一種抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物及其篩選和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物及其篩選和應(yīng)用，屬于生化制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對(duì)FKBP51和FKBP52蛋白進(jìn)行高通量虛擬篩選，并對(duì)所得的化合物在分子、細(xì)胞及動(dòng)物個(gè)體水平上驗(yàn)證其有效性，對(duì)最終遴選出的有開發(fā)前景的先導(dǎo)化合物作用于CRPC的分子機(jī)制進(jìn)行探討，為CRPC的治療提供一種新的更為有效的途徑。
【專利說明】
一種抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物及其篩選和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生化制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合 物及其篩選方法和在制備抗去勢抵抗性前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌在歐美等發(fā)達(dá)國家是男性癌癥死亡的第二大原因，而在中國前列腺癌的 發(fā)生以及死亡率也不斷攀升。雄激素受體(androgen receptor，AR)被認(rèn)為在前列腺癌的發(fā) 生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。因此，雄激素撤除療法(androgen deprivation therapy) 成為治療晚期前列腺癌的最常用和有效的方法。但是在治療的兩到三年內(nèi)，大部分晚期前 列腺癌就會(huì)發(fā)展成去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。對(duì)于CRPC目前缺乏有效治療手段，成為前 列腺癌治療中最為棘手的問題。研究發(fā)現(xiàn)，雖然CRPC顯現(xiàn)出對(duì)雄激素撤除的抵抗性，但它的 進(jìn)展通常仍依賴于AR。據(jù)報(bào)道第二代抗雄激素藥物恩雜魯胺(Enzalutamide)和CYP17抑制 劑阿比特龍都可延長CRPC患者幾個(gè)月的生存期。多項(xiàng)研究表明，AR信號(hào)通路在去勢環(huán)境中 的再激活是CRPC的發(fā)生的主要原因，而局部雄激素的合成以及AR的基因突變、倍增及可變 剪切都是導(dǎo)致AR的再激活因素。目前針對(duì)CRPC的藥物研發(fā)的思路主要是更進(jìn)一步的降低雄 激素的濃度或設(shè)計(jì)出更強(qiáng)效的抗雄激素，但是這些方法都對(duì)AR的基因突變和可變剪切產(chǎn)物 無效。而免疫親和蛋白FKBP51和FKBP52作為協(xié)同分子伴侶(cochaperone)，與Hsp90-起幫 助AR的正確折疊，為AR發(fā)揮功能所必需，通過抑制FKBP51/FKBP52可以達(dá)到降低AR、AR突變 體及可變剪切產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄活性的效果。
[0003] FKBP51與FKBP52蛋白屬于免疫親和蛋白家族，可以結(jié)合免疫抑制分子如FK506和 雷帕霉素(rapamycin)，近年來由于發(fā)現(xiàn)它們?cè)贏R和糖皮質(zhì)激素(GR)的激活中扮演著重要 的角色而備受人們關(guān)注。FKBP51與FKBP52有70%的序列相似性，且都具有順脯氨酸異構(gòu)酶 活性。二者結(jié)構(gòu)非常類似，都包括N端的FK506結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域具有PPIase活性，通 常被稱為FKl結(jié)構(gòu)域。鄰接FKl結(jié)構(gòu)域的是FK2結(jié)構(gòu)域，它與FKl結(jié)構(gòu)域約有19%的序列相似 度，與FKl的折疊類型相似，但是由于缺少關(guān)鍵活性殘基，不具有順脯氨酸異構(gòu)酶活性，也不 能結(jié)合FK506。C端是TRP(tetratricopeptide repeat)結(jié)構(gòu)域，它介導(dǎo)FKBP51、FKBP52與 Hsp90的C端相互作用。雖然FKBP51與FKBP52的結(jié)構(gòu)類似，但是它們?cè)诩?xì)胞中的作用卻是相 互拮抗的。初步的研究表明，決定二者功能差異的主要是FKl結(jié)構(gòu)域，而位于FKl結(jié)構(gòu)域的第 119位氨基酸殘基的差異(在FKBP51中第119位氨基酸為Pro，而在FKBP52中為Leu)可以導(dǎo)致 FKBP51和FKBP52在類固醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮不同的作用。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，F(xiàn)KBP5UFKBP52 對(duì)類固醇受體的調(diào)節(jié)是通過與Hsp90的相互作用進(jìn)行的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種抗去勢抵抗性 前列腺癌先導(dǎo)化合物及其篩選方法和在制備抗去勢抵抗性前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物，具有式(I)的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0007]
[0008] (!)
