專利名稱：用于熒光診斷的親水性硫醇反應性花青染料及其與生物分子的綴合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自花青染料類的新的熒光染料，尤其是在700-900nm的光譜范圍內具有最大吸收和熒光的吲哚三羰菁，該染料具有硫醇特異性反應基，以及三個，優(yōu)選四個磺酸基(sulfonate group)以增加水溶性，本發(fā)明涉及染料的制備。本發(fā)明還涉及這些染料與生物分子的綴合物及其用途。
背景技術：
光在醫(yī)學診斷中的應用近來受到重視(參見，例如BiomedicalPhotonics Handbook(EditorT.Vo-Dinh)，CRC Press)。在用于各種醫(yī)學學科，例如內鏡檢查術、乳房X線照相術、外科學或婦科學的實驗測試中發(fā)現(xiàn)了許多診斷方法?；诠獾姆椒ǖ膬x器靈敏度高，并且使對最少量的生色團和/或熒光團進行分子檢測和成像成為可能(Weissleder等人，(2001)Molecular Imaging，Radiology 219，316-333)。
作為外源性造影劑給予組織，用于熒光診斷和成像的染料，本文中具體是在700-900nm的光譜范圍內(組織的診斷窗口)具有最大吸收和熒光的熒光染料，對于體內使用而言特別令人感興趣。該波長的光子被組織吸收相對少，因此可以在吸收過程(主要被氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白吸收)結束光傳輸之前滲透進組織幾厘米。此外，吸收可以通過引入組織的熒光染料發(fā)生，但該染料以更長波長的熒光輻射形式發(fā)射出所吸收的能量?？梢酝ㄟ^光譜方法單獨檢測該熒光輻射，并使染料定位以及與染料結合的分子的結構聯(lián)系起來成為可能(關于這一點，參見Licha，K.(2002)Contrast Agents for Optical Imaging(Review).InTopics in Current Chemistry-Contrast Agents II(EditorW.Krause)，Volume 222，Springer Heidelberg，pp.1-31)。
為了在患病結構和健康組織之間獲得診斷學上的顯著差異，給予的染料必須在所述組織間引起盡可能高的濃度差異。這可以根據(jù)腫瘤的生理學性質(供血、分配動力學、延誤切除)實現(xiàn)。對于疾病特異性結構的分子標記，可以使用由帶有靶分子親合性生物分子，如蛋白質、肽和抗體的熒光染料組成的綴合物。注射后，這些綴合物的一定部分結合于分子靶結構，如受體或基質蛋白，而未結合的部分從機體排泄。以此方式，在實施熒光診斷中產生更高的濃度差異并由此產生更大的影像對比。
來自花青染料類的熒光染料落入有前景的代表類型中，且以許多不同的結構范圍(structural width)得以合成。具體而言，具有吲哚羰菁、吲哚二羰菁和吲哚三羰菁骨架的羰花青具有高消光系數(shù)和良好的熒光量子產率[Licha，K.(2002)Contrast Agents for Optical Imaging(Review).InTopics in Current Chemistry-Contrast Agents II(EditorW.Krause)，Volume 222，Springer Heidelberg，pp.1-31，以及其中所引用的文獻]。
因此，WO 96/17628記載了通過近紅外輻射進行的體內診斷方法。在該例中，具有特定光物理和藥物化學性質的水溶性染料及其生物分子加合物是用于熒光和透照診斷的造影劑。
具有吲哚羰菁、吲哚二羰菁和吲哚三羰菁骨架的花青染料的合成在現(xiàn)有技術中有充分記載。該方面的相關文獻有，例如BioconjugateChem.4，105-111，1993；Bioconjugate Chem.7，356-62，1996；Bioconjugate Chem.8，751-56，1997；Cytometry 10，11-19，1989和11，418-30，1990；J.Heterocycl.Chem.33，1871-6，1996；J.Org.Chem.60，2391-5，1995；Dyes and Pigments 17，19-27，1991，Dyes andPigments 21，227-34，1993；J.Fluoresc.3，153-155，1993；和Anal.Biochem.217，197-204，1994。另外的方法記載于專利出版物US4,981,977；US 5,688,966；US 5,808,044；WO 97/42976；WO 97/42978；WO 98/22146；WO 98/26077；以及EP 0800831中。
此外，合成了具有改變的取代基的吲哚三羰菁，并將其偶聯(lián)于生物分子(記載于i.a.，Photochem.Photobiol.72，234，2000；BioconjugateChem.12，44，2001；Nature Biotechnol.19，237，2001；J.Biomed.Optics6，122，2001；J.Med.Chem.45，2003，2002)。其它實例具體記載于出版物WO 00/61194(“Short-Chain Peptide Dye Conjugates asContrast Agents for Optical Diagnostics”)、WO 00/71162、WO01/52746、WO 01/52743和WO 01/62156中。
然而，在現(xiàn)有技術中以前使用的已知吲哚三羰菁仍具有損害其有效使用的缺點。
在與生物分子偶聯(lián)后，吲哚三羰菁經(jīng)常具有低的熒光量子產率。對于可商購的染料Cy7，Gruber等人(Bioconjugate Chemn.11，696-704，2000)記載，在與生物分子偶聯(lián)后，發(fā)生了熒光效率的損失。Becker等人(Photochem.Photobiol.72，234，2000)記載，吲哚三羰菁與HAS和轉鐵蛋白的綴合物熒光量子產率為2.9％或2.8％，且在生理介質中吸收光譜變形。
另外，染料綴合物趨于聚集。Becker等人(Photochem.Photobiol.72，234，2000)所述的吲哚三羰菁與HSA和轉鐵蛋白的綴合物以及Licha等人(Bioconjugate Chem.12，44-50，2001)所述的受體結合肽在生理介質中吸收光譜變形。這些變形表明形成聚集體并且作為結果發(fā)生熒光消光。在染料水溶性不足的情況下存在類似的問題。
即使具有反應基，通常也不能有效獲得衍生物。因此，Gruber等人(Bioconjugate Chem.11，696-704，2000)記載了使用具有兩個反應基的Cy7-雙官能團NHS-酯，其可能產生兩個生物分子的交聯(lián)。然而，以分子中的兩個羧基，合成衍生物受僅有一個反應基阻礙，并產生副產物(例如含有未活化的和雙活化的Cy7分子的Cy7部分的單反應性NHS酯)。
因此持續(xù)需要這樣的花青染料，其對熒光診斷而言有效并易于合成，并且減少或沒有上述缺點。此外，這些染料應非常適于制備與生物分子的綴合物。
本發(fā)明的第一個目的通過制備通式(I)的吲哚三羰菁染料和該化合物的鹽和溶劑化物來實現(xiàn)， 其中X為O、S或C，其在兩個位置被取代，其中取代基可以選自甲基、乙基、丙基、異丙基和/或丁基，Y為CH2-CH2或CH2-CH2-CH2，Z為C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代，或者為 R1-R4彼此獨立地為SO3H或H，條件是R1-R4中至少三個為SO3H，R5為-CO-NH-R8-R9、-NH-CS-NH-R8-R9或-NH-CO-R8-R9，其中R8選自無支鏈的C2-C13烷基，其中C原子任選被O或S替換，并且R9選自 或 或氯乙?；?、溴乙酰基、碘乙?；?、氯乙酰胺基、碘乙酰胺基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺，并且其中R6和R7為CH或通過C3-烷基連接于己基環(huán)，其可以任選在對位被C1-C4-烷基取代。
