一種酸敏感的兩親性陽離子共聚物及其納米粒與應用
【專利摘要】本發(fā)明是一種酸敏感的兩親性陽離子共聚物及其納米粒與應用。其特征是該聚合物是由A、B/或A、B、C三段組成，其中A段是酸敏感聚合物段，在pH 7及以上環(huán)境下是電中性的疏水聚合物，在pH6.5及以下環(huán)境下質子化而變成親水性；B段是帶有胍基基團的陽離子聚合物；C段是帶有聚乙二醇鏈單元的聚合物或帶有聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯單元的聚合物及其他親水性聚合物。共聚物可作為疏水藥物的納米、微米載體，作為基因、siRNA載體，用于藥物制劑、細胞轉染試劑、檢測試劑和免疫制劑中。
【專利說明】
一種酸敏感的兩親性陽離子共聚物及其納米粒與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種酸敏感的兩親性陽離子共聚物及其納米粒與應用，具體是帶有胍 基陽離子的兩親性陽離子共聚物，其組裝形成納米粒及其作為核酸載體的應用。
【背景技術】
[0002] 帶有親水嵌段(如聚兩性離子聚羧酸甜菜堿(PCB)、聚乙二醇(PEG))和疏水嵌段的 兩親性嵌段共聚物在水中自組裝形成具有疏水內核、親水外殼結構的納米粒，其過程與表 面活性劑膠束化過程類似，但不同于表面活性劑膠束的是兩親性嵌段共聚物的分子量大， 具有極低的臨界膠束濃度(CMC)，且核內疏水嵌段相互纏結并處于動力學凍結狀態(tài)，而水溶 性的PEG或PCB嵌段伸向水中形成的親水保護層具有較大的空間阻力，可以避免粒子間的聚 并。所以兩親性聚合物納米粒在水中可穩(wěn)定存在且稀釋時不易解體。
[0003] 兩親性聚合物自組裝納米粒自20世紀末開始被用于藥物遞送，為新藥的研發(fā)提供 了革命性的手段，引起了人們的廣泛關注。其中，兩親性陽離子聚合物作為兩親性聚合物中 的一類，可以在水中自組裝形成表面帶正電荷的納米粒，這種兩親性陽離子聚合物納米粒 被廣泛應用于核酸負載。研究表明，兩親性陽離子聚合物納米粒可以很大程度上提高基因 對細胞的轉染效率，同時也可以保護基因不被降解。目前，為了提高兩親性陽離子聚合物納 米粒負載的基因藥物對細胞的轉染效率，人們針對細胞特點，如內涵體的酸性環(huán)境、細胞內 氧化還原環(huán)境，設計了許多具有敏感性的基因載體。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有良好生物相容性、在弱酸性條件下可快速質子化 的兩親性陽離子共聚物，其組裝的納米粒作為核酸(包括DNA、siRNA、miRNA等)的載體，可通 過響應內涵體酸性環(huán)境促進siRNA釋放，可在較低劑量下達到細胞水平的高效的基因表達 抑制效率。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術方案加以實現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明涉及一種酸敏感的兩親性陽離子共聚物，其特征是大分子鏈上至少含有A、 B段的聚合物，其中A段是酸敏感聚合物段，在pH3 7的環(huán)境下是電中性的疏水聚合物，在pH 5 6.5的環(huán)境下質子化而變成親水性;B段是帶有胍基基團的陽離子聚合物。
[0007] 上述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，特征是由一種水溶性聚合物C鍵接的含有 A、B段的聚合物;所述的A段的分子量為500~20000，B段的分子量為500~20000，C段的分子 量為800~10000。
[0008] 上述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，特征是C-A-B型嵌段共聚物，其中A段的質 量百分比為10%~80%，B段的質量百分比為10%~70%，C段的質量百分比為4%~40%; 所述的C段優(yōu)選自聚羧酸甜菜堿、聚磷酸甜菜堿、聚乙二醇，或者是靶向分子或穿膜肽修飾 的聚羧酸甜菜堿、聚磷酸甜菜堿、聚乙二醇。
[0009] 上述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，特征是A-B型二嵌段共聚物，其中A段的質 量百分比為10%~80%，B段的質量百分比為20%~90%。
[0010] 所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，其中A段是帶有N，N-二異丙基氨基酯側基 的可聚合單體(Y1)與帶有N，N-二甲氨基酯側基的可聚合單體(Y2)的無規(guī)共聚物，且Y1與Y2 的摩爾比為9~0.5。
[0011] 所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，其特征是A段是甲基丙烯酸-N，N-二異丙基 氨基乙酯與甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯的無規(guī)共聚物，或者是N-(2-(二異丙基）乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺與N-(2-(二甲氨基）乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺的無 規(guī)共聚物，Y1與Y2的摩爾比優(yōu)選為4~0.5;B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚 氨基酸。