[0009] 本發(fā)明還提供了所述抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物的篩選方法，包括以下步 驟：
[0010] (1)高通量虛擬篩選
[0011] 利用薛定諤程序包進(jìn)行高通量虛擬篩選，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB分別下載 FKBP51和FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（PDB code: 305R和1N4A)，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化、加電 荷與氫原子，選取其FK506結(jié)合口袋，利用分子對(duì)接程序Glide，從Chemdiv公司所提供的的 150多萬個(gè)化合物中進(jìn)行高通量虛擬篩選，利用QikProp計(jì)算所篩選的小分子先導(dǎo)化合物的 物化性質(zhì)，如脂水分配系數(shù)0?1〇8?〇/￥，按照利賓斯基規(guī)則(1^?；[1181^'81'1116)篩選出對(duì)接得 分最好的前150個(gè)小分子先導(dǎo)化合物，并從Chemdiv公司購買小分子先導(dǎo)化合物；
[0012] (2)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)
[0013] FKBP51/FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域只含有一個(gè)色氨酸且恰好位于FK506結(jié)合口袋，由于 Trp在蛋白質(zhì)中有很強(qiáng)的自發(fā)熒光，而且其發(fā)射光譜的強(qiáng)度與波長受到周圍化學(xué)微環(huán)境的 影響，因此可以通過監(jiān)測Trp發(fā)射光譜的淬滅程度來測量FKl與小分子先導(dǎo)化合物的結(jié)合強(qiáng) 弱，將純化好的FKl蛋白濃度設(shè)定在ΙΟμΜ，小分子先導(dǎo)化合物終濃度100μΜ，反應(yīng)體系IOOyL， 利用Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀以96孔板格式測量小分子先導(dǎo)化合物對(duì) FKl的Trp熒光的淬滅程度，激發(fā)波長設(shè)為295nm，發(fā)射波長設(shè)為335nm，每種小分子先導(dǎo)化合 物平行做三次，以雷帕霉素作為對(duì)照，對(duì)于熒光淬滅程度高于雷帕霉素或與其相當(dāng)?shù)男》?子先導(dǎo)化合物，利用PerkinElmer公司LS55熒光分光光度計(jì)進(jìn)一步測量其解離常數(shù)Kd，F(xiàn)Kl 的濃度設(shè)為1〇μΜ，小分子先導(dǎo)化合物的濃度在0-100μΜ之間設(shè)置梯度，每個(gè)小分子先導(dǎo)化合 物平行做三次，對(duì)所得數(shù)據(jù)利用Pr ism程序進(jìn)行非線性擬合，求得解離常數(shù)Kd;
[0014] (3)蛋白的表達(dá)與純化
[0015] 全基因合成FKBP51/FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域（19-126)并分別克隆到pET28b載體中，用 大腸桿菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)進(jìn)行表達(dá)，用鎳柱純化進(jìn)行粗純化，然后用陰離子 或陽離子交換柱純化，最后用分子篩superdeX75柱純化，同時(shí)構(gòu)建不帶Histag的FKBP51-FKl和FKBP52-FK1，利用它們等電點(diǎn)大于8的性質(zhì)，使用陽離子交換柱SPFF進(jìn)行粗純化，再用 分子篩superdex75柱純化，純化好的蛋白濃縮到40mg/mL后分裝，用液氮速凍后置于-80°C 冰箱保存；
[0016] (4)表面等離子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)
[0017]利用SPR技術(shù)定量測定FKl與小分子化合物之間相互作用的強(qiáng)弱，用氨基偶聯(lián)法將 FKl偶聯(lián)到CM5芯片或利用FKl上的Histag將其偶聯(lián)到NTA芯片上，選取響應(yīng)較好的芯片進(jìn)行 測定，以NaOH或HCl或EDTA為芯片再生條件，選取最優(yōu)的再生條件進(jìn)行循環(huán)測定；
[0018] (5)細(xì)胞及生化實(shí)驗(yàn)