優(yōu)選的是本發(fā)明的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，其中Y為CH2-CH2，Z為C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代，并且其中R6和R7為CH。
更優(yōu)選的是本發(fā)明的吲哚三羰菁染料，其中Z為C1-C5烷基。
更優(yōu)選的是本發(fā)明的吲哚三羰菁染料，其中Z為 并且R6和R7通過C3-烷基連接于己基環(huán)。
因此，本發(fā)明的主題是來自花青染料類的熒光染料，特別是吲哚三羰菁，其在700-900nm的光譜范圍內具有最大吸收和熒光，該染料具有硫醇特異性反應基和三個，優(yōu)選四個磺酸基。后者用于增大水溶性。
現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，具有上述結構(具有磺化乙基的3-4個磺酸基的緊湊位置)的本發(fā)明的吲哚三羰菁具有＞15％的高熒光量子產率，并且與生物分子偶聯(lián)后熒光量子產率幾乎不變(最大損失約10％)。此外，綴合物的吸收光譜在NIR范圍內大約750nm處不顯示染料吸收變形。因此產生了相對于具有少于三個磺酸基的常規(guī)吲哚三羰菁或Cy7衍生物，尤其是Cy7和其它已知結構而言良好的親水性、降低的聚集和提高的熒光量子產率。
制備本發(fā)明的用于熒光診斷的花青染料的另一個重要方面涉及具有反應性官能團使得共價偶聯(lián)于靶特異性生物分子成為可能的那些衍生物。適宜的衍生物為，例如，NHS酯和異硫氰酸酯(BioconjugateChem.4，105-111，1993；Bioconjugate Chem.8，751-56，1997)，其與氨基，例如馬來酰亞胺反應，α-鹵代酮或α-鹵代乙酰胺(Bioconjugate Chem.13，387-391，2002；Bioconjugate Chem.11，161-166，2000)，其與硫醇基反應。其它雙官能團連接劑可以來自亞芳基二異硫氰酸酯、亞烷基二異硫氰酸酯、雙-N-羥基-琥珀酰亞胺基酯、1，6-亞己基二異硫氰酸酯和N-(γ-馬來酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯。
WO 01/77229記載了花青染料，其具有磺芳基、在次甲基鏈中位的烷基取代基和至少一個使得與生物分子的結合成為可能的反應基的組合。然而，實施方案涉及吲哚二羰菁(由5個C原子組成的聚次甲基鏈)，并且該化合物在中位沒有反應基。
WO 00/16810(“Near-Infrared Fluorescent Contrast Agent andFluorescence Imaging”)記載了C7-聚次甲基鏈的中位具有取代基的吲哚三羰菁。然而，其沒有指出如何引入或產生反應基。
本發(fā)明的另一方面涉及吲哚三羰菁染料，其中R5為COOH或NH2。
所公開的衍生物主要基于Cy3-、Cy5-、Cy5.5-以及Cy7-基本結構(可從Amersham Pharmacia Biotech商購；US 5,268,486；Cy3＝吲哚羰菁，Cy5＝吲哚二羰菁，Cy7＝吲哚三羰菁)。硫醇基反應性衍生物特別令人感興趣，因為后者可以與生物技術半胱氨酸直接綴合，該半胱氨酸在生物分子中具有特定的位置?，F(xiàn)有技術主要集中于Cy3和Cy5衍生物。
特別優(yōu)選的本發(fā)明的吲哚三羰菁染料選自式(II)至(XX)的染料，它們列于下表1中
表1優(yōu)選的本發(fā)明的染料





本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的吲哚三羰菁染料的制備方法。在該例中，發(fā)現(xiàn)了通過4-取代吡啶的簡單合成方法。令人驚奇地，可以通過Zincke反應(Zincke-Knig反應，參見Rmpps Chemie Lexikon[Rmpps Chemical Dictionary]，第10版，第5067頁)以高收率將各種4-取代吡啶轉化為(convert in)中位取代的戊烯二醛-二酰苯胺(glutaconaldehyde-dianilide)(花青染料前體)。
除了簡單且有效地合成4-取代吡啶，本發(fā)明的染料的對稱結構開啟了在分子的對稱中位具有硫醇基選擇性反應基的特定衍生化的可能性。
因此進行了對硫醇基反應性化合物的進一步衍生化。硫醇基反應性官能團為，例如，馬來酰亞胺、氯乙?；逡阴；⒌庖阴；?、氯乙酰胺基、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺。
本發(fā)明的再一方面涉及綴合物的制備方法，其包括將本發(fā)明的吲哚三羰菁染料偶聯(lián)于生物分子。在本發(fā)明的范圍內，“生物分子”定義為任何生物來源的分子，其具有生物活性，特別是酶活性或結合合成或生物來源的物質，例如藥物、肽、蛋白質、受體或核酸的活性。依次，優(yōu)選的生物分子為蛋白質，例如酶、肽、抗體和抗體片段(例如單鏈、Fab、F(ab)2、微型雙功能抗體(Diabody)等)、脂蛋白、核酸如來自DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、適體、PNA，以及糖如單糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在許多出版物現(xiàn)有技術中記載了花青染料與生物分子，如肽、抗體及其片段以及蛋白質的用于腫瘤的體內熒光診斷的綴合物的合成和生物特征。在該方面，主要使用上述Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7(關于這一點，參見i.a.Nature Biotechnol.15，1271，1997；Cancer Detect.Prev.22，251，1998；J.Immunol.Meth.231，239，1999；NatureBiotechnol.17，375，1999；Nature Medicine 7，743，2001)。
本發(fā)明的另一方面涉及依照本發(fā)明的方法制備的本發(fā)明的吲哚三羰菁染料與生物分子的綴合物。該綴合物的特征可以在于其包含以上定義的生物分子，其中作為生物分子，更優(yōu)選選自以下的至少一種生物分子肽、蛋白質、脂蛋白、抗體或抗體片段、核酸如DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、適體、PNA，以及糖如單糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。因此，所偶聯(lián)的蛋白質的特征可以在于其選自機體的骨骼蛋白質或可溶性蛋白質。特別優(yōu)選的是血清蛋白(例如HAS)、抗體/抗體片段，例如scFv片段或F(ab)，以及肽、BSA、卵清蛋白或從其得到的過氧化物酶。
因此，從現(xiàn)有技術已知的是，例如針對在血管發(fā)生活躍組織中強烈表達，而在鄰近組織中只有很低水平表達的分子的抗體(參見WO96/01653)。特別令人感興趣的是針對血管生長因子受體、炎癥介體結合的內皮細胞受體和在新血管形成中特異性表達的基質蛋白的抗體。優(yōu)選的是針對基質蛋白EDB-纖連蛋白及從其得到的本發(fā)明的綴合物的其它抗體或抗體片段。EDB-纖連蛋白，也稱為癌胚纖連蛋白，為纖連蛋白的剪接變體，其在新血管形成過程中特異性地在新形成的血管周圍生成。特別優(yōu)選的是針對EDB-纖連蛋白的抗體L19、E8、AP38和AP39(Cancer Res 1999，59，347；J Immunol Meth 1999，231，239；Protem Expr Purif 2001，21，156)。
