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Dc細(xì)胞的培養(yǎng)方法、tlr激動(dòng)劑及其應(yīng)用

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Dc細(xì)胞的培養(yǎng)方法、tlr激動(dòng)劑及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法、TLR激動(dòng)劑及其應(yīng)用,其中,所述TLR激動(dòng)劑包括:多聚T寡脫氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶劑;其中,所述多聚T寡脫氧核苷酸的濃度為1~90μmol/L;所述咪唑喹啉衍生物的濃度為0.1~900μg/ml,且結(jié)構(gòu)式如下:本發(fā)明TLR激動(dòng)劑可以促進(jìn)DC細(xì)胞的快速成熟,且強(qiáng)化DC細(xì)胞的抗原呈遞能力。
【專利說(shuō)明】
DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法、TLR激動(dòng)劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法、TLR激動(dòng)劑及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] TLR(Toll-like Receptors,Toll樣受體)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì) 分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR是單個(gè)的跨膜非催化性蛋白質(zhì),可 以識(shí)別來(lái)源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障,如皮膚、粘膜 等時(shí),TLR可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。具體地,TLR是I型跨膜受體,由胞質(zhì) To 11-1L-1受體結(jié)構(gòu)域(Toll-IL-1 receptor domain,TIR結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu) 域組成。TIR結(jié)構(gòu)域提供了一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),能和MyD88(髓樣分化因子88)家族中的包含TIR結(jié)構(gòu) 域的連接蛋白產(chǎn)生同型交互作用進(jìn)而啟動(dòng)兩條主要的信號(hào)通路下傳到TLRs:-條是介導(dǎo)的 途徑導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生;另一條是IRF(干擾素調(diào)節(jié)因子)介導(dǎo)的途徑導(dǎo)致干擾素的 產(chǎn)生。TLR胞外域的特點(diǎn)是含19~26個(gè)拷貝的富含亮氨酸的重復(fù)序列(LLRs),每個(gè)LLRs含24 個(gè)氨基酸殘基,進(jìn)而TLR胞外域可以通過(guò)LLRs識(shí)別配體。
[0003] 在所有TLRs中,TLR7和TLR8在種系發(fā)生上彼此接近并且具有高度的序列同源性, 因此它們的配體識(shí)別有重疊區(qū)。迄今為止,多種配體被鑒定為TLR7和/或TLR8配體(即TLR7/ 8激動(dòng)劑),這些配體按其來(lái)源分為合成化合物和天然核苷類化合物。
[0004] 樹突細(xì)胞(Dendritic Cells,DC細(xì)胞)是近年來(lái)倍受人們關(guān)注的專職抗原呈遞細(xì) 胞(Antigen Presenting Cells,APC),能攝取、加工及呈遞抗原,啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反 應(yīng)。DC細(xì)胞的生物學(xué)功能包括:抗原提呈和免疫調(diào)節(jié)。具體地,DC細(xì)胞可表達(dá)TLR,借助TLR識(shí) 別LPS(脂多糖)、GpG-DNA、肽聚糖、脂蛋白以及分支桿菌的細(xì)胞壁成分等具有PAMP (pathogen-associated molecular patterns,病原體相關(guān)分子模式)的分子,DC細(xì)胞通過(guò) TLR作為橋梁而被微生物成分引起活化而成熟,提供獲得性免疫的共刺激信號(hào),進(jìn)而可以誘 導(dǎo)抗微生物防御系統(tǒng),產(chǎn)生IL-lf3、IL-6和TNF以及趨化型細(xì)胞因子,從而調(diào)節(jié)機(jī)體Thl和Th2 兩種方面的平衡。業(yè)已發(fā)現(xiàn),一旦某些TLR被刺激,可以促進(jìn)DC細(xì)胞成熟,細(xì)胞粘附分子和趨 化因子受體表達(dá)發(fā)生改變,上調(diào)細(xì)胞表面MHC分子、粘附分子及共刺激分子如CD40、CD54、 CD80、CD83、CD86的表達(dá),分泌促炎細(xì)胞因子11^-1、幾-6、幾-12、幾-18和11^-23。因此,1'1^能 誘導(dǎo)DC成熟和細(xì)胞因子分泌,從而調(diào)節(jié)抗原呈遞、T細(xì)胞的極化,影響和控制天然和適應(yīng)性 免疫應(yīng)答的強(qiáng)度及質(zhì)量。