[0012] 所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物的納米粒，其特征在于是聚合物在水中自組 裝或與其它組分共組裝形成的50~500nm的納米粒，納米粒中所述的兩親性陽離子共聚物 含量50~100%;納米粒在pH37的環(huán)境下穩(wěn)定，在pH56.5的環(huán)境下納米粒內核pH敏感質子 化，納米粒解體。
[0013]所述的兩親性陽離子共聚物納米粒的應用：與DNA、RNA以及多肽、蛋白類生物大分 子復合形成納米粒，用于DNA、siRNA遞送和轉染試劑、檢測和免疫制劑的應用。
[0014]所述的兩親性陽離子共聚物納米粒的應用，其特征是A-B、C-A-B型嵌段共聚物在 pH>7.2的水介質中自組裝的納米?；騾⑴c組裝的納米粒，再與負電性的DNA、RNA以及多肽、 蛋白類生物大分子復合形成復合納米粒，所述的嵌段共聚物在復合納米粒中的質量含量為 40%~98%。
[0015]所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物納米粒的應用，其特征是所述的A-B、C-A-B 型嵌段共聚物中A段是N，N-取代的甲基丙烯酸氨基酯和甲基丙烯酸N，N-二異丙基氨基酯的 無規(guī)共聚物，或者是N-(2-(二異丙基）乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺與N-(2-(二甲氨 基）乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺的無規(guī)共聚物，Y1與Y2的摩爾比優(yōu)選為4~0.5，B段 指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚氨基酸;所述的納米粒與核酸靜電復合形成的 納米復合物，納米粒與核酸的質量比N/P在1~30,粒徑在50~300nm，用于轉染試劑和核酸 的體內外遞送試劑的應用。
【附圖說明】
[0016]圖1是實施例1大分子引發(fā)劑PY1的分子結構示意圖及核磁共振譜圖，圖中出現(xiàn)了 分子結構中存在的各種氫質子的核磁共振峰，證明了所制備的產物的結構組成PY1為PAMA-BTAm
[0017]圖2是實施例1以PCB為親水段的終產物PY5(DPA-2)的分子結構示意圖及咕核磁共 振譜圖，圖中出現(xiàn)了分子結構中存在的各種氫質子的核磁共振峰，證明了所制備的產物PY5 的結構組成為 PCB10-P(DPA48/DMA12)-PG32〇
[0018] 圖3是實施例1以PCB為親水段的終產物PY5的分子結構示意圖及13C核磁共振譜圖， 圖中出現(xiàn)了分子結構中存在的各種碳原子的核磁共振峰，證明了所制備的產物PY5中胍基 的存在。
[0019] 圖4是實施例1中PCB1()-P(DPA48/DMA12)-PG 32聚合物納米粒為負載siRNA條件下粒徑 隨pH變化的示意圖，納米粒在pH 6.3以下解體。
[0020] 圖5是實施例1中PCB1Q-P(DPA48/DMA12)-PG 32包裹了尼羅紅的聚合物納米粒在不同 pH條件下的熒光值的示意圖。
[0021] 圖6是實施例中PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA復合物的凝膠電泳圖。在N/P大于2.1 時，聚合物對siRNA具有較好的負載能力。
[0022] 圖7是實施例中PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA復合物的細胞毒性的示意圖。載體并未 表現(xiàn)出明顯細胞毒性。
[0023] 圖8是實施例中PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA復合物對特異表達luciferase的HeLa 細胞中l(wèi)ucif erase生長的抑制的示意圖。聚合物對luciferase表達表現(xiàn)出抑制效果，說明 載體遞送siRNA的能力強。
[0024]圖9是實施例21三嵌段共聚物C-A-B-2的分子結構示意圖及咕核磁共振譜圖，圖中 出現(xiàn)了分子結構中存在的各種氫質子的核磁共振峰，證明了所制備的產物的C-A-B-2結構 組成為PCB25-P (DMA24/DPA36) -PG32 〇
[0025]圖10是實施例21的C-A-B-2聚合物納米粒與siRNA復合納米粒的透射電鏡圖。
[0026]圖11是實施例21的聚合物C-A-B-2納米粒在不同pH條件下的粒徑變化的示意圖， 在pH>7.0時，納米粒穩(wěn)定存在，說明聚合物呈疏水性聚集狀態(tài)，隨著pH下降，在pH=6.5時粒 子尺寸降到1 〇納米以下，證明納米粒解體，因此，pH=6.5即為C-A-B-3納米粒開始解聚集的 pHdis 〇
[0027]圖12是實施例23的聚合物C-A-B-4納米粒在不同pH條件下的粒徑變化的示意圖， 在pH在6.4解體。
[0028] 圖13是實施例21~25中PCB-P(DMA/DPA)-PG/siRNA復合物的凝膠電泳圖。在N/P質 量比大于4.5時，聚合物對siRNA具有較好的負載能力。
[0029] 圖14是實施例21~24中PCB-P(DMA/DPA)-PG/siRNA復合物對Hep-G2細胞中 luciferase生長的抑制示意圖。在本權利要求范圍內復合物對luciferase表達表現(xiàn)出較好 抑制效果(超過50%)，說明載體較強的siRNA的胞內遞送能力。
[0030] 圖15是P(DPA/DMA)-PGA二嵌段共聚物A-B-2的1H核磁共振譜圖，圖中出現(xiàn)了分子 結構中存在的各種碳原子的核磁共振峰，證明了所制備的產物。