本發(fā)明的優(yōu)選的綴合物的特征在于吲哚三羰菁染料通過SH基偶聯(lián)于生物分子，尤其是通過SH基偶聯(lián)于半胱氨酸。任選地，更優(yōu)選從其制備的是這樣的抗體及它們的片段，它們通過重組技術制備，使得在C末端或N末端(在外部的1-10個氨基酸內)，它們含有半胱氨酸，該半胱氨酸不形成任何分子內S-S-橋，因此可以用于與本發(fā)明的染料偶聯(lián)。
本發(fā)明的另一方面涉及診斷試劑盒，其包含本發(fā)明的吲哚三羰菁染料和/或本發(fā)明的綴合物。另外，該試劑盒可以含有用于實施體內診斷，尤其是體內腫瘤診斷的附加輔助物。這些輔助物為，例如適宜的緩沖劑、容器、檢測試劑或使用說明書。該試劑盒優(yōu)選含有用于靜脈給予本發(fā)明的染料的所有物質。本發(fā)明的試劑盒的特定實施方案舉例如下第一容器含有具有自由SH基的抗體(生物分子)以及標準緩沖劑/添加劑，其為溶液或凍干物質。另一容器含有本發(fā)明的染料，其為溶液(常規(guī)添加劑)或凍干物質，摩爾比為0.1-1(與等摩爾量相比差10倍)。將含有染料的容器與緩沖劑或蒸餾水任選混合，并加入含有生物分子的容器中，溫育1-10分鐘，直接用作注射溶液。
在另一實施方案中，該試劑盒以兩室體系(例如注射器)存在，其中在一個室中含有抗體溶液，其在含有溶液或固體物質染料的第二室內通過可破裂的壁物理分隔。該壁破裂后，進行注射溶液的混合和制備。
本發(fā)明的最后一方面涉及本發(fā)明的綴合物作為用于體內腫瘤診斷的熒光造影劑的用途。就此而言，Cy7的最大吸收位于745nm，因此特別適宜較深組織層熒光的體內檢測(參見上述)。然而，具有硫醇基選擇性反應基的Cy7衍生物尚未有記載。另外，用于檢測腫瘤邊緣區(qū)域的抗體綴合物的用途在WO 01/23005(Antibody DyeConjugates for Binding to Target Structures of Angiogenesis in Order toIntraoperatively Depict Tumor Peripheries)已有記載，但沒有使用本發(fā)明的有益的染料。
現(xiàn)在根據(jù)以下實施例和附圖對本發(fā)明進行進一步描述，然而本發(fā)明并不限于此。


圖1示出綴合物K11(A)和K15(B)(參見表2)在PBS中的標準化吸收和熒光光譜，并且圖2示出實施例24的本發(fā)明的綴合物的成像性質的結果物質綴合物K15；腫瘤在鼠的右后肋腹的F9畸胎癌；劑量50nmol/kg體重(相對于染料的數(shù)據(jù))；激發(fā)波長740nm(二極管激光)；檢測CCD-照相機(Hamamatsu)，具有802.5±5nm通帶濾波器；時間注射前、注射后1小時、6小時和24小時。腫瘤的位置用箭頭標示。
實施例實施例1-16合成具有馬來酰亞胺基團的吲哚三羰菁染料實施例13，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式II)
a)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸，內鹽將10g(0.04mol)2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(BioconjugateChem 1993，4，105)、6.8g(0.04mol)2-氯乙磺酰氯和4.2g(0.04mol)三乙胺在200ml乙腈中回流6小時。將沉淀抽吸并干燥。收率5.0g(理論值的35％)。Anal Biochem 1994，217，197b)3-吡啶-4-基-丙酸-叔丁酯在0℃下，將在50ml THF中的20g(89mmol)叔丁基-P，P-二甲基膦?；宜狨サ渭尤?.9g(98mmol)氫化鈉(60％，在礦物油中)在250ml THF中的懸浮液中。在0℃下攪拌1小時后，滴加在50ml四氫呋喃中的10g(93mmol)吡啶-4-carbaldehyde，并將反應混合物在0℃下攪拌1小時，在室溫下攪拌18小時。過濾除去沉淀的固體，蒸發(fā)濃縮溶液。加熱下將殘余物溶于異丙醇中，過濾除去不溶的部分，并將溶液冷卻至0℃進行結晶。過濾產生的固體，與己烷一起攪拌，過濾并干燥。在150ml乙醇中用0.15g 10％鈀/活性炭將中間產物(15.3g)氫化6小時。過濾除去催化劑，蒸發(fā)濃縮溶液，通過硅膠(乙醚作為流動溶劑)過濾殘余物，得到13.0g淺黃色油狀物(理論值的71％)。
c)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將10g(48mmol)3-吡啶-4-基-丙酸-叔丁酯在150ml乙醚中的溶液與8.9g(96mmol)苯胺混合，然后在0℃下與5.4g(48mmol)溴化氰在2ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌3小時后，過濾生成的紅色固體，用乙醚洗滌并真空干燥。收率20.3g(理論值的92％)。d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-羧乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將1.0g(2.2mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽(實施例1c)和1.5g(4.4mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a)在20ml乙酸酐和5ml乙酸中的懸浮液與0.75g(9.1mmol)乙酸鈉混合，并在120℃下攪拌1小時。冷卻后，將其與乙醚混合，過濾沉淀的固體并進行色譜純化(RP-C18-硅膠，流動相水/甲醇)，將該產品冷凍干燥(0.5g)。通過將中間產物在4ml二氯甲烷/1ml三氟乙酸中攪拌1小時將保護基裂解。蒸發(fā)濃縮和色譜純化(RP-C18-硅膠，流動相水/甲醇)后，得到0.45g藍色凍干物(理論值的23％)。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將0.4g(0.45mmol)實施例1d)的標題化合物和45mg(0.45mmol)三乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，在0℃下與0.15g(0.45mmol)TBTU混合，并攪拌10分鐘。然后，加入0.17g(0.68mmol)N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽(Int JPept Protein Res 1992，40，445)和68mg(0.68mmol)三乙胺在0.5ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室溫下將其攪拌1小時。加入10ml乙醚后，將固體離心，干燥，并進行色譜純化(RP C-18硅膠，梯度甲醇/水)。收率0.30g藍色凍干物(理論值的65％)。
元素分析計算值C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78測定值C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02實施例23，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲?；鶀乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式III)