[0005] 鑒于DC細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的重要作用,通常采用體外培養(yǎng)的方法對(duì)DC細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò) 增。目前,DC細(xì)胞的擴(kuò)增方案很多,如采用組合細(xì)胞因子IL-lβ、IL-6、TNF-α、PGE-2等或者聯(lián) 合聚肌胞苷酸、細(xì)菌脂多糖等促進(jìn)DC細(xì)胞成熟,然而上述促DC成熟劑僅能緩慢地促進(jìn)DC細(xì) 胞成熟,且低水平分泌促炎細(xì)胞因子,抗原呈遞能力弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種TLR激動(dòng)劑,旨在促進(jìn)DC細(xì)胞的快速成熟以及強(qiáng) 化DC細(xì)胞的抗原呈遞能力。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供一種TLR激動(dòng)劑,所述TLR激動(dòng)劑包括:多聚T寡脫氧 核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶劑;其中,所述多聚T寡脫氧核苷酸的濃度為1~90ymol/L;所 述咪唑喹啉衍生物的濃度為0.1~900μg/ml,且結(jié)構(gòu)式如下:

[0009] 優(yōu)選地,所述咪唑喹啉衍生物的濃度為500μg/ml。
[0010]優(yōu)選地,所述多聚T寡脫氧核苷酸的濃度為50ymol/L。
[0011] 此外,為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明還提供一種DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,所述培養(yǎng)方法包括 步驟如下:
[0012] 獲取未成熟DC細(xì)胞,將所述未成熟DC細(xì)胞置于培養(yǎng)基中;
[0013]再向所述培養(yǎng)基中加入TLR激動(dòng)劑進(jìn)行培養(yǎng)至所述未成熟DC細(xì)胞成熟;
[0014] 其中,所述TLR激動(dòng)劑包括多聚T寡脫氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物,所述咪唑喹啉 衍生物在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.1~0.9μg/ml且所述多聚T寡脫氧核苷酸在所述培養(yǎng) 基中的終濃度為1~4ymol/L。
[0015] 優(yōu)選地,所述咪唑喹啉衍生物的終濃度為0.5μg/ml。
[0016] 優(yōu)選地,所述多聚T寡脫氧核苷酸的終濃度為2.5ymol/L。
[0017] 優(yōu)選地,所述DC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為6~48h。
[0018]優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素4的無(wú)血清培養(yǎng)基。 [0019]優(yōu)選地,所述DC細(xì)胞為人樹突狀細(xì)胞。
[0020]此外,為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明還提供一種如上所述的TLR激動(dòng)劑在免疫佐劑的應(yīng) 用。
[0021] 本發(fā)明技術(shù)方案,通過(guò)將咪唑喹啉衍生物與多聚T寡脫氧核苷酸共混而可以起到 協(xié)同刺激DC細(xì)胞上的TLR7/8的作用,引起DC細(xì)胞表達(dá)TLR8,進(jìn)而TLR8誘導(dǎo)了DC細(xì)胞的活化 而促進(jìn)DC細(xì)胞的快速成熟;而且DC細(xì)胞大量表達(dá)TNF-a、IL-12,即TLR8同時(shí)強(qiáng)化了DC細(xì)胞的 抗原呈遞能力。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案,下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹,顯而易見(jiàn)地,下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例,對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講,在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下,還可以 根據(jù)這些附圖示出的內(nèi)容獲得其他的附圖。
[0023]圖1A為本發(fā)明實(shí)施例1培養(yǎng)24h后在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)示意圖;
[0024]圖1B為本發(fā)明對(duì)比例1培養(yǎng)24h后在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)示意圖;
[0025]圖1C為本發(fā)明對(duì)比例2培養(yǎng)24h后在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)示意圖;