【具體實施方式】
[0031]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0032]實施例中，酸敏感共聚物A采用甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯(DMA)或甲基丙烯 酸氨基乙酯(AMA)與甲基丙烯酸-N，N-二異丙基氨基乙酯(DPA)進行無規(guī)共聚制備，以聚甲 基丙烯酸胍基乙酯(PG)為B段，采用以聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(PCB)或聚乙二醇(PEG) 為C段，制備C-A-B三嵌段共聚物PCB-P(DPA/DMA)-PG和A-B型二嵌段共聚物P(DPA/DMA)-PG。 [0033] 或者采用N-(2-(二甲氨基）乙基）-2,5-二氧代惡唑烷-4-甲酰胺(DMAE)與N-(2- (二異丙基）乙基）_2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺(DPAE)無規(guī)共聚制備酸敏感性的A段，聚羧 酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(PCB)或聚乙二醇(PEG)為C段，以胍基化聚氨基酸為B段。
[0034]本發(fā)明是以CTAm或PEG-CTAm大分子為引發(fā)劑，采用可控自由基聚合制備而成?；?采用氨基酸聚合而成。本發(fā)明可用于制備疏水性藥物、基因、RNA、多肽、蛋白類藥物的納、微 米粒，亦可用于藥物制劑、基因遞送、細胞轉染、檢測和免疫制劑。
[0035] 實施例1
[0036] (1)以羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMA)單體為例，制備 可在弱酸條件下快速響應的胍基化三嵌段共聚物：
[0037] ①在100mL干燥Schlenk瓶中加入20mL無水乙腈，氮氣保護下加入DMA(5.0g， 32mmo 1)，溴乙酸叔丁酯（8.7g，44.5mmo 1)，室溫下反應30min后，移入50 °C恒溫油浴中繼續(xù) 反應24h。反應體系降至室溫后，滴入250mL無水乙醚中析出白色固體，抽濾后用1 OOmL無水 乙醚洗滌3次，真空干燥24h，制得甲基丙烯酸（羧酸甜菜堿）乙酯（CBUBu))。1!!匪R (5001抱，〇2〇)化學位移8(口口111):1.44(8,911，-〇(：(013)3)，1.87(8,311，012 = (：(013)0)〇-)，3.31 (s，6H，-CH2N(CH3) 2CH2-)，3 ? 98 (t，2H，-⑶OCH2CH2N(CH3) 2CH2-)，4 ? 28 (s，2H，-CH2N(CH3) 2CH2⑶0-)，4.60(t，2H，-C00CH2CH2N(CH3)2-)，5.73,6.10(8,211，〇12 = (：(〇13)-)證明了〇8 (tBu)單體結構。
[0038] ②向Schlenk管中加入鏈轉移劑s-1-十二烷基-s-(a，a-二甲基-a-乙酸)三硫代碳 酸酯（CTAm) (54? 75mg，0? 15mmol)，AMA( 1 ? 718g，7 ? 5mmol)，AIBN(4? 92mg，0? 03mmol)和3ml二 甲基甲酰胺(DMF)，70°C下反應24h。反應結束，得到PAMA3Q-CTAm(PYl)，其核磁圖如1;
[0039] ③向Schlenk管中加入DMA(0.188g，l .2mmol)，DPA(1.022g，4.8mmolWPAIBN (4 ? 92mg，0 ? 03mmo 1)，70 °C 下反應24h。反應結束，得到PY2;
[0040] ④向 Schlenk 管中加入 CB(tBu)(0.408g，1.5mmol)，AIBN(4.92mg，0.03mmol)，7(TC 下反應24h。反應結束后，用透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析1天，凍干得到PY3;
[0041]⑤向反應管中加入2.5g PY3和5ml三氟乙酸，反應4個小時，旋蒸除去三氟乙酸，用 透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析1天，冷凍干燥，得到PY4;
[0042] ⑥向反應管中加入2g PY4、1.15g 1-H-吡唑甲脒鹽酸鹽和20ml 0.1M碳酸氫鈉溶 液，反應24h，用透析袋(Mw:8000-14000)在純水中透析3天，冷凍干燥，得到終產物PY5。 [0043]將20mg共聚物溶于含有氘代磷酸的0.6ml重水中，用400MHz的核磁共振儀表征，其 核磁圖如圖2和圖3，結構為PCB 15-P (DPA48/DMA12) -PG32，記為共聚物DPA-2，見表1。性能見表 3〇
[0044] 實施例2~6
[0045] 裝置與操作同實施例1，只是改變DMA、DPA、AMA和CB(tBu)的投料比，按表1所示的 比例投料，制備出表1所示其它三嵌段共聚物。
[0046] 實施例7:
[0047]裝置與操作同實施例1，只是將其中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯換成甲基丙烯酸二 乙氨基乙酯(DEA)，所制備的共聚物PCB25-P(DPA48/DEA12)-PG 32記為DPA-11。
[0048] 表1 DMA、DPA、AMA和CB(tBu)投料配比表及共聚物大分子結構
[0049]
[0050] Ma : A段分子量;Mb : B段分子量;Me: C段分子量。
[0051 ] 實施例8
