專(zhuān)利名稱(chēng)：黃色熒光染料及其合成方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于熒光染料合成領(lǐng)域，特別涉及具有黃光發(fā)射的熒光染料及其合成 方法與用途。
背景技術(shù)：
隨著信息技術(shù)的迅速發(fā)展,人們對(duì)高密度和高清晰度的顯示技術(shù)有了更高的
要求。熒光現(xiàn)象早在16世紀(jì)就被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)熒光的產(chǎn)生原理和條件直到19世 紀(jì)中期才清楚。從1867年G叩petsroder釆用桑色素為熒光試劑熒光法檢測(cè)鋁， 到20世紀(jì)初，人們已經(jīng)知道包括羅丹明、熒光素、稠環(huán)芳烴及曙紅等在內(nèi)的 600余種化合物有熒光。隨后Wawwillous進(jìn)行了熒光產(chǎn)率的測(cè)定(1924年)， Gavila對(duì)熒光壽命進(jìn)行了測(cè)定(1926年)。之后儀器的發(fā)展與熒光試劑相結(jié)合， 出現(xiàn)了多種熒光分析方法，如時(shí)間分辨熒光測(cè)定、微分熒光測(cè)定、熒光偏振及 同步熒光測(cè)定等。時(shí)至今曰，由于熒光的高靈敏度、新型熒光試劑和儀器的優(yōu) 良性能，熒光分析及熒光檢測(cè)已成為化學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)的有力研究工具 和重要的研究方法。
在有機(jī)熒光染料中，有些化合物可以作為熒光探針染料與生物大分子結(jié)合 形成熒光探針，有些可以直接作為熒光探針對(duì)生物體內(nèi)的相關(guān)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)、生 命過(guò)程進(jìn)行識(shí)別、熒光標(biāo)記和熒光顯影。免疫熒光技術(shù)利用細(xì)胞骨架蛋白熒光 探針對(duì)細(xì)胞骨架研究起到了極大地推動(dòng)作用。用生化方法分別提純細(xì)胞骨架的 蛋白質(zhì)，如微管主要成分微管蛋白，微絲的肌動(dòng)蛋白，中間纖維的多種蛋白成 分等，將這些蛋白提純分別注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，產(chǎn)生抗體，用熒光探針染料標(biāo)記 的抗體和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)后，在熒光顯微鏡下就可以顯 示蛋白細(xì)絲在細(xì)胞內(nèi)的分布。由于細(xì)胞骨架是最容易用熒光試劑標(biāo)記的成分之 一，應(yīng)用熒光探針研究細(xì)胞骨架具有廣泛的應(yīng)用前景，同時(shí)具有很重要的理論研究?jī)r(jià)值。例如，使用熒光探針可以對(duì)Y-微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)的含量及定位進(jìn)行
研究(A. Liang， F. Ruiz， K. Heckmann， et al.,五wra/ .CW/5/o/" 1996， 70: 331. V. Muresan， M. C. Joshi， J. C. Besharse， J！ Ce〃5W" 1993, 104: 1229 ) .Rusan等用熒 光探針標(biāo)記的ct -微管蛋白的LLCPK-la細(xì)胞首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中定量分析 了細(xì)胞間期和分裂期微管動(dòng)力學(xué)參數(shù)(N. M. Rusan, C. J. Fagerstrom, A.M. Yvon, etal.，Mo/.5/o/. Ce〃， 2001,12(4): 971.)。單克隆抗體免疫熒光技術(shù)在病原微生物 的鑒定(紀(jì)巍，辛?xí)匝?，陳必良，解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2001, 26 (6): 470.劉軍 連，徐志凱等，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004， 25 (8): 728.)、 SARS診斷(車(chē)小 燕，丘立文等，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003, 23 (7): 640. K. Wen, Y. B. Mei， et al., J M//.[/wiv., 2004, 24( 1): 1.)、禽流感的診斷(趙維波，陳美才等，中 囯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004, 12 (4): 200.)等方面均有廣泛的應(yīng)用。