[0019] 利用MTT/MTS實(shí)驗(yàn)（Promega)測定小分子化合物對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3及 DU145的生長抑制作用；對(duì)于能夠較強(qiáng)抑制LNCaP，但對(duì)PC3和DU145基本不抑制的小分子先 導(dǎo)化合物，繼續(xù)以下幾種方法驗(yàn)證其對(duì)AR信號(hào)通路的抑制:①抽提細(xì)胞的總mRNA，用熒光定 量RT-PCR技術(shù)檢測篩選的小分子化合物對(duì)?0?51、？0?52、41?及41?下游調(diào)控基因如？3八、 hK2、TMPRSS2的轉(zhuǎn)錄水平的影響；②用AR及PSA的特異性抗體，通過Western blot技術(shù)檢測 篩選的小分子化合物對(duì)AR及下游基因 PSA在翻譯水平的影響；③用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn) ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP細(xì)胞系，分別用Luciferase酶活報(bào)告系統(tǒng)以及熒光顯微鏡定量 研究篩選的小分子化合物對(duì)AR轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用;④共慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)CRPC剪切子 AR-V7及AR-NTD的DU145細(xì)胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用熒光定量RT-PCR技術(shù)及 Western blot技術(shù)檢測篩選的小分子化合物對(duì)AR活性的抑制；
[0020] (6)蛋白的結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析
[0021]對(duì)FKBP51/FKBP52的FKl蛋白與篩得的小分子先導(dǎo)化合物共結(jié)晶，篩選各種結(jié)晶條 件，獲得高衍射質(zhì)量的晶體，利用同步輻射光源收集X射線晶體衍射數(shù)據(jù)，使用分子置換法 解析FKl與小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)；
[0022] (7)結(jié)構(gòu)分析與分子動(dòng)力學(xué)模擬
[0023] 軟件分析FKl與小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，比較FKBP51與FKBP52在結(jié) 合不同小分子先導(dǎo)化合物時(shí)結(jié)構(gòu)的變化，使用Amber 14的GPU版本進(jìn)行FKl-小分子先導(dǎo)化合 物復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬，用mmpbsa方法計(jì)算小分子先導(dǎo)化合物與FKl結(jié)合的自由能，利 用Ambertools軟件包中的程序分析構(gòu)象變化及蛋白與小分子先導(dǎo)化合物的相互作用模式， Amber 14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970顯卡進(jìn)行計(jì)算，通過以上的結(jié)構(gòu)分析，總結(jié)FKl 與小分子先導(dǎo)化合物的作用規(guī)律，為先導(dǎo)化合物的進(jìn)一步改造提供指導(dǎo)；
[0024] (8)CRPC 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0025] 具體CRPC動(dòng)物模型建立:將5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成兩組，其中一組為實(shí)驗(yàn) 組進(jìn)行去雄，恢復(fù)5天后將LNCaP細(xì)胞（IX IO6個(gè))皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)，實(shí)時(shí)觀察腫瘤大小生長，并且每周2-3次用數(shù)字卡尺稱量小鼠體重和腫瘤 體積(寬 2X長/2)，以平均腫瘤體積作為參考，腫瘤生長8周并且腫瘤大小達(dá)到Icm3即為成功 建立的移植瘤模型;在CRPC動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，再分為不同的給藥組，化療藥物組:多西他 賽，卡巴多賽;抑制雄激素合成藥物組:阿比特龍組;與雄激素競爭性抑制AR活性藥物恩雜 魯胺；以及小分子先導(dǎo)化合物組，每組7只小鼠，連續(xù)28天給藥1，10,或者50 mg/kg的藥物， 并設(shè)空白對(duì)照，通過測量腫瘤大小的變化，稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率，比較動(dòng)物存活天數(shù)，及小 動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)，評(píng)估小分子先導(dǎo)化合物對(duì)CRPC小鼠的腫瘤的影響，觀察結(jié)束后，處 死動(dòng)物，取移植瘤組織，CRPC模型小鼠加藥后與未加藥以及PCa小鼠進(jìn)行AR靶向基因 PSA和 下游相關(guān)基因如TMPRSS2表達(dá)做對(duì)比；藥物作用后仍發(fā)生轉(zhuǎn)移性的CRPC小鼠與未用藥發(fā)生 癌轉(zhuǎn)移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率進(jìn)行比較。