[0026]圖1D為本發(fā)明對(duì)比例3培養(yǎng)24h后在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)示意圖;
[0027]圖2A為RT-PCR檢測(cè)實(shí)施例1培養(yǎng)的DC細(xì)胞TLR8表達(dá)的示意圖;
[0028] 圖2B為Western blot檢測(cè)實(shí)施例1培養(yǎng)的DC細(xì)胞TLR8蛋白表達(dá)的示意圖;
[0029]圖2C為免疫熒光法檢測(cè)實(shí)施例1培養(yǎng)的DC細(xì)胞TLR8表達(dá)的示意圖;
[0030]圖2D為激光共聚焦檢測(cè)實(shí)施例1培養(yǎng)的DC細(xì)胞TLR8的分布的示意圖;
[0031] 圖3A為ELISA檢測(cè)DC細(xì)胞在培養(yǎng)12h和24h TNF-α蛋白表達(dá)的示意圖;
[0032] 圖3B為ELISA檢測(cè)DC細(xì)胞在培養(yǎng)12h和24h IL-12蛋白表達(dá)的示意圖;
[0033] 圖3C為ELISA檢測(cè)DC細(xì)胞在培養(yǎng)12h和24h IL-10蛋白表達(dá)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖,對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例?;?于本發(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其 他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0035]本發(fā)明提供一種TLR激動(dòng)劑,該TLR激動(dòng)劑包括:多聚T寡脫氧核苷酸、咪唑喹啉衍 生物和溶劑;其中,該多聚T寡脫氧核苷酸的濃度為1~90ymol/L;該咪唑喹啉衍生物的濃度 為0.1~900μg/ml,且化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:

[0037] 本發(fā)明TLR激動(dòng)劑作為TLR的配體,將咪唑喹啉衍生物與多聚T寡脫氧核苷酸共混 而可以起到協(xié)同刺激DC細(xì)胞上的TLR7/8的作用,引起DC細(xì)胞表達(dá)TLR8,進(jìn)而TLR8誘導(dǎo)了DC 細(xì)胞的活化而促進(jìn)DC細(xì)胞的快速成熟;而且DC細(xì)胞大量表達(dá)TNF-a、IL-12,即TLR8同時(shí)可以 強(qiáng)化DC細(xì)胞的抗原呈遞能力;因此,該TLR激動(dòng)劑有效提高了DC細(xì)胞活化的效率,大大節(jié)省 了培養(yǎng)時(shí)間,同時(shí)可以縮短免疫應(yīng)答時(shí)間,提高了免疫應(yīng)答的強(qiáng)度及質(zhì)量。
[0038] 需要說(shuō)明的是,在該TLR激動(dòng)劑中,多聚T寡脫氧核苷酸(Poly dT)是寡聚脫氧核苷 酸中的一種,也可以稱為富含胸腺啼啶(T )的寡聚脫氧核苷酸(OND )(thymidine homopolymer phosphorothioate 0DN,Poly T ODN/PolydT)。該溶劑優(yōu)選為水,但不限于 水,可以擴(kuò)大解釋為培養(yǎng)液或PBS緩沖液等等,同樣是利用水溶解多聚T寡脫氧核苷酸和咪 唑喹啉衍生物,且不影響多聚T寡脫氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物的性能。
[0039]本發(fā)明還提供一種DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,該培養(yǎng)方法包括步驟如下:
[0040] SI、獲取未成熟DC細(xì)胞,將該未成熟DC細(xì)胞置于培養(yǎng)基中;
[0041 ] S2、再向該培養(yǎng)基中加入TLR激動(dòng)劑進(jìn)行培養(yǎng)至該未成熟DC細(xì)胞成熟;
[0042] 其中,該TLR激動(dòng)劑包括多聚T寡脫氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物,該咪唑喹啉衍生 物在培養(yǎng)基中的終濃度為〇. 1~〇. 9μg/ml且該多聚T寡脫氧核苷酸在培養(yǎng)基中的終濃度為1 ~4ymol/L〇
[0043] 本發(fā)明DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法通過(guò)向培養(yǎng)基中加入TLR激動(dòng)劑,DC細(xì)胞上的TLR7/8被 刺激而大量表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)DC細(xì)胞的快速成熟,同時(shí)強(qiáng)化了DC細(xì)胞的抗原呈遞能力,有效地 提高了 DC細(xì)胞活化的效率,大大節(jié)省了培養(yǎng)時(shí)間。
[0044] 進(jìn)一步地,該培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(IL_4) 的無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0045] 該巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素 4可以進(jìn)一步促進(jìn)DC細(xì)胞的活化,以加速 DC細(xì)胞的成熟,進(jìn)而誘導(dǎo)DC細(xì)胞的分化和增殖。