如何得到不同種類(lèi)的標(biāo)記試劑在蛋白質(zhì)標(biāo)記領(lǐng)域中非常困難。首先，很難找 到不具有重疊的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光試劑，因?yàn)榈湫偷挠袡C(jī)熒光染料的半發(fā)射波長(zhǎng) 一般為40-80nm,而可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍一般僅在350-400nm。其次，即使存在不具 重疊發(fā)射光譜的熒光試劑，但因其熒光量子產(chǎn)率非常低也是無(wú)法應(yīng)用于熒光標(biāo) 記，第三，當(dāng)幾種熒光同時(shí)應(yīng)用時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)的選擇又非常困難，因?yàn)檫@幾種 熒光試劑的吸收波長(zhǎng)波段會(huì)非常寬而無(wú)法分開(kāi)。因此只有當(dāng)能夠達(dá)到每種熒光 染料的相應(yīng)最大吸收波長(zhǎng)的光進(jìn)行照射時(shí)許多有效熒光染料才能收到激發(fā)。第 四，當(dāng)不同單元片斷的數(shù)目超過(guò)幾百道爾頓時(shí)，染料生物化學(xué)性質(zhì)以及它們與 生物片斷連接方式就會(huì)變得尤為重要。電荷，分子量以及染料的結(jié)構(gòu)和連接鏈 要求不能影響蛋白質(zhì)片斷的電泳淌度，使其還具有舒展的結(jié)構(gòu)。最后，熒光染 料必須與蛋白質(zhì)片斷的化學(xué)性質(zhì)具有兼容性。
在以上的影響因素下，很少有熒光染料能用于診斷及免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。例 如。Smith et al, A^wc/e/c ^".ds i ^eaw/7, 1985, 13, 2399; Prober et al， 1987, 238, 336; Hood et al, European專(zhuān)利8500960; Connell et al, Biotechniques, 1987, 5， 342。綜上所述，在診斷技術(shù)及免疫分析技術(shù)手段中還需要有新型結(jié)構(gòu)的熒光探針
染料。它必須具有以下特征(l)所選的染料要不影響蛋白質(zhì)片斷的生物活性;
(2)易用性，不需要分離固定、終止和脫色步驟；(3)高敏感性，激光掃描儀 可以檢測(cè)凝膠中亳克(納克)量的染料染色的蛋白質(zhì)；(4)線(xiàn)性定量范圍寬；
(5)均一的蛋白質(zhì)染色；(6)光穩(wěn)定性好，可以長(zhǎng)時(shí)間拍照；(7)與多種儀器兼 容；(8)化學(xué)穩(wěn)定性好，染色凝膠的熒光可在數(shù)天保持穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的之一是提供一種黃色熒光染料,該熒光染料的熒光發(fā)射光譜位 于可見(jiàn)光譜的黃色光區(qū)，并且具有很高的熒光量子產(chǎn)率。
本發(fā)明的再一目的是提供一種黃色熒光染料的合成方法,該方法具有反應(yīng)步 驟較少、操作簡(jiǎn)便、收率高、產(chǎn)物分離純化容易等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種黃色熒光染料的用途。
本發(fā)明提供一種全新的黃色熒光染料，該熒光染料具有以下結(jié)構(gòu)
&、 R2選自氯、氟、溴或氫，也就是說(shuō)Rp R2可以同時(shí)為氯、氟、溴或 氫，也可以分別為氯、氟、溴或氫，n為3至7的正整數(shù)。 本發(fā)明的黃色熒光染料的合成按如下反應(yīng)式進(jìn)行
發(fā)明內(nèi)容其中原料1為3， 6-二氯苯甲三酸酐，其具有如下結(jié)構(gòu):
原料2為取代間苯二酚，其具有如下結(jié)構(gòu):
三氟乙酸琥珀酰亞胺碳酸酯結(jié)構(gòu)如下:
直鏈氨基酸結(jié)構(gòu)如下