[0026] 本發(fā)明還提供了式I化合物在制備治療去勢抵抗性前列腺癌的藥物中的用途。 [0027] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果：（1)已知的對(duì)于FKBP5UFKBP52的藥物發(fā)現(xiàn)的主要思路是 基于FK506與雷帕霉素的分子改造，但是，基于FK506和雷帕霉素設(shè)計(jì)出的FKBP51/FKBP52的 抑制劑往往與FKBP12的結(jié)合能力更強(qiáng)，因此所得到的化合物可能會(huì)有很強(qiáng)的脫靶效應(yīng)，本 發(fā)明首次以FKBP51和FKBP52蛋白為靶點(diǎn)，高通量虛擬篩選抗前列腺癌的新型先導(dǎo)化合物， 并在分子水平、細(xì)胞水平與動(dòng)物個(gè)體水平驗(yàn)證這些先導(dǎo)化合物的有效性；（2)雖然CRPC顯現(xiàn) 出對(duì)雄激素撤除的抵抗性，但它的進(jìn)展通常仍依賴于AR，F(xiàn)KBP51、FKBP52作為協(xié)同分子伴 侶，為AR激活所必需，通過建立CRPC的細(xì)胞模型與小鼠模型，本發(fā)明首次研究了篩選得到的 先導(dǎo)化合物對(duì)CRPC的作用效果和機(jī)制；（3)通過解析靶蛋白與先導(dǎo)化合物結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)， 分析靶蛋白與先導(dǎo)化合物的結(jié)合模式，總結(jié)結(jié)合規(guī)律，并通過分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，研究先 導(dǎo)化合物對(duì)FKBP51、FKBP52的構(gòu)象的影響，為今后的藥物結(jié)構(gòu)改造提供了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0028] 圖1為FKBP51和FKBP52的結(jié)構(gòu)。（A)FKBP51與FKBP52蛋白的結(jié)構(gòu)域組成；（B)FKBP51 的FKl結(jié)構(gòu)域與FK506的相互作用方式。
[0029]圖2為FKl結(jié)構(gòu)域與小分子化合物的分子對(duì)接。(A) (B)分別是對(duì)接構(gòu)象分別與晶體 結(jié)構(gòu)4DRK、4JFK的疊合情況；（C)虛擬篩選得到的小分子化合物與FKl的結(jié)合模式。
[0030]圖3為FKBP51與小分子化合物的相互作用。(A)用陽離子交換純化獲得的FKBP51的 FKl結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)Kl的分子量約為14KDa; (B)購買的150種小分子化合物對(duì)FKl的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)， 紅色為正對(duì)照雷帕霉素(a)，綠色為不含小分子化合物的buffer(b)。
[0031 ]圖4為小分子先導(dǎo)化合物與FKl的共結(jié)晶體。
[0032]圖5為小分子先導(dǎo)化合物與FKBP51濃度依賴的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)。分別用10,20,50， 80，100μπι小分子先導(dǎo)化合物濃度與20ymFKBP51發(fā)生熒光淬滅反應(yīng)得到結(jié)合曲線圖，其中， compoundl為本發(fā)明的小分子化合物。
[0033]圖6為小分子先導(dǎo)化合物篩選的技術(shù)路線圖。
[0034]圖7為小分子先導(dǎo)化合物對(duì)CRPC的作用及機(jī)理的技術(shù)路線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例與【附圖說明】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下 實(shí)施例。
[0036] 實(shí)施例1
[0037]先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0038]
[0039] 1、具有式(I)化學(xué)結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物的高通量虛擬篩選方法
[0040] 利用薛定諤程序包進(jìn)行，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫I3DB分別下載FKBP51和FKBP52的FKl 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（PDB code:305R和1N4A)，使用Prime，QSite，Liasion and MacroModel 等程序?qū)Y(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化、加電荷與氫原子，選取其FK506結(jié)合口袋，利用分子對(duì)接程序 Gl ide，從Chemdiv公司所提供的的150多萬個(gè)化合物中進(jìn)行高通量虛擬篩選，篩選在4核CPU 的服務(wù)器上進(jìn)行，每天大約可以篩選10萬個(gè)化合物，利用QikProp計(jì)算所篩選的小分子先導(dǎo) 化合物的物化性質(zhì)如脂水分配系數(shù)QPl〇gP〇/w等，按照利賓斯基規(guī)則(Lipinski ' s rule)篩 選出docking-score最好的前150個(gè)小分子先導(dǎo)化合物。