[0046] 進(jìn)一步地,在步驟S2中,DC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為6~48h,優(yōu)選為24h。
[0047] 在該培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi),TLR激動(dòng)劑可以充分活化DC細(xì)胞,以保證DC細(xì)胞的快速成熟 和抗原呈遞能力的強(qiáng)化。需要說(shuō)明的是,該培養(yǎng)時(shí)間從加入TLR激動(dòng)劑后開(kāi)始計(jì)算,而非從 DC細(xì)胞加入培養(yǎng)基后開(kāi)始計(jì)算。
[0048] 本發(fā)明還提供一種上述TLR激動(dòng)劑在免疫佐劑的應(yīng)用。
[0049] 該TLR激動(dòng)劑作為免疫佐劑進(jìn)行應(yīng)用時(shí),可以通過(guò)DC細(xì)胞調(diào)節(jié)抗原遞呈、T細(xì)胞的 極化,影響和控制天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度及質(zhì)量。
[0050] 現(xiàn)通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明TLR激動(dòng)劑及DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法做進(jìn)一步解釋,以詳細(xì)說(shuō) 明其技術(shù)方案及帶來(lái)的技術(shù)效果。
[0051 ] 實(shí)施例1
[0052] 一、TLR激動(dòng)劑的配制
[0053]本實(shí)施例涉及到的TLR受體為TLR7/8;所用的多聚T寡脫氧核苷酸(PolydT)從 Invitrogen公司直接購(gòu)買獲得;所用的咪唑喹啉衍生物(CL075)從Invitrogen公司直接購(gòu) 買獲得,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:
[0055] (1)、制備CL075水溶液:將500yg CL075粉末溶于ΙΟΟΟμΙ水中,配成濃度為500yg/ ml的原液,然后分裝成10管存于-20 °C備用;
[0056] (2)、制備PolydT水溶液:將lOOnmol PolydT液體溶于2ml水中,配成濃度為50μ mol/L的原液,然后分裝成10管存于-20°C備用;
[0057] (3)、制備TLR激動(dòng)劑:取0.03ml CL075水溶液、1.5ml PolydT水溶液和8.47ml的水 共混均勻,而得到約10ml TLR激動(dòng)劑。
[0058]二、未成熟的人樹突狀細(xì)胞的獲取
[0059] (1)、采集外周靜脈血50ml,經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞:
[0060] 具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,吸取上層血漿層,56°C滅活30分鐘后離心備 用,用生理鹽水對(duì)倍稀釋沉淀的血細(xì)胞,人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離 心管中,2000轉(zhuǎn)/分,離心20分鐘,小心吸取白膜層,用生理鹽水洗滌2次,轉(zhuǎn)速分別為1600 轉(zhuǎn)/分,1300轉(zhuǎn)/分,均離心7分鐘,即得到外周血單個(gè)核細(xì)胞;
[0061 ] 將上述分離的PBMCs重懸于PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opti-MEM?培養(yǎng)基的任 意一種培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞密度為(5~10)X106/ml,總體積為10ml加入T75ml的細(xì)胞培養(yǎng) 瓶?jī)?nèi),于37°C、5 % C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁2h;
[0062]輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,使未貼壁細(xì)胞重新懸浮,然后吸棄懸浮的未貼壁細(xì)胞;補(bǔ)加10ml PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opti-MEM?培養(yǎng)基的任意一種培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,使 未貼壁細(xì)胞重新懸浮,然后吸棄懸浮的未貼壁細(xì)胞,該步驟重復(fù)1~2次,則留下的貼壁細(xì)胞 即為單核細(xì)胞。
[0063] (2)、誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC分化:
[0064] 具體步驟為:
[0065]將20ml含有 10% 自體血漿、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培養(yǎng) 基或者A頂-V?培養(yǎng)基加入上述T75的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),然后置于37 °C、5 % C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng);