NH2(CH2)nCOOH n為3至7的正整數(shù)。 中間產(chǎn)物3取代熒光素縮合化合物，其具有如下結(jié)構(gòu)式:<formula>formula see original document page 8</formula>
中間產(chǎn)物4取代新戊酸酯熒光素化合物，其具有如下結(jié)構(gòu)式:
<formula>formula see original document page 8</formula>
中間產(chǎn)物5取代6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽，其具有如下結(jié)構(gòu)式:
<formula>formula see original document page 8</formula>中間產(chǎn)物6取代6-羧基熒光素新戊酸酯，其具有如下結(jié)構(gòu)式:<formula>formula see original document page 8</formula>
中間產(chǎn)物7取代二叔戊酰基-6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯，其 具有如下結(jié)構(gòu)式<formula>formula see original document page 8</formula>
黃色熒光染料8取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基熒光素具有如下結(jié)構(gòu)式:Ri
H(\丄
^/COOH I T
o-c、i
NH(CH2)nCOOH
R!、 R2選自氯、氟、溴或氫，n為3至7的正整數(shù)。 具體合成步驟如下
(1) 中間產(chǎn)物取代熒光素縮合化合物的合成
向濃硫酸溶液中加入取代的間苯二酚和3， 6-二氯苯甲三酸酐，其中，濃硫 酸的用量為每5mmo1 3, 6-二氯苯甲三酸酐需3ml,取代間苯二酚和3， 6-二氯 苯甲三酸酐的摩爾比為2-2.5:1,加熱至ij 170-19(TC反應(yīng)24-72小時(shí)，倒入冰水中, 抽濾，干燥得中間產(chǎn)物取代熒光素縮合化合物。
(2) 中間產(chǎn)物取代新戊酸酯熒光素的合成
向步驟(l)得到的取代熒光素縮合化合物中加入新戊酸酐，其中，新戊酸酐 與熒光素縮合化合物的摩爾比是5-6:1，在21(TC下加熱回流2-3小時(shí)；冷卻， 分別加入與新戊酸酐體積比為2:1的四氫呋喃及水，攪拌2-4小時(shí)，加入與新戊 酸酐體積比為5:1的乙醚，分出水層，有機(jī)層依次用緩沖溶液，鹽酸，飽和氯 化鈉溶液洗滌，用干燥劑干燥。蒸除溶劑，得中間產(chǎn)物取代新戊酸酯熒光素。
(3) 中間產(chǎn)物取代6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽的合成 向步驟(2)中加入絕對(duì)乙醇，再加入二異丙胺，其中，絕對(duì)乙醇與步驟(2)的
新戊酸酐體積比為6:1, 二異丙胺與步驟(2)中熒光素縮合化合物的摩爾比為 5-6:1,搖勻，于-20。C放置24h,有沉淀析出，抽濾，干燥，得中間產(chǎn)物取代6-
羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽；
(4) 中間產(chǎn)物取代6-羧基熒光素新戊酸酯的合成
向步驟(3)得到的取代6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽中加入溶劑，用鹽 酸洗滌，干燥劑干燥，得中間產(chǎn)物取代6-羧基熒光素新戊酸酯；
(5) 中間產(chǎn)物取代二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯的 合成向步驟(4)中得到的取代6-羧基熒光素新戊酸酯加入溶劑和弱堿及二琥珀酰
亞胺碳酸酯，其中二琥珀酰亞胺碳酸酯和6-羧基熒光素新戊酸酯的摩爾比為 8-10:1，弱堿與6-羧基熒光素新戊酸酯的摩爾比為8-10:1, TLC監(jiān)測(cè)，停止反應(yīng)， 依次用緩沖溶液，鹽酸及飽和食鹽水洗滌，用干燥劑干燥，蒸除溶劑，得取代 二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯；
(6) 中間產(chǎn)物取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基熒光素的合成 向步驟(5)中得到取代二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸
酯,加入溶劑，滴加直鏈氨基酸的二氯甲烷溶液，其中直鏈氨基酸的二氯甲烷溶 液的摩爾濃度為0.2-0.4mol/L，直鏈氨基酸與取代二叔戊酰基-6-羧基熒光素-^ 羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯的摩爾比為1.2-1.5:i, TLC監(jiān)測(cè)，待反應(yīng)完，依次用 鹽酸，飽和食鹽水洗滌，干燥劑干燥，過(guò)色譜柱收集中間取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊?；鶡晒馑兀?br> (7) 黃色熒光染料的合成
向步驟(6)中得到取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊?；鶡晒馑刂屑尤霛獍彼叭?劑，反應(yīng)完，氨水層用鹽酸酸化，其中濃氨水與溶劑體積比為1-2:1，抽濾，千燥 得黃色熒光染料。
在上述合成方法中，合成過(guò)程中得到的取代熒光素縮合化合物可以不純化而 直接進(jìn)行反應(yīng)合成新戊酸酯熒光素。
在上述合成方法中，合成過(guò)程中得到的取代二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥 基琥珀酰亞胺基碳酸酯可以不純化而直接進(jìn)行反應(yīng)合成取代6-(羧基酰胺基)-二 叔戊?；鶡晒馑?。
在上述合成方法中，所述的溶劑為二氯甲烷，乙醚，乙醇。 在上述合成方法中，所述的弱堿包括三乙胺，吡啶。
在上述合成方法中，所述TLC監(jiān)測(cè)所用溶劑為甲醇，三氯甲烷，乙酸乙酯 或它們的混合溶劑。
在上述合成方法中，所述色譜柱所用流動(dòng)相溶劑為三氯甲烷，乙酸乙酯混合溶劑。所用的固定相為53-75pm的柱層析硅膠。
在上述合成方法中，所述的干燥劑為無(wú)水硫酸鈉或無(wú)水硫酸鎂。
在上述合成方法中，所述的緩沖溶液為pt^7的磷酸鈉鹽緩沖溶液。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果①本發(fā)明化合物引入了不同數(shù)目的氯，氟，溴 取代基，其中不同數(shù)目氯原子的引入使該化合物具有更窄的發(fā)射光譜，增大了 Stokes位移，其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊減少，有利于提髙其分辨率；②本 發(fā)明提供了一種全新的黃色熒光染料，該熒光染料的熒光發(fā)射光譜位于可見(jiàn)光 譜的黃色光區(qū)；③本發(fā)明熒光染料具有很高的熒光量子產(chǎn)率和很好的熒光標(biāo)記 能力，可以用在蛋白標(biāo)記上；④連接鏈的長(zhǎng)度控制在r^3-7，這使熒光染料分子 間不會(huì)發(fā)生重疊，從而不會(huì)發(fā)生熒光淬滅，其中當(dāng)n二5-6時(shí)效果最佳。


圖l為本發(fā)明合成得到的熒光標(biāo)記試劑的激發(fā)光譜； 圖2為本發(fā)明合成得到的熒光標(biāo)記試劑的發(fā)射光譜； 圖3為本發(fā)明熒光試劑著色顯示的U20S細(xì)胞圖像； 圖4為本發(fā)明為熒光試劑著色顯示的Hda細(xì)胞圖像；
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步描述發(fā)明的黃色熒光染料的合成方法。 實(shí)施例1: 4，7,2、,7'-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-熒光素的合成 (1)化合物4,7，2、,7、-四氯-5(6)-羧基熒光素的合成，合成步驟如下
<formula>formula see original document page 11</formula>
在裝有回流冷凝管，干燥管的50mL三口燒瓶中加入1.39g (5.33mmo1) 3， 6-二氯苯甲三酸酐，1.70g (11.80mmo1) 4-氯間苯二酚和5.00ml濃硫酸，磁子 攪拌，升溫至190'C反應(yīng)24h，冷卻至室溫，將反應(yīng)液分批倒入冰水混合液中，并劇烈攪拌。抽濾得棕黃色濾餅，干燥得粗產(chǎn)品2.50g,產(chǎn)率91.20。/。 MALDI-TOF MS, m/z: 515.55 (calcd. 514.09); 紅外FT-IR(KBr)，Wcm": 3421， 1759， 1608, 1434, 1212。 (2)化合物4，7,2、,7、-四氯-5(6)-羧基熒光素新戊酸酯的合成