利賓斯基規(guī)則包括:①化合物的分 子量小于500Da;②化合物結(jié)構(gòu)中的氫鍵給體(包括羥基、氨基等）的數(shù)量不超過5個(gè);③化合 物中氫鍵受體的數(shù)量不超過10個(gè);④化合物的脂水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值(IogP)在-2到5之間。 符合利賓斯基規(guī)則的化合物有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，在代謝過程中有更好的生物利用 度，易于成為口服藥。小分子先導(dǎo)化合物在Chemdiv公司購買。
[00411 2、熒光淬滅實(shí)驗(yàn)
[0042] FKBP51/FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域只含有一個(gè)色氨酸且恰好位于FK506結(jié)合口袋，由于 Trp在蛋白質(zhì)中有很強(qiáng)的自發(fā)熒光，而且其發(fā)射光譜的強(qiáng)度與波長受到周圍化學(xué)微環(huán)境的 影響，因此可以通過監(jiān)測Trp發(fā)射光譜的淬滅程度來測量FKl與小分子先導(dǎo)化合物的結(jié)合 強(qiáng)弱，將純化好的FK1蛋白濃度設(shè)定在1 ΟμΜ，小分子先導(dǎo)化合物終濃度1 ΟΟμΜ，反應(yīng)體系100μ L，利用Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀以96孔板格式測量小分子先導(dǎo)化合物 對(duì)FKl的Trp熒光的淬滅程度，激發(fā)波長設(shè)為295nm，發(fā)射波長設(shè)為335nm，每種小分子先導(dǎo)化 合物平行做三次，以雷帕霉素作為對(duì)照，對(duì)于熒光淬滅程度高于雷帕霉素或與其相當(dāng)?shù)男?分子先導(dǎo)化合物，利用PerkinElmer公司LS55熒光分光光度計(jì)進(jìn)一步測量其解離常數(shù)KcU FKl的濃度設(shè)為ΙΟμΜ，小分子先導(dǎo)化合物的濃度在0-100μΜ之間設(shè)置梯度，每個(gè)小分子先導(dǎo) 化合物平行做三次，對(duì)所得數(shù)據(jù)利用Prism程序進(jìn)行非線性擬合，求得解離常數(shù)KcL
[0043]
[0044] 3、蛋白的表達(dá)與純化
[0045] 全基因合成FKBP51/FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域（19-126)并分別克隆到pET28b載體中，用 大腸桿菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)進(jìn)行表達(dá)，用鎳柱純化進(jìn)行粗純化，然后用陰離子 或陽離子交換柱純化，最后用分子篩superdeX75柱純化。同時(shí)構(gòu)建不帶Histag的FKBP51-FKl和FKBP52-FK1，利用它們等電點(diǎn)較高（大于8)的性質(zhì)，使用陽離子交換柱SPFF進(jìn)行粗純 化，再用分子篩superdex75柱純化。純化好的蛋白濃縮到40mg/mL后分裝，用液氮速凍后置 于-80°C冰箱保存。
[0046] 4、表面等離子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)
[0047]我們利用SPR技術(shù)更精確的定量FKl與小分子化合物之間相互作用的強(qiáng)弱。用氨基 偶聯(lián)法將FKl偶聯(lián)到CM5芯片或利用FKl上的Histag將其偶聯(lián)到NTA芯片上，最后選取響應(yīng)較 好的芯片進(jìn)行測定，選擇各種不同的芯片再生條件，如Na0H、HCl、EDTA等，最后選取最優(yōu)的 再生條件。
[0048] 5、細(xì)胞及生化實(shí)驗(yàn)
[0049] 利用MTT/MTS實(shí)驗(yàn)（Promega)測定小分子化合物對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3及 DU145的生長抑制作用。對(duì)于能夠較強(qiáng)抑制LNCaP，但對(duì)PC3和DU145基本不抑制的小分子先 導(dǎo)化合物，繼續(xù)以下幾種方法驗(yàn)證其對(duì)AR信號(hào)通路的抑制:①抽提細(xì)胞的總mRNA，用熒光定 量RT-PCR技術(shù)檢測篩選的小分子化合物對(duì)?0?51、？0?52、41?及41?下游調(diào)控基因如？3八、 hK2、TMPRSS2等的轉(zhuǎn)錄水平的影響；②用AR及PSA的特異性抗體，通過Western blot技術(shù)檢 測篩選的小分子化合物對(duì)AR及下游基因 PSA在翻譯水平的影響；③用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn) ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP細(xì)胞系，分別用Luciferase酶活報(bào)告系統(tǒng)以及熒光顯微鏡定量 研究篩選的小分子化合物對(duì)AR轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用;④共慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)CRPC剪切子 AR-V7及AR-NTD的DU145細(xì)胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用熒光定量RT-PCR技術(shù)及 Western blot技術(shù)檢測篩選的小分子化合物對(duì)AR活性的抑制。