合成從0.4g(0.45mmol)實施例1d)的標題化合物與0.21g(0.68mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽(Int J Pept Protein Res1992，40，445)以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.38g藍色凍干物(理論值的81％)。
元素分析計算值C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43測定值C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56實施例33，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式IV) 合成從0.4g(0.45mmol)實施例1d)的標題化合物與0.28g(0.68mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽(Int J Pept Protein Res 1992，40，445)以與實施例1e)相似的方式進行。
收率0.27g藍色凍干物(理論值的51％)。
元素分析計算值C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86測定值C 49.22 H 5.16 N 4.62 S 10.67 Na 5.66實施例43，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式V) a)(3-叔丁氧羰基-丙基)-三苯基-溴化鏻在-40℃下，將50g(0.30mol)4-溴丁酸在400ml THF中與187g(0.89mol)三氟乙酸酐逐滴混合。在-40℃下攪拌30分鐘后，在1小時內滴加400ml叔丁醇/30ml THF。在室溫下攪拌16小時后，將反應混合物傾入冰冷的碳酸鈉溶液中，用乙醚萃取水相三次，用硫酸鈉干燥有機相，蒸發(fā)濃縮。真空蒸餾殘余物(沸點72℃/0.9mbar；收率41g)。通過將41g(0.18mol)中間產物、44.6g(0.17mol)三苯基膦和32.5g(0.36mol)碳酸氫鈉在250ml乙腈中加熱回流20小時來進行形成鏻鹽的反應。過濾反應混合物，蒸發(fā)濃縮，并通過與乙醚一起攪拌使殘余物結晶。收率58.5g白色固體(理論值的40％，相對于4-溴丁酸)。
b)5-吡啶-4-基-戊酸-叔丁酯在-40℃下在無空氣的環(huán)境中，20分鐘內將14g(28mmol)(3-叔丁氧羰基丙基)-三苯基-溴化鏻(實施例4a)在100ml無水THF中的溶液與17.5ml(28mmol)丁基鋰(1.6M，在己烷中)混合，并在-40℃下攪拌1小時。滴加2.78g(26mmol)4-吡啶carbaldehyde在20ml THF中的溶液，并在室溫下攪拌16小時，然后傾入冰水中，用乙醚萃取水相三次，用硫酸鈉干燥有機相，蒸發(fā)濃縮。色譜純化(硅膠，流動相己烷/乙酸乙酯)后，得到的產物為E，Z-混合物(1H-NMR鑒定為4∶1；5.0g)。為了氫化雙鍵，將中間產物溶于200ml甲醇中，并與100mgPtO2催化劑一起在室溫下氫氣中攪拌。過濾并蒸發(fā)濃縮后，得到黃色油狀物。收率4.9g(理論值的74％)。
c)3-[4-(叔丁氧羰基)丁基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將4.0g(17mmol)5-吡啶-4-基-戊酸-叔丁酯在35ml乙醚中的溶液與3.2g(34mmol)苯胺混合，然后在0℃下與1.9g(17mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌3小時后，過濾生成的紅色固體，用乙醚洗滌并真空干燥。收率7.8g(理論值的95％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-羧基丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽合成從實施例4c)的標題化合物(2.5mmol)與1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(5mmol)以與實施例1d)相似的方式進行。收率0.85g藍色凍干物(理論值的37％)。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽合成從0.4g(0.43mmol)實施例4d)的標題化合物以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.31g藍色凍干物(理論值的69％)。
元素分析計算值C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60測定值C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81實施例53，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲?；鶀丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式VI) 合成從0.4g(0.43mmol)實施例4d)的標題化合物與0.20g(0.66mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.35g藍色凍干物(理論值的74％)。
元素分析計算值C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26測定值C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42實施例63，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式VII)
合成從0.4g(0.43mmol)實施例1d)的標題化合物與0.30g(0.72mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.27g藍色凍干物(理論值的52％)。
元素分析計算值C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72測定值C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80實施例73，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式VIII)
a)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻如實施例4a)所述進行制備，其中中間產物6-溴己酸叔丁酯以粗產物進行反應。由50g 6-溴己酸得到79g粘稠無色油狀物產物(理論值的69％)。
b)7-吡啶-4-基-庚酸-叔丁酯如實施例4b)所述進行制備。由25g(48.7mmol)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻(實施例7a)得到7.5g 7-吡啶-4-基-庚酸-叔丁酯黃色油狀物(理論值的65％)。
c)3-[6-(叔丁氧羰基)己基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將5.0g(19mmol)7-吡啶-4-基-庚酸-叔丁酯在30ml乙醚中的溶液與3.6g(38mmol)苯胺混合，然后在0℃下與2.1g(19mmol)溴化氰在5ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌2.5小時后，過濾生成的紅色固體，用乙醚洗滌并真空干燥。收率8.9g(理論值的91％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽合成從實施例7c)的標題化合物(3mmol)與1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(6mmol)以與實施例1d)相似的方式進行。收率1.5g藍色凍干物(理論值的54％)。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽合成從0.4g(0.43mmol)實施例7d)的標題化合物以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.31g藍色凍干物(理論值的69％)。