[0052] (1)以mPEG、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMA)單體為例，制備可在弱酸條件下快速 響應的胍基化三嵌段共聚物：
[0053] 向反應器中加入mPEG( lg、0 ? 2mmol)、CTAm(87 ? 6mg，0 ? 24mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺 (00：)(61.811^，0.3臟〇1)和4-二甲氨基吡啶(0嫩？）（2.4411^，0.02臟〇1)，常溫下反應2411。反 應結束，沉淀干燥得到PEG-CTAm(PEl);
[0054] 向Schlenk 管中加入 PEl(0.805g，0.15mmol)，DPA(0.70g，3.6mmol)，DMA(0.846g， 5 ? 4mmo 1)，AIBN( 4 ? 92mg，0 ? 03mmo 1)和3mL DMF，70 °C 下反應24h。反應結束，得到PE2;
[0055] 向Schlenk管中AMA(0.76g，4.5mmol)，AIBN(4.92mg,0.03mmol)，7(TC下反應24h。 反應結束后，用截留分子量為3500的透析袋在純水中透析1天，凍干得到PE3;
[0056]向反應管中加入2.5g PE3和5ml三氟乙酸，反應4個小時，旋蒸除去三氟乙酸，用透 析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析1天，冷凍干燥，得到PE4;
[0057] 向反應管中加入2g PE4、1.15gl-H-吡唑甲脒鹽酸鹽和20ml 0.1M碳酸氫鈉溶液， 反應24h，用透析袋(Mw:8000-14000)在純水中透析3天，冷凍干燥，得到終產物PEG5QQ0-P (DPA24/DMA36);記為DPA-0-1。結構性能見表2和表3。
[0058] 實施例9~13
[0059]裝置與操作同實施例8,只是改變了DMA、DPA和AMA三者的投料比，按表2所示的比 例投料，制備出表2所示其它三嵌段共聚物。
[0060] 實施例14
[0061] 裝置與操作同實施例8,只是將其中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯換成甲基丙烯酸二 乙氨基乙酯(DEA)，得到的共聚物記為DPA-11-7,如表2。
[0062] 表2 DMA、DPA和AMA三者的投料配比表
[0063]
[0064] Ma : A段分子量;Mb : B段分子量;Me: C段分子量。
[0065] 實施例15
[0066] 準確稱取10mg的DPA-2嵌段共聚物溶于lmL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液緩慢滴 加到10mL攪拌下的pH 7.4的roS中，室溫攪拌3h后，離心分離，清液為DPA-2自組裝納米粒分 散液;將分散液冷凍干燥，可得納米粒凍干粉。取上述含9yg DPA-2納米粒的pH 7.4的PBS緩 沖液溶液，稀釋至10mL，加入2yg的熒光素酶siRNA，形成DPA-2/siRNA的復合物納米粒水分 散液;用稀鹽酸調節(jié)納米粒分散液的pH為8.0、7.8、7.6、7.4、7.2、7.0、6.8、6.5等，室溫放置 2h后，激光粒度儀測定納米粒解體時的pH值，定為pHdis，見圖4及表3。
[0067] 實施例16
[0068] 將DPA-2和尼羅紅溶于三氟乙醇中，把溶液緩慢滴加到10mL攪拌PBS或生理鹽水 中，室溫攪拌3h后，離心分離，清液為自組裝納米粒分散液。用稀鹽酸調節(jié)納米粒分散液的 pH為8.0、7.8、7.4、7.2、7.0、6.8、6.5等，室溫放置211。熒光測試，見圖5。
[0069] 實施例17
[0070] 將20yL PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA復合物溶液(N/P為1-8)與4yL上樣緩沖液充分 混合后加入到1%瓊脂糖（含〇.5iig/mL溴化乙錠）凝膠中。電泳緩沖液為1XTAE，電壓為 120V，電泳時間為40min，然后在紫外下觀察s iRNA電泳圖譜并照相，見圖6及表3。
[0071] 實施例18
[0072] MTT法對復合物的細胞毒性進行了檢測，具體方法如下:在96孔板中接種1 X 104個 HeLa細胞/孔;加入50yL含0? 2yg NC-siRNA的PCB-P(DPA-B〇-DMA)-PG/siRNA的復合物溶液， 同時設置調零孔(培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），對照孔(細胞、相同體積的復合物溶解介質、培 養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），37°C孵育48h。每孔加入20yL MIT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)5 %C〇2，37°C 孵育4h。小心棄去孔內上清培養(yǎng)液，每孔加入150yL二甲基亞砜，置低速震蕩儀上振蕩 lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀540nm處測量各孔的吸光值。計算各個樣品孔 細胞相對活力。將各孔吸光值減去調零孔吸光值，得到修正后吸光值0D54CT。計算對照孔修 正后吸光值的平均值)，見圖7及表3。
[0073] 實施例19
