))涂層所預(yù)測(cè)的形狀(參見圖33(b)和(c))。尤其值得注意的是隨著輻射時(shí)間由0(7cm處)增長至15分鐘(4cm處)，C-0部分(結(jié)合能286.5)的增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>可通過停止uv輻射，移動(dòng)掩模然后繼續(xù)uv輻射從而增加P(PEGMA(475))涂層厚度的事實(shí)是該接枝聚合反應(yīng)(i)由UV輻射引發(fā)和(ii)本質(zhì)上是活性聚合的直接證據(jù)。具有掩蔽和未掩蔽區(qū)域的接枝聚合物涂覆玻璃載玻片057^丄^尸尸-戶/-尸(？￡(^1"~75)"轉(zhuǎn)移到4-室培養(yǎng)盤(Nunc,Roskilde,Denmark)并且在室溫，每片載玻片浸沒在含有青霉素和鏈霉素(分別為120pg/mL和200(ig/mL)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH7.4),無血清培養(yǎng)基(SFM,Dulbecco'sModifiedEaglesMedium/Ham'sF12(50:50))的無菌溶液中三個(gè)半小時(shí)。取出以上步驟的無菌溶液，并將HeLa細(xì)胞以1x106細(xì)胞/室的密度接種在由添加有10o/。(v/v)牛胚胎血清(FBS)的SFM構(gòu)成的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37。C，含有5%C02的潮濕空氣中保溫24小時(shí)。在18和24小時(shí)保溫后，通過相差顯微鏡(01ympus1x81,奧林巴斯，曰本)觀察HeLa細(xì)胞并電子記錄代表性圖像。正如之前在實(shí)施例9中，HeLa細(xì)胞在Si-HAPP-PA表面上很好地附著和擴(kuò)展而在厚Si-HAPP-P(PEGMA(475》表面上不能很好地附著和擴(kuò)展。該差異可歸結(jié)于阻擋HeLa細(xì)胞附著的接枝P(PEGMA(475))層的存在。由圖W(a)至(e)中所顯示的低輻射時(shí)間(圖3《a))從而導(dǎo)致薄P(PEGMA(475))涂層的細(xì)胞附著的圖像可以清楚地看到，具有相比PS對(duì)照(圖34(e))略微較低的密度的大量細(xì)胞附著。此外，在載玻片的5分鐘UV輻射區(qū)域中所觀察到的細(xì)胞擴(kuò)展非常類似于PS對(duì)照。然而，隨著輻射時(shí)間增長，由此導(dǎo)致涂層厚度增加，細(xì)胞附著程度如如期減少。此外，隨設(shè)輻射時(shí)間增長，細(xì)胞擴(kuò)展量明顯減少至在20分鐘UV輻射區(qū)域(圖34(d))上具有非常圓的形態(tài)的極少量細(xì)胞附著的情況。應(yīng)當(dāng)理解在本說明書中公開和限定的本發(fā)明擴(kuò)展至文字或圖像所提到的或顯而易見的兩個(gè)或兩個(gè)以上特征的所有替代性組合。所有這些不同的組合構(gòu)成了本發(fā)明的不同替代性方面。權(quán)利要求1.一種含有高分子的可控聚合物表面涂層，該可控聚合物表面涂層與基材表面共價(jià)地連接，所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)；并且含有從至少一些所述聚合引發(fā)子上接枝出的側(cè)鏈聚合物。2.如權(quán)利要求l所述的可控聚合物表面涂層，其中所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。3.如權(quán)利要求1或2所述的可控聚合物表面涂層，其中所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。4.如權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)所述的可控聚合物表面涂層，其中通過受控的自由基活性聚合而由所述聚合引發(fā)子上接枝出所述側(cè)鏈聚合物。5.如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的可控聚合物表面涂層，其中所述可控聚合物表面涂層還含有接枝在所述側(cè)鏈聚合物上的其它聚合物。6.如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的可控聚合物表面涂層，其中所述可控聚合物表面涂層還含有連接在所述側(cè)鏈聚合物上的至少一種生物活性成分。7.如權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)所述的可控聚合物表面涂層，其中所述側(cè)鏈聚合物具有受控結(jié)構(gòu)。8.如權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)所述的受控聚合物表面涂層，其中所迷側(cè)鏈聚合物調(diào)控生物應(yīng)答。9.如權(quán)利要求8所述的受控聚合物表面涂層，其中所述側(cè)鏈聚合物調(diào)控細(xì)胞附著。10.—種將聚合引發(fā)子可控地定位于基材表面上的方法，該方法包括將高分子與所述表面共價(jià)地連接，其中所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)。11.一種在基材表面上制備可控聚合物表面涂層的方法，該方法包括將含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)的高分子與所述表面共價(jià)地連接，并且從至少一些所述聚合引發(fā)子上接枝出側(cè)鏈聚合物。12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述高分子含有至少1%的預(yù)定摩爾比的聚合引發(fā)子。13.如權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合引發(fā)子是受控的自由基聚合引發(fā)子。14.如權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過受控的自由基活性聚合而由所述聚合引發(fā)子上接枝出所述側(cè)鏈聚合物。15.如權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括提供接枝在所述側(cè)鏈聚合物上的其它聚合物。全文摘要本發(fā)明涉及一種含有高分子的可控聚合物表面涂層，該可控聚合物表面涂層與基材表面共價(jià)地連接，所述高分子含有多個(gè)聚合引發(fā)子和多個(gè)表面結(jié)合基團(tuán)；并且含有從至少一些聚合引發(fā)子上接枝出的側(cè)鏈聚合物。文檔編號(hào)C09D201/02GK101528876SQ200780038977公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2007年8月17日優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日發(fā)明者保羅·帕西克,勞倫斯·馬爾,格雷厄姆·約翰森,理查德·A·伊萬斯,赫爾穆特·西森申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織