[0050] 6、蛋白的結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析
[00511我們對(duì)FKBP51/FKBP52的FKl蛋白嘗試與篩得的小分子先導(dǎo)化合物共結(jié)晶，篩選各 種結(jié)晶條件（如Hampton公司的Screenl&ScreenII，SaltRX，Index，PEGion和MiTeGen公司的 JBScreen Classic等條件），嘗試并改進(jìn)各種沉淀劑、緩沖劑和添加劑，以獲得高衍射質(zhì)量 的晶體。利用同步輻射光源收集X射線晶體衍射數(shù)據(jù)，利用HKL2000，CCP4及Phenix等軟件， 使用分子置換法解析FKl與小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。
[0052] 7、結(jié)構(gòu)分析與分子動(dòng)力學(xué)模擬
[0053 ]使用Pymo I、L i gp 1 〇 t等軟件分析FK1與小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，比較 FKBP51與FKBP52在結(jié)合不同小分子先導(dǎo)化合物時(shí)結(jié)構(gòu)的變化，使用AmberH的GPU版本進(jìn) 行FKl-小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬，用mmpbsa方法計(jì)算小分子先導(dǎo)化合物 與FKl結(jié)合的自由能，利用Ambertools軟件包中的程序分析構(gòu)象變化，蛋白與小分子先導(dǎo)化 合物的相互作用模式等，AmberH的GPU版本（即CUDA版本)使用Nvidia公司的GTX970顯卡進(jìn) 行計(jì)算，經(jīng)過我們的前期測試，發(fā)現(xiàn)其計(jì)算能力相當(dāng)于64核的計(jì)算機(jī)集群。通過以上的結(jié)構(gòu) 分析，總結(jié)FKl與小分子先導(dǎo)化合物的作用規(guī)律，為先導(dǎo)化合物的進(jìn)一步改造提供指導(dǎo)。
[0054] 8、CRPC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0055] 具體CRPC動(dòng)物模型建立:將5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成兩組，其中一組為實(shí)驗(yàn) 組進(jìn)行去雄，恢復(fù)5天后將LNCaP細(xì)胞（IX 106個(gè))皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)，實(shí)時(shí)觀察腫瘤大小生長，并且每周2-3次用數(shù)字卡尺稱量小鼠體重和腫瘤 體積（寬2X長/2)，以平均腫瘤體積作為參考。腫瘤生長8周左右并且腫瘤大小達(dá)到lcm3即 為成功建立的移植瘤模型。在CRPC動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，再分為不同的給藥組?；熕幬锝M： 多西他賽，卡巴多賽;抑制雄激素合成藥物組:阿比特龍組;與雄激素競爭性抑制AR活性藥 物恩雜魯胺；以及小分子先導(dǎo)化合物組，每組7只小鼠，連續(xù)28天給藥1，10,或者50mg/kg的 藥物，并設(shè)空白對(duì)照，通過測量腫瘤大小的變化，稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率，比較動(dòng)物存活天 數(shù)，及小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)，評(píng)估小分子先導(dǎo)化合物對(duì)CRPC小鼠的腫瘤的影響，觀察結(jié) 束后，處死動(dòng)物，取移植瘤組織，CRPC模型小鼠加藥后與未加藥以及PCa小鼠進(jìn)行AR靶向基 因 PSA和下游相關(guān)基因如TMPRSS2表達(dá)做對(duì)比;藥物作用后仍發(fā)生轉(zhuǎn)移性的CRPC小鼠與未用 藥發(fā)生癌轉(zhuǎn)移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率進(jìn)行比較。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物，其特征在于，具有式(I)的化學(xué)結(jié)構(gòu)：2. 