[0074] 以抑制熒光素酶表達siRNA作為報告基因，在穩(wěn)定表達熒光素酶的Hela細胞系中 測定載體的轉染效率。在24孔板細胞培養(yǎng)板中每孔加入5*10 4的Hep-G2細胞，培養(yǎng)一段時間 后向每個孔中加入含50nM siRNA的siRNA/polycations復合物，轉染24小時后，棄去孔內液 體，冷PBS輕洗2遍，每孔加入200yL 1 X報告基因裂解緩沖液，凍融1次，將裂解細胞完全。吹 打完全后，吸出細胞裂解液到新的EP管，12000rpm離心30s，將上清液吸出。向10yL上清液中 加入50yL底物后，由熒光計(Synergy HT，BioTek，USA)測定相對發(fā)光單位，見圖8及表3。
[0075]按上述納米粒制備方法及性能評價方法得到的表1和表2中各共聚物納米粒的結 構性能見表3。
[0076]表3.實施例1-14所制備的C-A-B共聚物納米粒的結構性能
[0078] a粒徑是未負載siRNA納米粒;b粒徑是負載siRNA納米粒;N/P為共聚物納米粒與 siRNA的質量比
[0079] 實施例20
[0080] Schlenk管中，加入0 ? 02mol鏈轉移劑CTAm的DMF溶液10mL，加入0 ? 7mol甲基丙烯酸 氨基乙酯(AMA)，然后抽真空通氮氣，反復三次。然后在70°C條件下反應24小時，透析凍干得 到聚陽離子大分子引發(fā)劑PAMA- CTAm。0.0 lmo 1聚陽離子鏈轉移劑PAMA- CTAm的DMF溶液，加 入0.24mol DPA和0.36mol DMA，抽真空通入氮氣后加入0.002mol AIBN，然后繼續(xù)抽真空通 氮氣，反復三次。然后在70°C條件下反應24小時，透析凍干得到產物，記為A-B-1。
[0081]把A-B-l O.Olmol，加入Schlenk管中，再加入CB(0.25mol)，AIBN(0.002mol)，7(TC 下反應24h。反應結束后，用透析袋(Mw:8000-14000)在純水中透析1天，凍干得到PY3;向反 應管中加入2.5g PY3和5ml三氟乙酸，反應4個小時，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析1天，冷凍干燥，得到(：^-1。
[0082] 準確稱取10mg的C-A-B-1嵌段共聚物溶于lmL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液緩慢 滴加到10mL攪拌下的pH 7.4的PBS中，室溫攪拌3h后，離心分離，清液為C-A-B-1自組裝納米 粒分散液;取上述含9yg C-A-B-1納米粒的pH 7.4的ros緩沖液溶液，稀釋至10mL，加入2yg 的熒光素酶s iRNA，形成A- B -1 /s iRNA的復合物納米粒水分散液。
[0083] C-A-B-UC-A-B-1納米粒及C-A-B-1/siRNA納米粒的結構性能見表4和表5。
[0084] 實施例21
[0085] 向反應管中加入2g C-A-B-l，1.15g 1-H-吡唑甲脒鹽酸鹽和20ml 0.1M碳酸氫鈉 溶液，反應24h，用透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析3天，冷凍干燥，得到陽離子段胍基 化修飾的C-A-B型嵌段共聚物PG-b-P(DPA/DMA)-PCB，記做C-A-B-2;同實施例20方法，改變 配比，制備出C-A-B-2納米粒及C-A-B-2/siRNA納米粒。結構性能見表4和表5。
[0086] 實施例22~24
[0087] 按實施例21方法，只是改變DMA、DPA、AMA和CB(tBu)的投料比，即可制備出表4所示 其它三嵌段共聚物。同樣制備出表4和表5中其它三嵌段共聚物及其自組裝納米粒和負載 s iRNA的納米粒。
[0088] 實施例25
[0089] 0 ? 02mol大分子鏈轉移劑PEG5000-CTAm的DMF溶液，加入0 ? 48mol DPA和 0.72molDMA，抽真空通入氮氣后加入0.002mol AIBN，然后繼續(xù)抽真空通氮氣，反復三次。然 后在70 °C條件下反應24小時，透析凍干得到產物PY6。取0 ? 0 lmo 1的PY6，加入0 ? 35mol甲基丙 烯酸氨基乙酯(AMA)，然后抽真空通氮氣，反復三次。然后在70°C條件下反應24小時，透析凍 干得到PAMA-P(DPA/DMA)-PEG三嵌段聚合物C-A-B-6。同實施例20方法制備出C-A-B-6納米 粒及C-A-B-6/siRNA納米粒。結構性能見表4和表5。
[0090] 表4.實施例20-35所制備的C-A-B三嵌段酸敏感的兩親性陽離子共聚物的結構組 成
[0091]
[0092] R8為精氨酸八聚體 [0093] 實施例26
[0094] 向反應管中加入2g C-A-B-6，1.15g 1-H-吡唑甲脒鹽酸鹽和20ml 0.1M碳酸氫鈉 溶液，反應24h，用透析袋(Mw:8000-14000)在純水中透析3天，冷凍干燥，得到C-A-B型嵌段 共聚物PG-b-P(DPA/DMA)-PEG，記做C-A-B-7。同實施例20方法制備出C-A-B-7納米粒及C-A-B- 7/s iRNA納米粒。結構性能見表4和表5。
[0095]實施例27-33
[0096] 按實施例26方法，只是改變DMA、DPA、AMA和CB(tBu)的投料比，以及采用不同靶向 基團修飾的PEG，即可制備出表4所示其它B段為PEG的三嵌段共聚物，并同實施例20方法制 備出C-A-B-2納米粒及C-A-B-2/siRNA納米粒。結構性能見表4和表5。
[0097]表5.實施例20-35所制備的C-A-B共聚物納米粒的結構性能
[0099] a粒徑是未負載siRNA納米粒;b粒徑是負載siRNA納米粒^Hep-G〗細胞系
[0100] 實施例34
[0101]靶向基團R⑶修飾的共聚物的制備：