[0066]第三天(72h)后吸棄10ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,并補(bǔ)加10ml新鮮的含有10%自體血 漿、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4、10μg/ml的腫瘤抗原的X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者A頂-V?培養(yǎng)基,從而獲得未成熟的人樹突狀細(xì)胞。
[0067]三、人DC細(xì)胞的培養(yǎng)
[0068]選擇狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未成熟的人DC細(xì)胞,按2xl06個(gè)/孔接種于2個(gè)6孔培 養(yǎng)板中,培養(yǎng)板中置有20ml RPMI-1640培養(yǎng)基;其中,RPMI-1640培養(yǎng)基為添加了細(xì)胞因子 GM-CSF和IL-4的無(wú)血清培養(yǎng)基;
[0069]向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10ml TLR激動(dòng)劑,然后培養(yǎng)6~48h,完成后即換新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)基;
[0070] 其中,CL075在RPMI-1640培養(yǎng)基中的終濃度為0.5μg/ml,PolydT在RPMI-1640培養(yǎng) 基中的終濃度為2.5ymol/L,GM-CSF在RPMI-1640培養(yǎng)基中的終濃度為1000IU/ml,IL-4在 RPMI-1640培養(yǎng)基中的終濃度為1000IU/ml,培養(yǎng)條件:37°C、5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱。
[0071] 對(duì)比例1(CL075)
[0072]與實(shí)施例1的不同之處在于:
[0073] 采用實(shí)施例1制備的CL075水溶液替換TLR激動(dòng)劑,即向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入 CL075水溶液,使CL075的終濃度為0.5μg/ml。
[0074] 對(duì)比例 2(PolydT)
[0075] 與實(shí)施例1的不同之處在于:
[0076] 采用實(shí)施例1制備的PolydT水溶液替換TLR激動(dòng)劑,即向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入 PolydT水溶液,使PolydT的終濃度為2.5ymol/L。
[0077] 對(duì)比例 3(PBS)
[0078] 與實(shí)施例1的不同之處在于:
[0079] 采用PBS緩沖液替換TLR激動(dòng)劑,即向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10ml PBS緩沖液。其 中,該P(yáng)BS緩沖液通過(guò)NaCl 8.0g,KCl 0.2g,NaHP〇4.12H20 3.58g,KH2P〇4 0.27g,加雙蒸水 溶解,定容至1L,而制得。
[0080] 驗(yàn)證方法
[0081] 1、人樹突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
[0082]將實(shí)施例1、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3培養(yǎng)24h后的人樹突狀細(xì)胞,在倒置相差顯 微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與形態(tài)學(xué)特征。
[0083] 2、免疫熒光檢測(cè)人DC細(xì)胞TLR8的表達(dá)與分布
[0084]選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的DC細(xì)胞,按5xl04個(gè)/孔接種于鋪有玻片的24孔板,加 培養(yǎng)液lml;
[0085]培養(yǎng)1~3天后,取出玻片,PBS洗2次(注意輕柔,以防洗脫細(xì)胞);
[0086] 4%多聚甲酸0.3ml/孔固定,4°C過(guò)夜;
[0087] 吸去多聚甲醛,PBS洗2次;
[0088] 加裂解液0.3%tritoir X-100破膜,室溫反應(yīng)30min,吸去,PBS洗2次;
[0089] 加封閉液0.3%BSA(鋪滿即可),在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色, 吸取PBS洗2次,每次5min;
[0090] 加入一抗工作液(抗TLR8兔多克隆抗體),4°C反應(yīng)3h后,37°C水浴反應(yīng)45min,ros 洗2次;
[0091] 加入熒光二抗工作液(PE標(biāo)記羊抗兔IgG二抗,避光),37°C水浴30min~lh,PBS洗2 次;
[0092] 加入 Hochest33258 核熒光染色,37Γ 水浴 30min;
[0093] 甘油封存,在熒光倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下觀察,拍片。
[0094] 3、RT-PCR檢測(cè)人DC細(xì)胞TLR8表達(dá)