在裝有干燥管，回流冷凝管的100mL三口燒瓶中加入2.50g ( 4.86mmo1)化 合物4,7,2、，7、-四氯-5(6)-羧基熒光素和5.00ml新戊酸酐，回流2小時(shí)，冷卻至 室溫，加入10.00ml四氫呋喃及10.00ml水，劇烈攪拌2小時(shí)。加入50.00ml 乙醚，分出水層，有機(jī)層用50.00ml的1M鹽酸，飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水 MgS04干燥過(guò)夜待用。得深褐色漿狀液體。
(3)化合物4,7,4、,-四氯-6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽的合成
將上步漿狀液體溶解在30.00ml絕對(duì)乙醇中，再加入3.00ml二異丙胺，搖 勻，于-20。C放置24h,有沉淀析出，抽濾，用無(wú)水乙醇洗滌，干燥，得1.50g, 產(chǎn)率39.50%。
MALDI-TOF MS, m/z:682.54 (calcd.682.69);
紅外FT-IR(KBr),Wcm":3440， 2979, 1767， 1640, 1094;
核磁JHNMR(DMSO) S (ppm) 1.19(d, 12H), 1.34(S,18H), 3.44(a quintet, 2H), 7.49(S,2H), 7,52 (S,2H)，8,40(S，1H)。
(4)化合物4，7,4、,5、-四氯-6-羧基熒光素新戊酸酯的合成<formula>formula see original document page 13</formula>
將上步所得二異丙銨鹽1.50g(1.92mmo1)溶解在二氯甲烷中，用1M鹽酸 洗滌(2t25ml),有機(jī)層用無(wú)水MgS04干燥，蒸除溶劑，得4,7，4、，5、-四氯-6-羧 基熒光素新戊酸酯1.18g，產(chǎn)率90.80%。
MALDI-TOF MS, m/z: 682.89 (calcd. 682.33);
紅外FT-IR(KBr)， "o/cm.1: 2976 , 1765, 1478, 1408, 1093;
核磁！HNMR(CDCl3) 5(ppm) 1.40(s, 18H), 6.91 (s， 2H), 7.13(s， 2H), 8.18(s,
1H)。
(5)化合物4,7，2、,7'-四氯-二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺
基碳酸酯的合成<formula>formula see original document page 13</formula>
在100mL三口瓶中加入1.18g (0.352mmo1)化合物4，7，4、，5、-四氯-6-羧基 熒光素新戊酸酯，30.00ml 二氯甲烷，攪拌溶解，再加入l.OOml吡啶和DSC (0.90g， 3.52mmo1)劇烈攪拌，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。待反應(yīng)完全依次用1M鹽 酸(3*25ml)和飽和氯化鈉溶液(2*25ml)洗滌，無(wú)水Na2S04干燥，蒸干溶 劑得黃色固體1.10g,產(chǎn)率81.50%。
(6)化合物4，7，r，7、-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-二叔戊?；鶡晒馑氐暮铣?br> 在100ml三口燒瓶中加入化合物4，7，2、，7:四氯-二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯(1.10 g, 0.35mmol)和30ml 二氯甲烷，滴加6-氨基己酸的二氯甲烷溶液(0.22g溶于20.00mlCH2Cl2)攪拌反應(yīng)，并用TLC監(jiān) 控反應(yīng)進(jìn)度，待反應(yīng)完全依次用1]\4鹽酸(3*251!11)和飽和氯化鈉溶液(2*251111) 洗滌，無(wú)水Na2S04干燥，蒸干溶劑，過(guò)色譜柱收集純產(chǎn)物得白色晶體0.53g, 產(chǎn)率48.20%。
MALDI誦TOF MS, m/z: 795.39 (calcd. 795.49);
紅外FT-IR(KBr),u/cm":3384, 2974, 1768, 1477, 1408,1093;
核磁'HNMR(DMSO) S(ppm) 1.25 (m, 2H), 1.39(s,18H), 1.59(m,4H)， 2.31(m,2H), 3.42(m, 2H), 6.22(b，lH), 6.93(s,2H), 7.11(s, 2H),7.81(s,lH)。 (7)化合物4,7,2',7'-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-熒光素的合成