[0102] 加入Schlenk管中，加入O.Olmol鏈轉移劑CTAm的DMF溶液10mL，加入CB(tBu) (0 ? 25mol)，AIBN(0 ? 002mo 1)，抽真空通氮氣，反復三次，然后70°C下反應24h，制備出端羧基 的卩08(丨811)-(^^111。反應結束后，降至室溫終止反應。在氮氣保護下，加入0.24111〇10?八和 0.36mol DMA，抽真空通入氮氣后加入0.002mol AIBN，然后繼續(xù)抽真空通氮氣，反復三次 后，在70°C條件下反應24小時，得到端羧基聚合物。降至室溫終止反應，在氮氣保護下，加入 0.35mol甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)，抽真空通氮氣，反復三次，然后70°C下反應24h。反應結 束后，再用透析袋(Mw:8000-14000)在純水中透析1天，凍干得到產物PY7。
[0103] 將PY7 (0.0 lmmo 1)溶解在3mL無水二甲基亞砜(DMS0)中，加入1-乙基- (3 -二甲基氨 基丙基）（EDC ? HCl)(9.5mg，0.05mmol)和N-羥基琥泊酰亞胺(NHS)(11.5mg，0. lOmmol)活化 PY7的端羧基，室溫下反應3h后，用巰基乙醇淬滅過量的EDC ? HC1。隨后加入短肽RGD (3.5mg，0.OlmM)，室溫下繼續(xù)反應24h后用去離子水透析2天，凍干后得到RGD-PY7。
[0104] 向反應管中加入2.5g RGD-PY7和5ml三氟乙酸，反應4個小時，水解掉PCB(tBu)的 叔丁酯，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析1天，冷凍干燥，得到 RGD-PY8〇
[0105] 向反應管中加入2g R⑶-PY8，1.15g 1-H-吡唑甲脒鹽酸鹽和20ml 0.1M碳酸氫鈉 溶液，進行胍基化反應24h，用透析袋(Mw: 8000 -14000)在純水中透析3天，冷凍干燥，得到陽 離子段胍基化修飾的C-A-B型嵌段共聚物RGD-PCB25-P(DPA 24/DMA36)-PG32,記為C-A-B-15。見 表4。
[0106] 準確稱取l〇mg的C-A-B-15嵌段共聚物溶于lmL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液緩 慢滴加到10mL攪拌下的pH 7.4的PBS中，室溫攪拌3h后，離心分離，清液為C-A-B-15自組裝 納米粒分散液;取上述含9yg C-A-B-15納米粒的pH 7.4的ros緩沖液溶液，稀釋至10mL，加 入2yg的熒光素酶siRNA，形成C-A-B-15/siRNA的復合物納米粒水分散液。納米粒的結構性 能見表5。
[0107] 實施例35
[0108]同實施例34方法，只是把RGD換成穿膜肽精氨酸八聚體(R8)，得到的共聚物為C-A-B-16,結構性能見表4和表5。
[0109] 實施例36
[0110] 〇. 〇2mol鏈轉移劑CTAm的DMF溶液，加入0.7mol甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)，然后抽 真空通氮氣，反復三次。然后在70°C條件下反應24小時，透析凍干得到聚陽離子大分子引發(fā) 齊盱厶1^-口厶111。0.01111〇1聚陽離子鏈轉移劑？厶1^-(^厶111的01^溶液，加入0.24111〇10?八和 0.36mol DMA，抽真空通入氮氣后加入0.002mol AIBN，然后繼續(xù)抽真空通氮氣，反復三次。 然后在70°C條件下反應24小時，透析凍干得到兩親性二嵌段聚合物P(DPA/DMA)-PAMA，記為 A_B_ 1 〇
[0111] 準確稱取8mg的A-B-1，溶于lmL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液緩慢滴加到10mL攪 拌下的pH 7.4的PBS中，室溫攪拌3h后，離心分離，清液為A-B-1自組裝納米粒分散液;取上 述含8yg A-B-1納米粒的pH 7.4的roS緩沖液溶液稀釋至10mL，加入2yg的熒光素酶siRNA， 形成A- B -1 /s iRNA的復合物納米粒水分散液。
[0112] A-B-UA-B-1納米粒及A-B-1/siRNA納米粒的結構性能見表6。
[0113] 實施例37
[0114] 實施例36制備的A-B-l 0.5mol，向反應管中加入lmol 1-H-吡唑甲脒鹽酸鹽和 20ml 0.1M碳酸氫鈉溶液，反應24h，用透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析3天，冷凍干 燥，得到終產物A1嵌段的胍基化聚陽離子二嵌段共聚物A-B-2,核磁譜圖見圖15。同樣可以 制備納米粒和負載s i RNA的納米粒，如表6。
[0115] 實施例38~41
[0116] 同實施例20、21的方法，改變DPA、DMA、AMA的用量，或用甲基丙烯酸N，N-二乙氨基 乙酯(DEA)替代DMA，即可制備出不同組成的A-B型酸敏感的兩親性陽離子共聚物，同樣可以 制備納米粒和負載s i RNA的納米粒，如表6。
[0117] 表6.實施例36~41所制備的A-B二嵌段酸敏感的兩親性陽離子共聚物的結構組成
[0118]
[0119] Mb : B段分子量;a粒徑是未負載siRNA納米粒;b粒徑是負載siRNA納米粒
[0120] 本發(fā)明中的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，可以通過氨基酸類單體的縮聚制備聚 氨基酸類型的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，并通過組裝納米粒，制備方法示例如下：
