一種高效表達(dá)堿性果膠酶的菌株及其構(gòu)建與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)堿性果膠酶的菌株及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將畢赤酵母的ERO1及UBC1基因組合克隆連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPGAZA上，并轉(zhuǎn)化至Pichiapastoris GS115?pPIC9K?PGL菌株中，得到一株較原有菌株高效表達(dá)堿性果膠酶的菌株GS115/PGL?ERO1?UBC1，搖瓶發(fā)酵時(shí)相比于使用該方法前的菌株P(guān)ichiapastoris GS115?pPIC9K?PGL酶活提高49.4％，有明顯提高，在3L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)重組菌株P(guān)ichiapastoris GS115/PGL?ERO1?UBC1最大酶活達(dá)到1362.31U/ml，實(shí)現(xiàn)堿性果膠酶高效表達(dá)，為堿性果膠酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種高效表達(dá)堿性果膠酶的菌株及其構(gòu)建與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)堿性果膠酶的菌株及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 果膠酶是一種復(fù)合酶，能夠?qū)⒐z聚合物分解成不飽和寡聚半乳糖醛酸。該酶分 布廣泛，在部分寄生線蟲、植物和微生物內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。果膠酶應(yīng)用廣泛，已有40多年的工業(yè) 應(yīng)用史。根據(jù)最適反應(yīng)pH的不同將果膠酶分為酸性果膠酶和堿性果膠酶PGL。其中酸性果膠 酶主要應(yīng)用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果實(shí)脫皮等方面。PGL應(yīng)用主要應(yīng)用于紡織、食 品、造紙行業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域。應(yīng)用酶法作用上述領(lǐng)域相關(guān)反應(yīng)具有環(huán)保、節(jié)約原料耗材和反應(yīng) 條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。然而目前對(duì)PGL進(jìn)行分子改造研究較少，進(jìn)行商品化的PGL也很少。
[0003] 目前對(duì)堿性果膠酶研究比較深入的菌株主要是畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和大腸桿 菌。綜合比較可表達(dá)堿性果膠酶的不同宿主，畢赤酵母表達(dá)蛋白易于純化，產(chǎn)量高，但異源 蛋白過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)脅迫壓力引起未折疊蛋白效應(yīng)(UPR)，導(dǎo)致堿性果膠酶的產(chǎn)量不 能進(jìn)一步提高，限制了堿性果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種高效表達(dá)堿性果膠酶的重組菌株。
[0005] 所述重組菌是將畢赤酵母ER01及UBC1基因組合連接到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZA， 并轉(zhuǎn)化至重組表達(dá)堿性果膠酶的畢赤酵母中。
[0006] 所述ER01基因的序列是NCBI中GenBank登錄號(hào)XM_002489600.1記載的序列，所述 UBC1基因的序列是NCBI中GenBank登錄號(hào)XM_002493814.1記載的序列。
[0007] 本發(fā)明還提供所述重組菌的構(gòu)建方法，步驟如下：
[0008] (1)合成獲得ER01及UBC1基因；
[0009] (2)將步驟（1)獲得的ER01及UBC1基因分別連接到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZA上，得 到重組質(zhì)粒pGAPZA-EROl，pGAPZA-UBCl;
[0010] (3)將步驟（2)獲得的重組質(zhì)粒pGAPZA-ER01、pGAPZA-UBCl，根據(jù)Bgl Π 與BamH I 為同尾酶效應(yīng)構(gòu)建雙基因組合共表達(dá)載體pGAPZA-EROl-UBCl;
[0011] (4)將步驟(3)獲得的重組質(zhì)粒pGAPZA-EROl-UBCl轉(zhuǎn)化重組表達(dá)堿性果膠酶的畢 赤酵母中得到分泌增強(qiáng)型基因工程菌株。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組表達(dá)堿性果膠酶的畢赤酵母是將核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的堿性果膠酶基因，連接到表達(dá)載體pPIC9K上，然后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 宿主菌株GS115中得到的。
[0013] 本發(fā)明還提供應(yīng)用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將重組菌活化后接種至生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY 中于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)24h，然后再轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，于23°C、220rpm下每 24h添加1.5%的甲醇誘導(dǎo)堿性果膠酶的表達(dá)。所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY(IL):蛋白胨20g，酵母 粉10g，甘油40g，YNB13.4g，以pH6.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至pH6.0。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BMMY(1L):蛋白胨20g，酵母粉1 Og，甲醇9 %，YNB 13.4g，以pH6.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液調(diào) pH至ρΗ6·0。