<formula>formula see original document page 14</formula>
將0.53g (0.67mmo1) 4,7,2，,7、-四氯-6-(6-羧基己酰胺基)-二叔戊?；鶡晒?素溶解在50.00ml 二氯甲烷中，加入50.00ml濃氨水，攪拌1小時(shí)，分去有機(jī)層， 收集氨水層，用1MHCl調(diào)解pH值至1，抽濾，得黃色固體0.36g，產(chǎn)率87.70%。
MALDI - TOF MS, m/z: 628.46 (calcd. 627.25);
紅外FT-IR(KBr)，Wcm":3352, 2937, 1769， 1632， 1435, 1228;
核磁！HNMR(DMSO) 5(ppm) 1.42 (m,2H) ，1.51(m,4 H) ，2.19(m,2H), 3.17(m,2H)， 6.93(s，2H), 7.17(s, 2H), 11.99(s，lH)， 7.82(s,lH), 8.70(s,lH)，11.20(s, 2H)。
通過(guò)上述方法合成得到的熒光標(biāo)記試劑的最大激發(fā)光譜波長(zhǎng)為525nm (圖 1 ),最大發(fā)射波長(zhǎng)為545nm (圖2 )。
該熒光標(biāo)記試劑應(yīng)用于蛋白標(biāo)記，圖3為U20S細(xì)胞中用甲醛定影，上述 的熒光試劑著色，共聚焦激光掃描顯微鏡采集的圖像。圖4為Hda細(xì)胞用100 ul4M甲醛溶液定影，上述的熒光試劑著色，共聚焦激光掃描顯微鏡采集的圖像。由圖3-4可以看出此熒光蛋白標(biāo)記試劑具有很好的熒光特性。
實(shí)施例2: 2、，4,4、，5、,7，7、-六氯-6-(酰氨己酰胺基)熒光素 (1)化合物2、,4，4、，5、,7,7、-六氯-5(6)-羧基熒光素的合成
取41.10g(0.23mo1) 2,4-二氯間苯二酚和26.10g(0.01mol)3,6-二氯-4-羧基鄰 苯二甲酸酐加入500mL三口瓶中，加入200mL濃硫酸，氮?dú)獗Ｗo(hù)下170。C反應(yīng) 36小時(shí)，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)混合物傾入冰水中，有大量磚紅色沉淀析出。抽濾, 得粉紅色固體，產(chǎn)率75.00%。
MALDI誦TOF MS, m/z: 581.90 ( Calcd:582.99 );
紅外FT-IR(KBr),Wcm": 3480, 1768, 1709， 1478, 1433。
(2) 2',4，4',5、,7，7、-六氯-5(6)-羧基熒光素新戊酸酯的合成化合物
取9.00 g (15.0Ommo1) 2、,4,4、,5、,7,7、-六氯-5(6)-羧基-熒光素，加入18mL三 甲基乙酸酐，回流2h,冷至室溫。加入20mLTHF和120mL水，劇烈攪拌2h 后用乙醚萃取，有機(jī)層用pH:7的磷酸鹽緩沖溶液洗滌(40mL*3)，再依次用 50mLlmol/L鹽酸，50mL飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水MgS04干燥。蒸除溶劑， 得漿狀褐色液體。
(3) 2、,4，4、，5、，7，7、-六氯-6-羧基熒光素新戊酸酯的二異丙基胺鹽的合成將上述漿狀液體用80mL無(wú)水乙醇溶解，加入10mL 二異丙基胺后在-20。C
下冷凍過(guò)夜。得白色沉淀，抽濾得到粗品胺鹽，用無(wú)水乙醇洗滌，白色粉末狀 固體，產(chǎn)率40.00%。
MALDI-TOF MS, m/z: 852.52 ( Calcd:852.41 );
紅外FT-IR(KBr),u/cm扁'2979， 2874， 1775， 1642， 1425， 1214， 1075, 682; 核磁！HNMR(DMSO) S (ppm) 1.24(s， 12H), 1.44(s， 18H), 3.25(s， 2H)， 6.87(s， 2H), 7.81(s, 1H)。
(4) 2、，4,4、,5、,7,7'-六氯-6-羧基熒光素特戊酸酯的合成
取上步所得化合物7.00g(8.20mmo1),溶于30mL二氯甲烷中，用lmol/L鹽 酸洗滌(30mL3),有機(jī)層用無(wú)水MgS04干燥。蒸除溶劑得到白色粉末狀固體, 產(chǎn)率95.00%。
MALDI-TOF MS， m/z: 751.30 ( Calcd:751.22 );
紅外FT-IR(KBr),u/cm": 2977, 1778， 1589, 1454, 1425， 1369， 1212, 1078; 核磁& NMR(CDC13) S(ppm) 1.44(s, 18H), 6.87(s， 2H), 8.20(s， 1H)。 (5)2、,4,4、,5、,7,7、-六氯-二叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳
酸酯將上步所得化合物4.80g(6.50mmol)溶于150ml 二氯甲烷中，加入16mL吡 ^^和DSC ( 16.00g, 61.00mmol),劇烈攪拌30 60min， TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完全。 反應(yīng)混合物依次用4%鹽酸(100M1*3)、飽和氯化鈉溶液(100ml^2)洗滌，無(wú)水 Na2S04干燥，蒸除溶劑，干燥得白色固體，產(chǎn)率85.00%。
(6) 2、，4，4、,5、,7,7、-六氯-6-酰氨己酰胺基熒光素特戊酸酯的合成
o^y0 hn^/^c00h
將5.50g(6.50mmol)化合物D溶解在50mL 二氯甲烷中，攪拌下滴加20mL6-氨基己酸(7.70mmol， 0.90g)的二氯甲烷溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌l~2h， TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完全。蒸除溶劑得粉紅色固體，柱色譜分離得白色純品，產(chǎn)率 83.00%。
MALDI -TOF MS, m/z: 861.11, (Calcd:861.02);
紅外FT-IR(KBr), Wcm": 3378, 2975,1778, 1657, 1551, 1454, 1424， 1372， 1211， 1079， 1026, 754;
核磁'HNMR(DMSO)S(ppm)1.44(s，18H,)1.47 1.51(m, 2H),
1.67-1.72(m,2H), 2.39(t, 2H), 3.52(t,2H), 6.89(s, 2H), 7.86(s,lH)。
(7) 2、,4，4、,5'，7，7、-六氯-6-酰氨己酰胺基熒光素的合成 ci ci
ocr^*S^h^ri0i.nh3/h2o cizv丫v"ci
"T^f " 2.hc1
將5.20g(6.00mmo1)化合物E溶解在三氯甲烷中，滴加濃氨水，攪拌2h, 分出水層，用濃鹽酸調(diào)pl^2得粉紅色沉淀，抽濾干燥得化合物，產(chǎn)率75.00%。 MALDI - TOF MS, m/z: 696.44， ( Calcd: 696.14 );
紅外FT-IR(KBr)，Wcm": 3395,2958, 1782,1658, 1548, 1430， 1216,1090, 746;
17核磁iHNMR(DMSO) S(ppm) 1.63 1.70(m, 2H)， 1.85 1.86(m， 2H), 2.34(t, 2H), 3.41(t, 2H)， 6.87(s, 2H), 7.82(s, 1H)。
實(shí)施例3:化合物4,7-二氯-2了-二氟-6-(6-羧基己酰胺基)-熒光素的合成
(1 )化合物4,7-二氯-27-二氟-5(6)-羧基熒光素的合成與實(shí)施例1步驟(1) 類(lèi)似，不同的是2-氟間苯二酚代替2-氯間苯二酚，產(chǎn)率70.00%。
(2) 化合物4,7-二氯-2、,7、-二氟-5(6)-羧基熒光素新戊酸酯的合成與實(shí)施例 l步驟(2)類(lèi)似。
(3) 化合物4，7-二氯-2、,7、-二氟-四氯-6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽的 合成與實(shí)施例l步驟(3)類(lèi)似，產(chǎn)率35.50%。
(4) 化合物4，7-二氯-2、,7、-二氟-6-羧基熒光素新戊酸酯的合成與實(shí)施例1 步驟(4)類(lèi)似，產(chǎn)率90.00%。
(5) 化合物4,7-二氯-2、,7、-二氟-二叔戊酰基-6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰 亞胺基碳酸酯的合成與實(shí)施例1步驟(5)類(lèi)似，產(chǎn)率82.60%。
(6) 化合物4,7-二氯-2、,7、-二氟-6-(6-羧基己酰胺基)-二叔戊酰基熒光素的 合成與實(shí)施例l步驟(6)類(lèi)似，產(chǎn)率80.30%。
(7) 化合物4,7-二氯-2、,7、-二氟-6-(6-羧基己酰胺基)-熒光素的合成與實(shí)施 例1步驟(7)類(lèi)似，產(chǎn)率71.00%。
權(quán)利要求