[0121] 實施例42
[0122] 聚氨基酸類A-B型酸敏感的兩親性陽離子共聚物A-B-7的制備：
[0123] 取O.Olmol氨基乙醇溶于10ml乙酸乙酯中，加入0.35mol異丁基（2-(2,5_二氧代惡 唑烷-4 -甲酰胺）乙基）氨基甲酸酯（AMAE)，反應24小時后，加入0 ? 24mol DMAE與0 ? 36mol DPAE，在 110 °C 條件下反應24h，制備出 PAMAE - P (DMAE/DPAE)，記為A - B - 7。
[0124] 采用實施例36方法，制備A-B-7及與siRNA的復合納米粒。結構性能見表7和表8。
[0125] 實施例43
[0126] 按實施例21方法對A-B-7的氨基進行胍基化，則得到PGAE-P(DMAE/DPAE)，記為A-B-8〇
[0127] 采用實施例36方法，制A-B-8及與siRNA的復合納米粒。結構性能見表7和表8。
[0128] 實施例44~45
[0129] 按實施例42方法，改變DMAE與DPAE的比例，以及不同的C段單體，即可得到不同側 鏈氨基摩爾比的A - B型酸敏感的兩親性陽離子共聚物。同樣方法制備自組裝納米粒及與 siRNA的復合納米粒。結構性能見表7和表8。
[0130] 實施例46
[0131] 聚氨基酸類C-A-B型酸敏感的兩親性陽離子共聚物的制備：
[0132] C-A-B-17
[0133] 取0 ? Olmol PEG5_-NH2溶于10ml乙酸乙酯中，加入0 ? 24mol N-(2-(二甲氨基）乙 基）-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺(DMAE)與0.36mol N-(2-(二異丙基）乙基）-2,5_二氧代 惡唑烷-4-甲酰胺(DPAE)，在110°C條件下反應24h，制備出產物PY8。取O.Olmol PY8溶于5ml 乙酸乙酯中，加入〇.35mol異丁基（2-(2,5-二氧代惡唑烷-4-甲酰胺）乙基）氨基甲酸酯 (AMAE(tBu))，在110°C條件下反應24h。透析凍干獲得產物。向反應管中加入2.5g產物和5ml 三氟乙酸，反應4個小時，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw: 8000-14000)在純水中透析1天， 冷凍干燥，得到產物按實施例21方法進行胍基化，得到C-A-B-17。
[0134] 采用實施例20方法，制備C-A-B-17及C-A-B-17/siRNA納米粒。結構性能見表7和表 8〇
[0135] 實施例47~49
[0136] 按實施例46方法，改變DMAE與DPAE的比例，以及不同的B、C組分，即可得到不同側 鏈氨基摩爾比的C - A - B型酸敏感的兩親性陽離子共聚物。同樣方法制備自組裝納米粒及與 siRNA的復合納米粒。結構性能見表7和表8。
[0137] 表7實施例42-49所制備的聚氨基酸類型的酸敏感的兩親性陽離子共聚物的結構 組成
[0139]表8.實施例42-49所制備的共聚物所組裝的納米粒的結構性能
[0141] 實施例50
[0142] 同實施例46方法，只是把PEG5Q(xrNH2換成氨基化的聚磷酸甜菜堿(Pro5Q(xrNH 2)，制 備出C段為PPB的三嵌段共聚物C-A-B-21。結構性能見表7和8。
[0143] 實施例51
[0144] 取0 ? 0lm〇 1實施例34制備的PCB(tBu) - CTAm溶于無水DMF中，加入DCC和NHS，活化2 小時后，加入0.06mo 1的乙二胺，反應8h，透析凍干得到PCB(tBu) -NH2。按實施例46方法，只 是把PEG5Q(xrNH2換成PCB(tBu)-NH 2,制備出C段為PCB的三嵌段共聚物C-A-B-22。結構性能見 表7和8。
[0145] 實施例52
[0146] 同實施例46方法，只是把PEG5〇()(rNH2換成RGD-PEG 5〇(xrNH2,制備出C-A-B-23。結構 性能見表7和8。
[0147] 還可以采用所述的酸敏感的兩親性陽離子聚合物共組裝來制備納米粒，實施例示 例如下，結構性能見表9:
[0148] 實施例53
[0149] 準確稱取 5mg DPAE/DMAE (摩爾比 0 ? 7)的無規(guī)共聚物P (DPAE/DMAE)，5mg 的 C - A - B -12溶于lmL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液緩慢滴加到10mL攪拌下的pH 7.4的roS中，室溫 攪拌3h后，離心分離，清液為P (DPAE/DMAE) /C - A- B -12共組裝的納米粒分散液。用實施例20 方法制備P (DPAE/DMAE) /C - A - B -12/s i RNA納米粒。
[0150] 采用同樣共組裝的方法，可以調節(jié)納米粒的內核A的組成以及外層C與B段的組成 及結構。
[0151] 實施例54
[0152] 準確稱取2mg表1中的C-A-B-15,8mg表6中的A-B-2,溶于lmL的三氟乙醇，把共聚物 溶液緩慢滴加到10mL攪拌下的生理鹽水中，室溫攪拌3h后，離心分離，清液為C-A-B- 15/A-B-2組裝納米粒的分散液。按實施例20方法制備C-A-B-15/A-B-2納米粒與siRNA復合納米粒 (C-A-B-15/A-B-2)/siRNA。
[0153] 實施例55
[0154] 準確稱取3mg表1中的A-B-8,7mg表7中的C-A-B-21，按實施例20方法組裝A-B-8/C-A-B-21 納米粒和負載 siRNA 的納米粒(A-B-8/C-A-B-21)/siRNA。