[0095] 調(diào)整DC細(xì)胞至lxlO6個(gè)/孔,接種于6孔板,分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1、對(duì)比例1、對(duì)比例2和 對(duì)比例3培養(yǎng)的DC細(xì)胞而分成四組,加藥孵育6h、12h和24h后,收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞,用PBS 離心洗漆細(xì)胞,加入lml Trizol,顛倒混勻數(shù)次,置-70°C冰箱保存。
[0096] (1)、總RNA 的提取:
[0097]于-70 °C冰箱取出Trizol裂解的細(xì)胞,室溫融化;
[0098] 按200μ1氯仿/ml Trizol加入氯仿,震蕩混勾15s后室溫放置15min;
[0099] 4Γ12 000g離心 15min;
[0100] 吸取上層水相,至另一離心管中;
[0101] 按500μ1異丙醇/ml Trizol加入異丙醇混勾,室溫放置10min;
[0102] 4°C12 000g離心10min,棄上清,RNA沉于管底;
[0103] 加入lml 75%乙醇,4°C7500g離心5min,盡量棄上清;
[0104] 室溫吹干至RNA沉淀呈半透明狀;
[0105] 加入10μ1 DEPC水溶解RNA樣品;
[0106] 測(cè)量0D值定量RNA濃度;
[0107] (2)、逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成:
[0108] a、反應(yīng)液的配制
[0109] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下:
[0112] b、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):
[0113] 在37°C條件下,進(jìn)行15分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);在85°C條件下,進(jìn)行5秒鐘逆轉(zhuǎn)錄酶失活 反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束之后,核酸檢測(cè)儀檢測(cè)cDNA濃度并于-20°C保存。
[0114] (3)、RT-PCR 檢測(cè) TLR8 表達(dá):
[0115] a、RT_PCR反應(yīng)體系如下:
[0117] b、循環(huán)參數(shù):共 25以1,94°(:,51^11494°(:,3〇8455°(:(1'1^8引物)/56°(:(陽(yáng)性對(duì)照), 30s-72 °C,30s,35個(gè)循環(huán)-72 °C,lOmin;
[0118] c、電泳:取10ul的上述PCR產(chǎn)物,在1.0 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,電泳條件:110 伏,約 15min;
[0119] d、染色拍照:將電泳膠泡入溴化乙錠中染色,15min后取出沖洗,拍片。
[0120] 4、ELISA檢測(cè)人DC細(xì)胞中TNF-a、IL-12以及IL-10的表達(dá)
[0121 ]調(diào)整DC細(xì)胞至2 X 106/孔,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,收集實(shí)施例1、對(duì)比例1、對(duì)比例2 和對(duì)比例3培養(yǎng)12h和24h的DC細(xì)胞培養(yǎng)液上清,于無(wú)菌EP管中,1000r/min、4°C離心5min,吸 取上清于另一批無(wú)菌EP管。利用博士德公司分裝的進(jìn)口 TNF-a、IL-12和IL-10ELISA試劑盒, 檢測(cè)DC細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-12、TNF-a和IL-10的含量。這些試劑盒是典型的夾心法 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒,檢測(cè)范圍為15.6口8/1111-100(^8/1111,敏感性〈]^8/1111。按照試劑盒 說(shuō)明書進(jìn)行操作。
[0122] 5、Western blot檢測(cè)DC細(xì)胞TLR8的表達(dá)
[0123] 樣品制備:調(diào)整DC細(xì)胞至2 X106個(gè)/孔,接種于75cm2培養(yǎng)瓶,收集實(shí)施例1、對(duì)比例 1、對(duì)比例2和對(duì)比例3培養(yǎng)48h后的DC細(xì)胞,加入RIPA裂解液100μΙ,蛋白酶抑制劑cocktail 3μ1,冰上放置30min,每lOmin震蕩一次,4°C、12000g離心15min,留取上清液,并測(cè)定蛋白濃 度。按比例在蛋白樣品中加入5 X SDS-PAGE上樣緩沖液,沸水浴加熱lOmin,保存于-20度;
[0124] SDS-PAGE電泳;
[0125] Western-blot 分析。