元素分析計算值C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
測定值C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77實施例83，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式IX) 合成從0.5g(0.53mmol)實施例7d)的標題化合物與0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.42g藍色凍干物(理論值的70％)。
元素分析計算值C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11測定值C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35實施例93，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲?；鶀己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式X)
合成從0.5g(0.53mmol)實施例7d)的標題化合物與0.44g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.24g藍色凍干物(理論值的37％)。
元素分析計算值C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59測定值C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73實施例103，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀-3-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XI)
a)3-氧雜-6-(4-吡啶基)己酸-叔]酯將75g(0.4mol)3-(4-吡啶基)-1-丙醇在400ml甲苯/50ml THF中的溶液與10g四丁基硫酸銨和350ml 32％氫氧化鈉溶液混合。然后，滴加123g(0.68mol)溴乙酸叔丁酯并在室溫下攪拌18小時。分離有機相，用乙醚萃取水相三次。用NaCl溶液洗滌合并的有機相，用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)濃縮。色譜純化(硅膠，流動相己烷/乙酸乙酯)后，得到56g棕色油狀物產物(理論值的41％)。
b)3-[4-氧雜-5-(叔丁氧羰基)戊基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將5.0g(20mmol)3-氧雜-6-(4-吡啶基)己酸-叔丁酯在60ml乙醚中的溶液與3.7g(40mmol)苯胺混合，然后在0℃下與2.2g(20mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌1小時后，混合50ml乙醚，過濾生成的紅色固體，用乙醚洗滌并真空干燥。收率8.5g紫色固體(理論值的85％)。
c)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧雜己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將3.0g(6mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽(實施例10b))和4.2g(12mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))在50ml乙酸酐和10ml乙酸中的懸浮液與2.5g(30mmol)乙酸鈉混合，并在120℃下攪拌50分鐘。冷卻后，將其與乙醚混合，過濾沉淀的固體，在丙酮中吸附性地沉淀，不在高真空下干燥。色譜純化(RP-C18-硅膠，流動相水/甲醇)后，真空除去甲醇，冷凍干燥，立即得到標題化合物。收率2.3g藍色凍干物(理論值的41％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀-3-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽合成從1.0g(1.1mmol)實施例10c)的標題化合物以與實施例1c)相似的方式進行。收率0.85g藍色凍干物(理論值的73％)。
元素分析計算值C 47.54 H 4.46 N 5.28S 12.09 Na 6.50測定值C 47.97 H 4.65 N 5.10S 12.02 Na 6.68實施例113，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲?；鶀-3-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XII) 合成從0.5g(0.55mmol)實施例10c)的標題化合物與0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.42g藍色凍干物(理論值的68％)。
元素分析計算值C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17測定值C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60實施例123，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲?；鶀-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XIII)
合成從0.5g(0.55mmol)實施例10c)的標題化合物與0.46g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.34g藍色凍干物(理論值的56％)。