1、具有如下結(jié)構(gòu)通式(I)的黃色熒光染料R1、R2選自氯、氟、溴或氫，n為3至7的正整數(shù)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述黃色熒光染料，其特征在于R或/和R2為氯，n 是4至6的正整數(shù)。
3、 權(quán)利要求l所述的黃色熒光染料的合成方法，其特征是合成步驟如下(1) 中間產(chǎn)物取代熒光素縮合化合物的合成取代間苯二酚與3， 6-二氯苯甲三酸酐在酸性條件下縮合得到取代熒光 素縮合產(chǎn)物；(2) 中間產(chǎn)物取代新戊酸酯熒光素的合成 取代熒光素縮合產(chǎn)物與新戊酸酐酯化得到取代新戊酸酯熒光素；(3) 中間產(chǎn)物取代6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽的合成 取代新戊酸酯熒光素與二異丙胺合成得到取代6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽；(4) 中間產(chǎn)物取代6-羧基熒光素新戊酸酯的合成取代6-羧基熒光素新戊酸酯二異丙銨鹽酸化得到取代6-羧基熒光素新 戊酸酯；(5) 中間產(chǎn)物取代二叔戊酰基-6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸 酯的合成取代6-羧基熒光素新戊酸酯與二琥珀酰亞胺碳酸酯酯化得到取代二叔 戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯；(6) 中間產(chǎn)物取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊?；鶡晒馑氐暮铣?取代二叔戊酰基-6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯與C3-C7的直鏈氨基酸取代合成得到取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊?；鶡晒馑兀?7)黃色熒光染料的合成。
4、如權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征是所述的取代間苯二酚具有如 下結(jié)構(gòu)R。 R2選自氯、氟、溴或氫。
5、 如權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征是步驟(l)中得到的取代熒 光素縮合化合物不純化直接進(jìn)行步驟(2)反應(yīng)合成取代新戊酸酯熒光素。
6、 如權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征是步驟(5)中得到的取代二 叔戊?；?6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯不純化而直接進(jìn)行步驟(6) 反應(yīng)合成取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基熒光素。
7、 如權(quán)利要求3中所述的合成方法，其特征是，步驟(5)在三乙胺或吡 啶的弱堿性條件下進(jìn)行。
8、 如權(quán)利要求3中所述的合成方法，其特征是，步驟(5)中，產(chǎn)物取代 二叔戊酰基-6-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯依次使用pH=7的磷酸鈉 鹽緩沖溶液、鹽酸溶液及飽和食鹽水溶液進(jìn)行洗滌。
9、 如權(quán)利要求3中所述的合成方法，其特征是，步驟(6)中，取代6-(羧 基酰胺基)-二叔戊酰基熒光素通過(guò)色譜柱進(jìn)一步純化，色譜柱所用流動(dòng)相溶劑為 三氯甲烷和乙酸乙酯混合溶劑，固定相為53-75pm的柱層析硅膠。
10、 權(quán)利要求l所述黃色熒光染料在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃色熒光染料及其合成方法與用途。該熒光染料具有通式(I)所示結(jié)構(gòu)，其中R₁、R₂選自氯、氟、溴或氫，n為3至7的正整數(shù)。本發(fā)明提供的黃色熒光染料的熒光發(fā)射光譜位于可見(jiàn)光譜的黃色光區(qū)，具有很高的熒光量子產(chǎn)率和很好的熒光標(biāo)記能力，可以用于蛋白標(biāo)記。
文檔編號(hào)C09B57/00GK101451018SQ20071018846
公開(kāi)日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者真 史, 武祥龍, 敏 田, 第五振軍 申請(qǐng)人:西北大學(xué)