[0126] 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0127]圖像制作采用GraphPad Prism5軟件處理。采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果用-X土sd(平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)表示,給藥組的多個(gè)均數(shù)間比較采用單因素方差分析 (One-way AN0VA),接著進(jìn)行Dunnett多重比較試驗(yàn)來(lái)比較組間差異。兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)(Student's t test),Ρ<0·05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0128] 驗(yàn)證結(jié)果如下:
[0129] 一、人DC細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)
[0130] 未成熟的DC細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)是呈梭形、星形和多角形的樹突狀細(xì)胞,與成熟的樹突 狀細(xì)胞相比,樹突不長(zhǎng),個(gè)體較小,細(xì)胞透亮,細(xì)胞核清晰。圖1A至圖1D依次為實(shí)施例1、對(duì)比 例1、對(duì)比例2和對(duì)比例3的DC細(xì)胞用藥物刺激24h后在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)示意圖,結(jié) 果顯示:對(duì)比例3(未刺激)、對(duì)比例1(單用CL075刺激)或?qū)Ρ壤?(單用Poly dT刺激)的細(xì)胞 較幼小,樹突較短且少(圖1B、圖1C、圖1D)。實(shí)施例1 (CL075+P〇ly dT聯(lián)合用藥刺激)的細(xì)胞 樹突增多且伸長(zhǎng)(圖1A)。因此,實(shí)施例1的TLR激動(dòng)劑對(duì)DC細(xì)胞的刺激效果優(yōu)于對(duì)比例1或?qū)?比例2的刺激效果,且優(yōu)于對(duì)比例1與對(duì)比例2的效果之和。
[0131] 二、TLR8在DC細(xì)胞的表達(dá)與分布
[0132] 將實(shí)施例1的DC細(xì)胞培養(yǎng)1~2天,并收集,用roS洗滌細(xì)胞,提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,用雙蒸水作為陰性對(duì)照,用RAW細(xì)胞(RAW 264.7)作為陽(yáng)性對(duì)照;
[0133] (1)、RT-PCR檢測(cè)TLR8 mRNA的表達(dá),如圖2A所示,圖2A中RT-PCR檢測(cè)DC細(xì)胞TLR8 mRNA的表達(dá):
[0134] "DC"代表DC細(xì)胞TLR8 mRNA的RT-PCR產(chǎn)物;
[0135] 代表采用雙蒸水作為陰性對(duì)照;
[0136] "+"代表采用RAW細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,RAW細(xì)胞TLR8 mRNA的RT-PCR產(chǎn)物;
[0137] "M"代表采用DL2000作為DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物;
[0138] (2)、提取總蛋白,Western blot檢測(cè)TLR8蛋白表達(dá),如圖2B所示,圖2B中Western blot檢測(cè)DC細(xì)胞TLR8蛋白表達(dá):
[0139] "Γ代表采用RAW細(xì)胞TLR8條帶作為陽(yáng)性對(duì)照;
[0140] "2"代表DC細(xì)胞TLR8條帶;
[0141] (3)、用免疫熒光法進(jìn)一步確定DC細(xì)胞TLR8的表達(dá),如圖2C所示,圖2C中免疫熒光 法檢測(cè)DC細(xì)胞TLR8蛋白表達(dá)(熒光顯微鏡,400x),紅色熒光不規(guī)則團(tuán)塊表示TLR8,藍(lán)色熒光 圓點(diǎn)表示細(xì)胞核;
[0142] (4)、最后通過(guò)激光共聚焦確定TLR8的分布,如圖2D所示,圖2D中激光共聚焦檢測(cè) TLR8表達(dá)與分布:紅色熒光圓點(diǎn)表示TLR8,藍(lán)色熒光不規(guī)則團(tuán)塊表示細(xì)胞核,圖中標(biāo)尺比例 為 ΙΟμπι;
[0143] 因此,結(jié)果從mRNA水平(表達(dá)為365bp)(圖2Α)和蛋白水平(圖2Β、圖2C、2D)都證實(shí) DC細(xì)胞表達(dá)TLR8,而且TLR8主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)(圖2D)。
[0144] 三、實(shí)施例1(CL075+Poly dT合用)促進(jìn)DC細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12
[0145] 收集實(shí)施例1、對(duì)比例1、對(duì)比例2和對(duì)比例3培養(yǎng)12h和24h后的培養(yǎng)液上清,ELISA 檢測(cè)其TNF-a、IL-12和IL-10蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:與對(duì)比例相比,實(shí)施例l(CL075+PolydT合 用)細(xì)胞分泌TNF-a和IL-12的水平均顯著增加 (*p〈0.05),且遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)比例1和對(duì)比例2,如 圖3A和圖3B所示;而IL-10的分泌水平顯著降低(*p〈0.05),如圖3C。盡管對(duì)比例1細(xì)胞分泌 TNF-a、和IL-12水平也略有增加,但與對(duì)比例3相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且對(duì)比例1對(duì)IL-10 的表達(dá)沒(méi)有影響,而對(duì)比例2的DC細(xì)胞TNF-a、IL-12和IL-10表達(dá)量均無(wú)變化,如圖3A、圖3B 圖3C所示。因此,實(shí)施例1顯著促進(jìn)DC細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12。