元素分析計算值C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65測定值C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56實施例133，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀乙基)苯氧基]亞環(huán)己-1-烯-3-基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XIV) a)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-氯-環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將5.0g(14.4mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))和2.6g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺亞甲基)-2-氯-1-環(huán)己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽(Aldrich Company)與2.5g(30mmol)無水乙酸鈉在100ml甲醇中一起回流1小時，冷卻，與150ml乙醚混合，并攪拌過夜。將沉淀抽吸并干燥，進行色譜純化(硅膠，梯度二氯甲烷/甲醇)。收率3.8g藍色固體(理論值的58％)。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將0.37g(2.2mmol)3-(4-羥基苯基)丙酸在30ml二甲基甲酰胺中的溶液與0.18g(4.5mmol)氫化鈉(60％礦物油分散液)混合。在室溫下攪拌30分鐘后，將其冷卻至0℃，滴加2.0g(2.2mmol)實施例12a)的標題化合物在100ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室溫下攪拌2小時。用干冰使混合物驟冷，并真空除去溶劑。將殘余物溶于甲醇中，與200ml乙醚一起攪拌，過濾沉淀的固體。進行色譜純化(硅膠，梯度乙酸乙酯/甲醇)。收率1.9g藍色固體(理論值的83％)c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀乙基)苯氧基]環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽在三乙胺存在下，使0.1mg(0.10mmol)實施例12b)的標題化合物與TBTU和N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽如實施例1e)中所述反應，所得產物用色譜純化。收率93mg藍色凍干物(理論值的81％)。
元素分析計算值C 51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00測定值C 51.50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15
實施例143，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XV) 合成從0.7g(0.68mmol)實施例14a)的標題化合物與0.53g(1.22mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。收率0.56g藍色凍干物(理論值的68％)。
元素分析計算值C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60測定值C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81實施例153，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲?；鶀乙基)苯氧基]環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XVI)
合成從0.7g(0.68mmol)實施例14a)的標題化合物與0.59g(1.36mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽以與實施例1e)相似的方式進行。進行兩次色譜純化。收率0.67g藍色凍干物(理論值的75％)。
元素分析計算值C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27測定值C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68實施例163，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲?；鶀乙基)苯氧基]-5-叔丁基-環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XVII)
a)N-[(3-(苯胺亞甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-環(huán)己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽在0℃下，將6.7ml(73.4mmol)三氯氧化磷滴加入8ml二甲基甲酰胺中。然后滴加5.0g(32.4mmol)4-叔丁基環(huán)己酮在30ml二氯甲烷中的溶液，將反應混合物攪拌回流3小時。冷卻至0℃后，緩慢滴加在5.5ml乙醇中的6g(64.8mmol)苯胺，將混合物傾倒在200g冰上，攪拌下加入5ml濃鹽酸。過濾沉淀的固體，用乙醚洗滌并干燥。收率6.8g紅色固體(理論值的50％)。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-氯-5-叔丁基環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將5.0g(14.4mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))和3.0g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺亞甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-環(huán)己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽(實施例16a))與2.5g(30mmol)無水乙酸鈉一起在100ml甲醇中回流1.5小時，冷卻，與200ml乙醚混合，并攪拌過夜。將沉淀抽吸并干燥，進行色譜純化(硅膠，梯度二氯甲烷/甲醇)。收率4.7g藍色固體(理論值的68％)。
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]-5-叔丁基環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽反應從2.0g(2.1mmol)實施例16b)的標題化合物如實施例13b)中所述進行。收率1.5g(理論值的66％)。
d)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]-5-叔丁基-環(huán)己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽反應從1.0g(0.92mmol)實施例16c)的標題化合物如實施例13c)中所述進行。采用RP C-18硅膠(流動相乙腈/水)進行兩次色譜純化。收率0.24g(理論值的22％)。
元素分析計算值C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72測定值C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15實施例17-19合成具有溴乙酰胺基的吲哚三羰菁染料實施例173，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰胺基)己基]氨基甲酰基}-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XIX) a)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{(6-氨基己基)氨基甲?；鶀-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽合成從0.5g(0.55mmol)實施例10c)的標題化合物與0.15g(0.70mmol)N-boc-己二胺(Fluka)以與實施例1e)相似的方式進行。采用色譜(RP C-18硅膠，梯度甲醇/水)純化反應產物，冷凍干燥后，在用冰冷卻下將其在2ml三氟乙酸/8ml二氯甲烷中攪拌15分鐘。在真空下離心分離(spinning-in)后，將殘余物溶于甲醇中，用乙醚沉淀并分離。收率0.26g藍色固體(理論值的41％)。
