一種硫酸胍乙啶的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種硫酸胍乙啶的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的硫酸胍乙啶的藥物組合物中含有硫酸胍乙啶和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，硫酸胍乙啶和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，具有改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷作用更強(qiáng)，可以開(kāi)發(fā)成改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說(shuō)明】
一種硫酸胍乙啶的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及硫酸胍乙啶的新用途，具體涉及一種硫酸胍乙啶 的藥物組合物及其醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫酸胍乙啶選擇性地作用于交感神經(jīng)節(jié)后去甲腎上腺素能神經(jīng)末梢，促使在神經(jīng) 末梢儲(chǔ)藏的去甲腎上腺素能緩慢地被本品所取代而釋出，神經(jīng)末梢和所在組織中應(yīng)有的去 甲腎上素耗竭缺失。本品還能阻止神經(jīng)刺激使去甲腎上腺素的正常釋放。結(jié)果為血管收縮 作用減弱，尤其在體位改變時(shí)交感神經(jīng)反應(yīng)遲鈍，應(yīng)有的興奮減弱，因而降低血壓。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種硫酸胍乙啶的藥物組合物，該藥物組合物中含有硫酸 胍乙啶和一種天然產(chǎn)物，硫酸胍乙啶和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損 傷。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0006]
[0007] -種硫酸胍乙啶的藥物組合物，包括硫酸胍乙啶、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。
[0009] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將石吊蘭粉碎，用75~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物 用大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70% 洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠 分離，依次用體積比為60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d) 步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、4:1和2:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~15個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得 到化合物(I)。
[0011]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹(shù)脂為D101型大孔吸附樹(shù)脂。
[0013]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 上述硫酸胍乙啶的藥物組合物在制備改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷的藥物中的 應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0017]本發(fā)明提供的硫酸胍乙啶的藥物組合物中含有硫酸胍乙啶和一種結(jié)構(gòu)新穎的天 然產(chǎn)物，硫酸胍乙啶和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，具有改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷作用;二 者聯(lián)合作用時(shí)，改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷作用更強(qiáng)，可以開(kāi)發(fā)成改善白血病肝臟浸潤(rùn) 致肝損傷的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0019] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0020] 試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0021]分離方法：（a)將石吊蘭(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5LX3次），合并提取 液，濃縮至無(wú)醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用D101型大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫10 個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為60:1 (10個(gè)柱體積）、30:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (10個(gè) 柱體積)和5:1(8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用 正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1 (10個(gè)柱體積）、4:1 (8個(gè)柱體積)和2:1 (6個(gè)柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~15個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0022] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431-]\^顯示[]\?^]+為111/2 379.1904，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C22H28〇4，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，DMS〇-d 6，400MHz): H-1 (3 · 06，dd，J = 11.9,8.3)，H-2(2.43，dd，J=18.8，11.9)，H-2(2.28，dd，J=18.8,8.3)，H-6(2.25，dd，J = 11.0,2.2)，H-7(1.89，dd，J=14.2，11.0)，H-7(1.54，dd，J=14.2,2.2)，H-9(2.65，dd，J = 10.4,6.4)，H-ll(1.91，m)，H-ll(1.52，m)，H-12(1.52，m)，H-12(1.83，m)，H-13(2.21，d，J= 7.1)，H-14(5.47，s)，H-15(5.17，s)，H-17(1.64，d，J=1.4)，H-18(1.01，s)，H-19(l.ll，s)， H-20 (5 · 03，s)，H-20 (4 · 86，s)，14-OAc (2 · 03，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ。（ppm，DMS〇-d6， 100MHz):40.1(CH3-C)，40.8(CH2,2-C)，223.4(C，3-C)，56.7(C，4-C)，67.5(C，5-C)，54.8 (CH，6-C)，36.7(CH2,7-C)，51.1(C，8-C)，50.9(CH，9-C)，149.3(C，10-C)，27.2(CH2，n-C)， 23.2(CH2，12-C)，49.4(CH，13-C)，82.1(CH，14-C)，134.6(CH，15-C)，142.7(C，16-C)，14.8 (CH 3，17-C)，22.1(CH3，18-C)，19.1(CH3，19-C)，114.7(CH2,20-C)，173.1(C，14-0Ac)，21.1 (CH 3，14-0Ac)。紅外光譜表明該化合物含有酯羰基（匪R譜顯示三個(gè)甲基[δ H1.64(3H，d，J=1.4Hz，Me-17)，1.01(3H，s，Me-18)和1.11(3!1，8，]\^-19)]，一個(gè)乙?；鵞3 H2.03(3H，s，14-0Ac)]，一個(gè)環(huán)外亞甲基信號(hào)[SH5.03(lH，s，H-20)和 4.86(lH，s，H-20)]，一 個(gè)烯屬次甲基質(zhì)子信號(hào)[陽(yáng)5.17(1!1，8，!1-15)]以及兩個(gè)含氧次甲基質(zhì)子[5!12.25(1!1，(1(1，了 =11.0,2.2他，!1-6)和5.47(1!1，8，!1-14)]。 13(：-匪1?譜顯示了22個(gè)碳信號(hào)，包括七個(gè)季碳(一 個(gè)含氧季碳，兩個(gè)烯屬季碳，一個(gè)酯羰基碳以及一個(gè)酮羰基碳），六個(gè)次甲基(兩個(gè)含氧次甲 基和一個(gè)烯屬碳），五個(gè)亞甲基（一個(gè)烯屬亞甲基），以及四個(gè)甲基(一個(gè)乙酰甲基）AMBC譜 中H 2-2，Me-18和Me-19與酮羰基碳(SC223.4)的相關(guān)性表明酮羰基位于C-3位。兩個(gè)含氧碳 信號(hào)0C67.5和54.8)以及氫質(zhì)子信號(hào)(δΗ2.25)表明該化合物含有一個(gè)5，6_環(huán)氧基團(tuán)。HMBC 譜中，Η-14(δΗ5.47)與乙?；夹盘?hào)（δ(：173.1)的相關(guān)性表明C-14位連有一個(gè)乙酰氧基。此 外，烯屬次甲基質(zhì)子信號(hào)（δΗ5.17)以及兩個(gè)烯烴碳信號(hào)（δα34.6和142.7)表明015和016 之間為雙鍵。Η-9通常在木藜蘆烷型二萜類化合物中為β構(gòu)型。NOESY譜中，缺少Η-1和Η-9的 相關(guān)性表明Η-1為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù) 據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ΕΟ)試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基 本一致。
[0023] 該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0024]
〇
[0025] 實(shí)施例2:藥理作用
[0026]本實(shí)例使用尾靜脈移植Κ562細(xì)胞建立人白血病N0D/SCID小鼠模型，通過(guò)測(cè)定外周 血白細(xì)胞數(shù)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST)活性與總膽紅素 (TBiL)，白蛋白（Alb)升高，抗氧化酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px)、超氧化物歧化酶 (S0D)，谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)，觀察藥物減少肝臟內(nèi)白血病細(xì)胞聚集，降低肝功能損 傷和炎癥因子水平，提高肝組織抗氧化能力等方面的抗移植性人白血病方面的作用。
[0027] 1、材料與方法
[0028] 1.1動(dòng)物
[0029] 雄性N0D/SCID小鼠，8~10周齡，體重18~23g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提 供。
[0030] 1.2試劑與樣品
[0031 ]硫酸胍乙啶購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。 S0D，MDA，GSH，GSH-Px購(gòu)自南京建成生物工程研究所。IL-lβ，IL-6ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博 士德生物工程有限公司。TUNEL試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。
[0032] 1.3儀器
[0033] 550酶標(biāo)儀（BI0RAD)，CM1950冰凍切片機(jī)（Leica)，IX71-A12FL/PH熒光顯微鏡 (Olympus)，HFX_IIA光學(xué)顯微鏡(Nikcon)。
[0034] 1.4小鼠分組及模型制備
[0035] 動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、硫酸胍乙啶組(80mg · kg^1)、化合物（I)組 (80mg · kg-"、硫酸胍乙啶與化合物⑴組合物組【40mg · kg-1硫酸胍乙啶+40mg · kg-1化合 物（I )】。除正常組注射等量生理鹽水外，其余組建立移植性人白血病N0D/SCID小鼠模型：即 給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺每只2mg，qd，2d，第3天從尾靜脈注射移植對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞(2 X 1〇7個(gè)/只），接種K562細(xì)胞30d后模型建立成功。從第31天開(kāi)始按上述劑量分別腹腔注射 硫酸胍乙啶、化合物（I)以及硫酸胍乙啶與化合物（I)組合物治療各組小鼠，共14d，接種 K562細(xì)胞45d處死小鼠取材。
[0036] 1.5外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類和肝功能檢測(cè)
[0037]各組小鼠取尾靜脈血，自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)，血涂片經(jīng)Wright ' s染 色，光鏡下分類計(jì)數(shù)。取小鼠眼球血制備血清，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)ALT，AST，Alb，TBiL等肝功 能指標(biāo)。
[0038] 1.6肝組織抗氧化能力的檢測(cè)