[0146] 綜上所示,實(shí)施例1(CL075+Poly dT合用)培養(yǎng)的DC細(xì)胞樹突增多,TLR激動(dòng)劑能顯 著激活DC細(xì)胞,使DC細(xì)胞快速成熟。實(shí)施例1培養(yǎng)的DC細(xì)胞表達(dá)的蛋白水平證實(shí),DC細(xì)胞表 達(dá)TLR8,而且TLR7/8主要分布于細(xì)胞漿內(nèi),即TLR激動(dòng)劑能夠刺激TLR8,活化TLR8,進(jìn)而促進(jìn) DC細(xì)胞快速成熟。實(shí)施例1培養(yǎng)的DC細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-12顯著增加,而IL-10的分泌顯著 減少,即TLR激動(dòng)劑可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答,而強(qiáng)化抗原呈遞。
[0147] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例,并非因此限制本發(fā)明的專利范圍,凡是在本 發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下,利用本發(fā)明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所作的等效變換,或直接/間接運(yùn)用在其 他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種TLR激動(dòng)劑,其特征在于,包括: 多聚T寡脫氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶劑; 其中,所述多聚T寡脫氧核苷酸的濃度為1~90ymol/L; 所述咪唑喹啉衍生物的濃度為0.1~900μg/ml,且結(jié)構(gòu)式如下:〇2. 如權(quán)利要求1所述的TLR激動(dòng)劑,其特征在于,所述咪唑喹啉衍生物的濃度為500ug/ ml〇3. 如權(quán)利要求1或2所述的TLR激動(dòng)劑,其特征在于,所述多聚T寡脫氧核苷酸的濃度為 50ymol/L〇4. 一種DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,包括步驟如下: 獲取未成熟DC細(xì)胞,將所述未成熟DC細(xì)胞置于培養(yǎng)基中; 再向所述培養(yǎng)基中加入TLR激動(dòng)劑進(jìn)行培養(yǎng)至所述未成熟DC細(xì)胞成熟; 其中,所述TLR激動(dòng)劑包括多聚T寡脫氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物,所述咪唑喹啉衍生 物在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.1~〇.9μg/ml且所述多聚T寡脫氧核苷酸在所述培養(yǎng)基中 的終濃度為1~4ymol/L。5. 如權(quán)利要求4所述的DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述咪唑喹啉衍生物的終濃度 為0·5μg/ml。6. 如權(quán)利要求4或5所述的DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述多聚T寡脫氧核苷酸的 終濃度為2.5ymol/L。7. 如權(quán)利要求4所述的DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述DC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為6~ 48h〇8. 如權(quán)利要求4所述的DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落 刺激因子和白細(xì)胞介素4的無(wú)血清培養(yǎng)基。9. 如權(quán)利要求4所述的DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述DC細(xì)胞為人樹突狀細(xì)胞。10. -種如權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的TLR激動(dòng)劑在免疫佐劑的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0784GK105950555SQ201610377498
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】曾憲卓, 唐熙
【申請(qǐng)人】深圳愛(ài)生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
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