b)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰胺基)己基]氨基甲酰基}-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將0.26g(0.23mmol)實施例18a)的標題化合物在5ml二甲基甲酰胺中冷卻至-20℃，與28mg(0.28mmol)三乙胺和0.10g(0.46mmol)溴乙酰溴在0.2ml二甲基甲酰胺中的溶液混合。在最高0℃下攪拌5小時后，加入乙醚沉淀產物，通過從二甲基甲酰胺/乙醚中反復再沉淀，隨后干燥得到產物。收率0.23g藍色固體(理論值的86％)。
元素分析計算值C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96測定值C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na 未測實施例183，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(3-{[3-(溴乙酰胺基)丙基]氨基甲?；鶀乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XVIII) 合成從實施例1d)的標題化合物(0.5g，0.56mmol)和N-boc-丙烯二胺開始，以與實施例17相似的方式進行。所有階段收率0.22g(理論值的37％)。
元素分析計算值C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43測定值C 43.21 H 4.14 N 5.53 S 10.89 Na 未測實施例193，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[3-(溴乙酰胺基)丙基]氨基甲?；鶀乙基)苯氧基]環(huán)己-1-烯3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XX) 合成從實施例13b)的標題化合物(0.5g，0.49mmol)與N-boc-丙烯二胺開始，以與實施例17相似的方式進行。所有階段的收率0.31g(理論值的53％)。
元素分析計算值C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73測定值C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84實施例20-23合成與生物分子的綴合物和該綴合物的光物理特征實施例20用實施例1-16的標題化合物標記BSA(牛血清白蛋白)一般說明在每種情況下，將5mg(0.074μmol)BSA(SigmaCompany)在5ml磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4/NaH2PO4，pH 6.8)中的溶液與0.74μmol實施例1-16的標題化合物(在PBS中0.5mg/ml的儲備液)混合，并在25℃下溫育30分鐘。通過凝膠色譜(柱Sephadex G50，直徑1.5cm，Pharmacia，洗脫劑PBS)對綴合物進行純化。
實施例21用實施例17-19的標題化合物標記BSA一般說明在每種情況下，將5mg(0.074μmol)BSA(SigmaCompany)在5ml磷酸鹽緩沖液(0.1M硼酸緩沖液，pH 8.5)中的溶液與1.10μmol實施例17-19的標題化合物(在PBS中0.5mg/ml的儲備液)混合，并在25℃下溫育5小時。通過凝膠色譜(柱Sephadex G50，直徑1.5cm，Pharmacia，洗脫劑PBS)對綴合物進行純化。
實施例22用實施例1-16的標題化合物標記抗-ED-B-纖連蛋白scFv抗體AP39(單鏈片段)AP39為具有C端半胱氨酸的scFv，并且以共價S-S-二聚體存在，其摩爾質量約為56000g/mol(Curr Opin Drug Discov Devel.2002Mar；5(2)204-13)。通過還原二硫橋，生成具有可接近的SH基的兩種單體(摩爾質量28000g/mol)。
一般說明將0.3ml AP39在PBS中的溶液(濃度0.93mg二聚體/ml)與60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，并在25℃下于氮氣中溫育1小時。通過在NAP-5柱上進行凝膠過濾(洗脫劑PBS)分離過量的TCEP。通過光度測定的得到的AP39-單體(OD280nm＝1.4)的量為230-250μg(體積0.5-0.6ml)。將溶液與0.03μmol實施例1-16的標題化合物(在PBS中0.5mg/ml的儲備液)混合，并在25℃下溫育30分鐘。在NAP-5柱上通過凝膠色譜(洗脫劑PBS/10％丙三醇)對綴合物進行純化。通過親和色譜(ED-B-纖連蛋白樹脂)測定綴合物溶液的免疫反應性(J Immunol Meth 1999，231，239)。所獲得的綴合物的免疫反應性＞80％(綴合前AP39＞95％)。
實施例23用實施例17-19的標題化合物標記抗-ED-B-纖連蛋白scFv抗體AP39(單鏈片段)一般說明將0.3ml AP39在PBS中的溶液(濃度0.93mg二聚體/ml)與60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，在25℃下于氮氣中溫育1小時。通過在NAP-5柱上進行凝膠過濾(洗脫劑50mmol硼酸鹽緩沖液，pH 8.5)分離過量的TCEP。通過光度測定的得到的AP39-單體(OD280nm＝1.4)的量為230-250μg(體積0.5-0.6ml)。將溶液與0.06μmol實施例17-19的標題化合物(在PBS中0.5mg/ml的儲備液)混合，并在25℃下溫育4小時。在NAP-5柱上通過凝膠色譜(洗脫劑PBS/10％丙三醇)對綴合物進行純化。通過親和色譜(ED-B-纖連蛋白樹脂)測定綴合物溶液的免疫反應性(JImmunol Meth 1999，231，239)。所獲得的綴合物的免疫反應性＞75％(綴合前AP39＞95％)。
實施例21和22的染料-BSA-綴合物和實施例23和24的染料-scFv抗體綴合物的光物理特征通過光度法并基于短波吸收肩峰(約690-710nm)的消光系數(shù)75000L mol-1cm-1測定濃度水平(degree of concentration)(染料/抗體摩爾比)；抗體吸收(AP39)用1.4的OD280nm測定；和/或蛋白質吸收(BSA)用0.58的OD277nm測定。熒光量子產率用SPEX fluorolog(通過燈和檢測器校準波長依賴性靈敏度)相對于吲哚花青綠(在DMSO中Q＝0.13，JChem EngData 1977，22，379，Bioconjugate Chem 2001，12，44)測定。
表2本發(fā)明的綴合物的性質



實施例24在向荷瘤裸鼠(hairless mouse)注射本發(fā)明的綴合物后，在體內檢查該綴合物的成像性質。為此目的，將該綴合物靜脈內給予，在0至24小時的時間內觀察其在腫瘤區(qū)域內的濃度。通過用由激光二極管(0.5W輸出)產生的740nm波長的近紅外光對動物進行區(qū)域照射來激發(fā)物質的熒光。通過增強CCD照相機檢測熒光輻射，并對熒光圖像進行數(shù)字存儲?；趯嵤├?，染料綴合物的體內有效性示于圖2。
相信本領域技術人員利用之前的描述，無需付出進一步勞動即可最大范圍地利用本發(fā)明。因此，優(yōu)選的具體實施方案僅是說明性的，它們不以任何方式限制本發(fā)明公開的其余范圍。