如權(quán)利要求1所述抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物的篩選方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 高通量虛擬篩選 利用薛定諤程序包進(jìn)行高通量虛擬篩選，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB分別下載FKBP51和 FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（PDB code:305R和1N4A)，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化、加電荷與氫原 子，選取其FK506結(jié)合口袋，利用分子對(duì)接程序Gl ide，從Chemdi V公司所提供的的150多萬個(gè) 化合物中進(jìn)行高通量虛擬篩選，利用QikProp計(jì)算所篩選的小分子先導(dǎo)化合物的物化性質(zhì)， 如脂水分配系數(shù)QPl〇gP〇/w，按照利賓斯基規(guī)則(Lipinski'srule)篩選出對(duì)接得分最好的 前150個(gè)小分子先導(dǎo)化合物，并從Chemdiv公司購買小分子先導(dǎo)化合物； (2) 熒光淬滅實(shí)驗(yàn) FKBP51/FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域只含有一個(gè)色氨酸且恰好位于FK506結(jié)合口袋，由于Trp在 蛋白質(zhì)中有很強(qiáng)的自發(fā)熒光，而且其發(fā)射光譜的強(qiáng)度與波長受到周圍化學(xué)微環(huán)境的影響， 因此可以通過監(jiān)測Trp發(fā)射光譜的淬滅程度來測量FKl與小分子先導(dǎo)化合物的結(jié)合強(qiáng)弱，將 純化好的FKl蛋白濃度設(shè)定在ΙΟμΜ，小分子先導(dǎo)化合物終濃度100μΜ，反應(yīng)體系IOOyL，利用 Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀以96孔板格式測量小分子先導(dǎo)化合物對(duì)FKl 的Trp熒光的淬滅程度，激發(fā)波長設(shè)為295nm，發(fā)射波長設(shè)為335nm，每種小分子先導(dǎo)化合物 平行做三次，以雷帕霉素作為對(duì)照，對(duì)于熒光淬滅程度高于雷帕霉素或與其相當(dāng)?shù)男》肿?先導(dǎo)化合物，利用PerkinElmer公司LS55熒光分光光度計(jì)進(jìn)一步測量其解離常數(shù)KcUFKl的 濃度設(shè)為1〇μΜ，小分子先導(dǎo)化合物的濃度在0-100μΜ之間設(shè)置梯度，每個(gè)小分子先導(dǎo)化合物 平行做三次，對(duì)所得數(shù)據(jù)利用Prism程序進(jìn)行非線性擬合，求得解離常數(shù)Kd; (3) 蛋白的表達(dá)與純化 全基因合成FKBP51/FKBP52的FKl結(jié)構(gòu)域（19-126)并分別克隆到pET28b載體中，用大腸 桿菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)進(jìn)行表達(dá)，用鎳柱純化進(jìn)行粗純化，然后用陰離子或陽 離子交換柱純化，最后用分子篩superdex75柱純化，同時(shí)構(gòu)建不帶Histag的FKBP51-FK1和 FKBP52-FK1，利用它們等電點(diǎn)大于8的性質(zhì)，使用陽離子交換柱SPFF進(jìn)行粗純化，再用分子 篩superdex75柱純化，純化好的蛋白濃縮到40mg/mL后分裝，用液氮速凍后置于-80°C冰箱 保存； (4) 表面等離子共振(SPR)實(shí)驗(yàn) 利用SPR技術(shù)定量測定FKl與小分子化合物之間相互作用的強(qiáng)弱，用氨基偶聯(lián)法將FKl 偶聯(lián)到CM5芯片或利用FKl上的Histag將其偶聯(lián)到NTA芯片上，選取響應(yīng)較好的芯片進(jìn)行測 定，以NaOH或HCl或EDTA為芯片再生條件，選取最優(yōu)的再生條件進(jìn)行循環(huán)測定； (5) 細(xì)胞及生化實(shí)驗(yàn) 利用MTT/MTS實(shí)驗(yàn)(Promega)測定小分子化合物對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3及DUl 45的 生長抑制作用；對(duì)于能夠較強(qiáng)抑制LNCaP，但對(duì)PC3和DU145基本不抑制的小分子先導(dǎo)化合 物，繼續(xù)以下幾種方法驗(yàn)證其對(duì)AR信號(hào)通路的抑制:①抽提細(xì)胞的總mRNA，用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測篩選的小分子化合物對(duì)?0?51、？0?52、六1?及41?下游調(diào)控基因如？