[0155] 實施例56
[0156] 準確稱取8mg表7中的A-B-10,2mg的DPAE/DMAE(摩爾比0.7)的無規(guī)共聚物P(DPAE/ DMAE)，溶于lmL的三氟乙醇，把共聚物溶液緩慢滴加到1 OmL攪拌下的生理鹽水中，室溫攪拌 3h后，離心分離，清液為A-B-10/P(DPAE/DMAE)組裝納米粒的分散液。用實施例25方法制備 負載siRNA的納米粒A-B-10/P(DPAE/DMAE)/siRNA復合納米粒。
[0157] 表8.實施例53-56所制備的共聚物所組裝的納米粒的結構性能
[0159]采用本發(fā)明的上述方法，共組裝納米粒，可以比較方便地調控納米粒的結構組成， 得到適宜負載負電性的抗體、蛋白、多肽、DNA等生物大分子類物質的納米粒，調控遞送性 能，為這些生物類藥物的體內外遞送提供了一個普適性的高效遞送技術。
【主權項】
1. 一種酸敏感的兩親性陽離子共聚物，其特征是大分子鏈上至少含有A、B段的聚合物， 其中A段是酸敏感聚合物段，在p_7的環(huán)境下是電中性的疏水聚合物，在pHS6.5的環(huán)境下 質子化而變成親水性;B段是帶有胍基基團的陽離子聚合物。2. -種權利要求1所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，特征是由一種水溶性聚合物C 鍵接的含有A、B段的聚合物；所述的A段的分子量為500~20000，B段的分子量為500~ 20000，C段的分子量為800~10000。3. 如權利要求2所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，特征是C-A-B型嵌段共聚物，其 中A段的質量百分比為10%~80%，B段的質量百分比為10%~70%，C段的質量百分比為 4%~40%;所述的C段優(yōu)選自聚羧酸甜菜堿、聚磷酸甜菜堿、聚乙二醇，或者是靶向分子或 穿膜肽修飾的聚羧酸甜菜堿、聚磷酸甜菜堿、聚乙二醇。4. 一種權利要求1所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，特征是A-B型二嵌段共聚物， 其中A段的質量百分比為10%~80%，B段的質量百分比為20%~90%。5. 如權利要求1~4所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，其中A段是帶有N，N-二異丙 基氨基酯側基的可聚合單體(Y1)與帶有N，N-二甲氨基酯側基的可聚合單體(Y2)的無規(guī)共 聚物，且Y1與Y2的摩爾比為9~0.5。6. 如權利要求5所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物，其特征是A段是甲基丙烯酸-N， N-二異丙基氨基乙酯與甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯的無規(guī)共聚物，或者是N-(2-(二異 丙基）乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺與N-(2-(二甲氨基）乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4_甲酰胺的無規(guī)共聚物，Y1與Y2的摩爾比優(yōu)選為4~0.5;B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯 或胍基化的聚氨基酸。7. 權利要求1~6所述的酸敏感的兩親性陽離子共聚物的納米粒，其特征在于是聚合物 在水中自組裝或與其它組分共組裝形成的50~500nm的納米粒，納米粒中所述的兩親性陽 離子共聚物含量50~100% ;納米粒在pH37的環(huán)境下穩(wěn)定，在pHf 6.5的環(huán)境下納米粒內核 pH敏感質子化，納米粒解體。8. 權利要求7的兩親性陽離子共聚物納米粒的應用：與DNA、RNA以及多肽、蛋白類生物 大分子復合形成納米粒，用于DNA、siRNA遞送和轉染試劑、檢測和免疫制劑的應用。9. 權利要求8的酸敏感的兩親性陽離子共聚物納米粒的應用，其特征是A-B、C-A-B型嵌 段共聚物在pH>7.2的水介質中自組裝的納米?；騾⑴c組裝的納米粒，再與負電性的DNA、 RNA以及多肽、蛋白類生物大分子復合形成復合納米粒，所述的嵌段共聚物在復合納米粒中 的質量含量為40 %~98 %。10. 權利要求9的酸敏感的兩親性陽離子共聚物納米粒的應用，其特征是所述的A-B、C-A-B型嵌段共聚物中A段是甲基丙烯酸N，N-二異丙基氨基酯的無規(guī)共聚物與N，N-取代的甲 基丙烯酸氨基酯的無規(guī)共聚物，或者是N-(2-(二異丙基)乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰 胺與N-(2-(二甲氨基)乙基)-2,5_二氧代惡唑烷-4-甲酰胺的無規(guī)共聚物，Y1與Y2的摩爾比 優(yōu)選為4~0.5，B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚氨基酸;所述的納米粒與核 酸靜電復合形成的納米復合物，納米粒與核酸的質量比N/P在1~30,粒徑在50~300nm，用 于轉染試劑和核酸的體內外遞送試劑的應用。
【文檔編號】C08F293/00GK105968276SQ201610236351
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】董岸杰, 周俊輝, 鄧聯(lián)東
【申請人】天津大學