在實施例中，除非另有說明，所有溫度均以未校準的攝氏度計，并且所有份和百分比均以重量計。
本文引用的所有申請、專利和出版物的全部公開內容均引入本文作參考。
通過用一般或具體描述的本發(fā)明的反應物和/或操作條件替換在以上實施例中使用的那些，可以重復以上實施例并取得類似的成功。
從以上描述，本領域技術人員可以容易地獲知本發(fā)明的基本特征，在不脫離本發(fā)明的實質和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變化和修改使其適于各種用途和條件。
權利要求
1.通式(I)的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物， 其中X為O、S或C，其在兩個位置被取代，其中取代基可以選自甲基、乙基、丙基、異丙基和/或丁基，Y為CH2-CH2或CH2-CH2-CH2，Z為C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代，或者為 R1-R4彼此獨立地為SO3H或H，條件是R1-R4中至少三個為SO3H，R5為-CO-NH-R8-R9、-NH-CS-NH-R8-R9或-NH-CO-R8-R9，其中R8選自無支鏈的C2-C13烷基，其中C原子任選被O或S替換，并且R9選自 或 或氯乙?；逡阴；⒌庖阴；?、氯乙酰胺基、碘乙酰胺基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺，并且其中R6和R7為CH或通過C3-烷基連接于己基環(huán)，其可以任選在對位被C1-C4-烷基取代。
2.根據(jù)權利要求1的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，其中Y為CH2-CH2，Z為C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代，并且其中R6和R7為CH。
3.根據(jù)權利要求1或2的吲哚三羰菁染料，其中Z為C1-C5烷基。
4.根據(jù)權利要求1或2的吲哚三羰菁染料，其中Z為 并且R6和R7通過C3-烷基連接于己基環(huán)。
5.根據(jù)權利要求1-4之一的吲哚三羰菁染料，其中R5為COOH或NH2。
6.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(II)所示，
7.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(III)所示，
8.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(IV)所示，
9.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(V)所示，
10.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(VI)所示，
11.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(VII)所示，
12.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(VIII)所示，
13.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(IX)所示，
14.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(X)所示，
15.根據(jù)權利要求2的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XI)所示，
16.根據(jù)權利要求2的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XII)所示，
17.根據(jù)權利要求2的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XIII)所示，
18.根據(jù)權利要求4的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XIV)所示，
19.根據(jù)權利要求4的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XV)所示，
20.根據(jù)權利要求4的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XVI)所示，
21.根據(jù)權利要求4的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XVII)所示，
22.根據(jù)權利要求3的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XVIII)所示，
23.根據(jù)權利要求2的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XIX)所示，
24.根據(jù)權利要求4的吲哚三羰菁染料及該化合物的鹽和溶劑化物，該化合物如式(XX)所示，
25.權利要求1-24之一的吲哚三羰菁染料的制備方法，其包括a)制備一種或多種4-取代吡啶，b)通過Zincke-Knig反應將一種或多種4-取代吡啶轉化為中位取代的戊烯二醛-二酰苯胺，其作為花青染料前體，以及c)得到作為花青染料前體的中位取代的戊烯二醛-二酰苯胺。
26.綴合物的制備方法，其包括將權利要求1-24之一的吲哚三羰菁染料與生物分子偶聯(lián)。
27.根據(jù)權利要求26制備的吲哚三羰菁染料與生物分子的綴合物。
28.根據(jù)權利要求27的綴合物，其特征在于，作為生物分子，其包含選自下列生物分子的至少一種生物分子肽、蛋白質、脂蛋白、抗體或抗體片段、核酸如來自DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、適體、PNA和糖如單糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
29.根據(jù)權利要求28的綴合物，其中所述蛋白質選自機體的骨骼蛋白質或可溶性蛋白質。
30.根據(jù)權利要求28或29的綴合物，其中所述可溶性蛋白質為血清蛋白，如HAS、BSA、卵清蛋白、酶如過氧化物酶或抗體、scFv片段或F(ab)。
31.根據(jù)權利要求27-30之一的綴合物，其中所述可溶性蛋白質對ED-B-纖連蛋白具有親和性。
32.根據(jù)權利要求27-31之一的綴合物，其中所述吲哚三羰菁染料通過SH基偶聯(lián)于所述生物分子，特別是通過SH基偶聯(lián)于半胱氨酸。
33.診斷試劑盒，其包含權利要求1-24之一的吲哚三羰菁染料和/或權利要求27-31之一的綴合物，以及用于實現(xiàn)體內診斷，尤其是體內腫瘤診斷的附加的輔助物。
34.根據(jù)權利要求27-31之一的綴合物作為用于體內腫瘤診斷的熒光造影劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自花青染料類的新的熒光染料，尤其是在700－900nm的光譜范圍內具有最大吸收和熒光的吲哚三羰菁，該染料具有硫醇特異性反應基，以及三個，優(yōu)選四個磺酸基以增大水溶性，本發(fā)明涉及染料的制備。本發(fā)明還涉及這些染料與生物分子的綴合物及其用途。
文檔編號C09B23/00GK1742057SQ200380109197
公開日2006年3月1日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權日2003年1月24日
發(fā)明者凱·利查, 克里斯廷·佩利茨 申請人:舍林股份公司