34、111(2、 TMPRSS2的轉(zhuǎn)錄水平的影響；②用AR及PSA的特異性抗體，通過Western blot技術(shù)檢測篩選 的小分子化合物對(duì)AR及下游基因 PSA在翻譯水平的影響;③用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)ARELuc 和ARE-EGFP的LNCaP細(xì)胞系，分別用Luciferase酶活報(bào)告系統(tǒng)以及熒光顯微鏡定量研究篩 選的小分子化合物對(duì)AR轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用;④共慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)CRPC剪切子AR-V7 及AR-NTD的DU145細(xì)胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用熒光定量RT-PCR技術(shù)及Western b I ot技術(shù)檢測篩選的小分子化合物對(duì)AR活性的抑制； (6) 蛋白的結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析 對(duì)FKBP51/FKBP52的FKl蛋白與篩得的小分子先導(dǎo)化合物共結(jié)晶，篩選各種結(jié)晶條件， 獲得高衍射質(zhì)量的晶體，利用同步輻射光源收集X射線晶體衍射數(shù)據(jù)，使用分子置換法解析 FKl與小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)； (7) 結(jié)構(gòu)分析與分子動(dòng)力學(xué)模擬 軟件分析FKl與小分子先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，比較FKBP51與FKBP52在結(jié)合不 同小分子先導(dǎo)化合物時(shí)結(jié)構(gòu)的變化，使用AmberH的GPU版本進(jìn)行FKl-小分子先導(dǎo)化合物復(fù) 合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬，用mmpbsa方法計(jì)算小分子先導(dǎo)化合物與FK1結(jié)合的自由能，利用 Ambertools軟件包中的程序分析構(gòu)象變化及蛋白與小分子先導(dǎo)化合物的相互作用模式， Amber 14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970顯卡進(jìn)行計(jì)算，通過以上的結(jié)構(gòu)分析，總結(jié)FKl 與小分子先導(dǎo)化合物的作用規(guī)律，為先導(dǎo)化合物的進(jìn)一步改造提供指導(dǎo)； (8) CRPC動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 具體CRPC動(dòng)物模型建立:將5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成兩組，其中一組為實(shí)驗(yàn)組進(jìn) 行去雄，恢復(fù)5天后將LNCaP細(xì)胞（IX IO6個(gè))皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠（BALB/ C-nunu)，實(shí)時(shí)觀察腫瘤大小生長，并且每周2-3次用數(shù)字卡尺稱量小鼠體重和腫瘤體積 (寬2X長/2)，以平均腫瘤體積作為參考，腫瘤生長8周并且腫瘤大小達(dá)到Icm 3即為成功建立 的移植瘤模型;在CRPC動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，再分為不同的給藥組，化療藥物組:多西他賽，卡 巴多賽;抑制雄激素合成藥物組:阿比特龍組;與雄激素競爭性抑制AR活性藥物恩雜魯胺； 以及小分子先導(dǎo)化合物組，每組7只小鼠，連續(xù)28天給藥1，10,或者50mg/kg的藥物，并設(shè)空 白對(duì)照，通過測量腫瘤大小的變化，稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率，比較動(dòng)物存活天數(shù)，及小動(dòng)物活 體熒光成像系統(tǒng)，評(píng)估小分子先導(dǎo)化合物對(duì)CRPC小鼠的腫瘤的影響，觀察結(jié)束后，處死動(dòng) 物，取移植瘤組織，CRPC模型小鼠加藥后與未加藥以及PCa小鼠進(jìn)行AR靶向基因 PSA和下游 相關(guān)基因如TMPRSS2表達(dá)做對(duì)比；藥物作用后仍發(fā)生轉(zhuǎn)移性的CRPC小鼠與未用藥發(fā)生癌轉(zhuǎn) 移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率進(jìn)行比較。3.如權(quán)利要求1所述的抗去勢抵抗性前列腺癌先導(dǎo)化合物在制備治療去勢抵抗性前列 腺癌的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK106008289SQ201610300669
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年4月26日
【發(fā)明人】王志平, 何永興, 武丹
【申請(qǐng)人】蘭州大學(xué)