[0039] 各組小鼠分別取0.5g肝組織，制備10%的組織勻漿，留取上清用于后續(xù)檢測(cè)。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組上清液的蛋白濃度，SOD，MDA，GSH，GSH-Px檢測(cè)按照試劑盒說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行。
[0040] 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0041] 運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。
[0042] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0043] 2.1對(duì)移植性人白血病模型小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目的影響
[0044] 接種K562細(xì)胞45d，與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組外周血白細(xì)胞數(shù)顯著增加(P< 0.01)。與模型對(duì)照組比，硫酸胍乙啶與化合物（I)組合物組白細(xì)胞數(shù)顯著減少(p<0.01); 與模型對(duì)照組比較，硫酸胍乙啶組、化合物（I)組白細(xì)胞數(shù)減少(P<〇.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。 [0045] 2.2對(duì)移植性人白血病模型小鼠肝功能指標(biāo)的影響
[0046]與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清檢測(cè)肝功能指標(biāo)ALT，AST，TBiL以及肝指 數(shù)均增加，Alb含量降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，硫酸胍乙啶與化合物（I)組合物組 ALT，AST，TBiL以及肝指數(shù)均顯著減少(P<0.01)，Alb含量顯著升高(P<0.01);與模型對(duì)照 組比較，硫酸胍乙啶組、化合物⑴組ALT，AST，TBiL以及肝指數(shù)減少(P< 0.05)，A1 b含量升 高(Ρ<0·05)〇 [0047] 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0048] 2.3對(duì)移植性人白血病模型小鼠肝組織抗氧化損傷能力的影響
[0049]與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠抗氧化酶S0D含量，GSH和GSH-Px活性均顯著 降低，MDA含量顯著增高(P< 0.05)。與模型對(duì)照組比較，硫酸胍乙啶與化合物（I)組合物組 S0D含量，GSH和GSH-Px活性均顯著升高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01);與模型對(duì) 照組比較，硫酸胍乙啶組、化合物（I)組S0D含量，GSH和GSH-Px活性升高(P<0.05)，MDA含量 降低(Ρ<〇·〇5)。
[0050] 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
[0051] 表1對(duì)移植性人白血病模型小鼠外周血白細(xì)胞、肝功能血清各指標(biāo)以及肝指數(shù)的 影響
[0052]
[0053] 表2對(duì)移植性人白血病模型小鼠肝組織300，1?^，63!1，63!1-?1的影響
[0054]
[0055] 迄今，白血病的治療仍主要采用大劑量聯(lián)合化療，這種方法對(duì)機(jī)體造血系統(tǒng)和免 疫系統(tǒng)破壞最大，對(duì)全身各組織器官損傷也極大，病人最終多死于化療所致全身衰竭。由于 肝臟特殊的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能，抗腫瘤藥物很容易造成肝臟損害，且研究表明，抗白血病 藥物在肝臟內(nèi)潴留時(shí)間較短，且藥物濃度相對(duì)較低，這些因素可能使肝臟成為白血病細(xì)胞 的庇護(hù)所。
[0056] 上述結(jié)果表明，硫酸胍乙啶、化合物（I)、硫酸胍乙啶和化合物（I)組合物治療白血 病模型小鼠是通過(guò)抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高肝組織抗氧化損傷能力，降低炎癥細(xì)胞因 子水平，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，以此改善白血病肝臟浸潤(rùn)所致的肝損傷，可以開(kāi)發(fā)成改善白 血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷的藥物。
[0057] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種硫酸胍乙啶的藥物組合物，其特征在于:包括硫酸胍乙啶、如權(quán)利要求1所述的 化合物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫酸胍乙啶的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載 體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體或潤(rùn)滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫酸胍乙啶的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、 膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射 劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將石 吊蘭粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗 脫10個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、4:1和 2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~15個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹(shù)脂為DlOl型 大孔吸附樹(shù)脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備改善白血病肝臟浸潤(rùn)致肝損傷的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的硫酸胍乙啶的藥物組合物在制備改善白血病肝臟浸潤(rùn)致 肝損傷的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/336GK106008406SQ201610335175
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】黃芳
【申請(qǐng)人】黃芳