[0015]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將活化后的菌液接種于裝液量20~30% 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500~550r/min，通氣量為1.5~2vvm，控制ρΗ5.5-6.0，生 長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為28-30°C;當(dāng)甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以指數(shù)流加方式補(bǔ)加甘油，待甘油再次耗 盡溶氧反彈時(shí)，饑餓培養(yǎng)1~2h，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時(shí)將溫度降低至20-22Γ，攪拌轉(zhuǎn) 速升高至900-1000r/min，誘導(dǎo)PGL表達(dá)。
[0016]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有：85%磷酸26.7ml/L，CaS〇4 0.93g/L，K2S〇4 18.2g/L，MgS〇4.7H20 14.9g/L，K0H 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTMi 4.35ml/ L。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有12ml/L PTMj^甲醇。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用分階段流加方式:0_8h流速2ml/h， 8-90h流速9.6ml/h，>90h流速2ml/h。
[0018] 有益效果：相對(duì)于現(xiàn)有的基因工程菌株P(guān)ichia pastoris GS115/PGL(直接以 pGAPZA表達(dá)堿性果膠酶)而言，本發(fā)明的基因工程菌株P(guān)ichia pastoris GS115/PGL-ER01-UBC1在搖瓶發(fā)酵時(shí)酶活提高了49.4%，且相比單獨(dú)共表達(dá)單個(gè)分子伴侶的重組菌株P(guān)ichia pastoris GS115/PGL-ER01 及Pichia pastoris GS115/PGL-UBC1 也分別提高了10.3%及 22.1%，在3L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)Pichia pastoris GS115/PGL-ER01-UBC1 最大酶活達(dá)到 1362.31U/ml，相比于未共表達(dá)分子伴侶的重組菌株GS115/PGL的934.34U/ml有明顯提高， 提高了 45.8%，實(shí)現(xiàn)了堿性果膠酶高效表達(dá)。本發(fā)明的堿性果膠酶可在堿性條件下催化通 過反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1，4糖苷鍵裂解，廣泛應(yīng)用于食品、紡織和造紙等行業(yè)。
【附圖說明】
[0019]圖1:克隆表達(dá)質(zhì)粒不意圖。
[0020]圖2:分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳分析;泳道1-5分別為誘導(dǎo)24h、 48h、72h、96h、120h發(fā)酵上清樣品。
[0021 ]圖3:共表達(dá)重組菌株搖瓶發(fā)酵性能。
[0022] 圖4:重組菌株在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程發(fā)酵性能。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 培養(yǎng)基：
[0024]種子培養(yǎng)基YPD:胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L。
[0025]生長(zhǎng)培養(yǎng)基 BMGY(IL):蛋白胨 20g，酵母粉10g，甘油 40g，YNB13.4g，&pH6.(^0.1M 的磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至pH6.0。
[0026] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY(IL):蛋白胨20g，酵母粉10g，甲醇9%，YNB13.4g，以pH6.0的0.1M 的磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至pH6.0。
[0027]堿性果膠酶酶活測(cè)定：
[0028]采用分光光度法測(cè)定。單位酶活定義:單位時(shí)間裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生Ιμπιο?的不 飽和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活測(cè)定條件為:酶活力檢測(cè):發(fā)酵液SOOOrpm離心10min， 胞外PGL即包含于發(fā)酵上清液之中，取一定量做檢測(cè)。PGL反應(yīng)體系：含0.2 %聚半乳糖醛酸 (底物）的甘氨酸-NaOH 緩沖液(0.2mol · L-SOj-mol · L-1 的 CaCl2，pH9.4)2mL，待測(cè)樣品 20 yL，無活性的酶液為空白對(duì)照。PGL反應(yīng)條件為:將反應(yīng)體系置于45 °C下水浴15min，用3mL磷 酸溶液(〇.〇3mol · Γ1)終止反應(yīng)，在235nm處測(cè)定吸光度值。
[0029]實(shí)施例1:重組菌的構(gòu)建及鑒定
[0030] 提取畢赤酵母RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法獲得 ER01及UBC1基因，將其克隆至表達(dá)載體pGAPZA上，獲得重組質(zhì)粒pGAPZA-EROl及pGAPZA-UBC1，再根據(jù)Bgl Π 與BamH I為同尾酶效應(yīng)構(gòu)建雙基因組合共表達(dá)載體pGAPZA-EROl-UBCl (克隆表達(dá)質(zhì)粒示意圖見附圖1)，將重組載體PGAPZA-ER01-UBC1轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115-pPIC9K-PGL(將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的堿性果膠酶基因，連接到表達(dá)載體 PPIC9K上，然后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母宿主菌株GS115中得到的），經(jīng)篩選鑒定獲得共表達(dá)重組菌 株P(guān)ichia pastoris GS115PGL-ER01-UBC1。
[0031]引物如下：
[0036]畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法。
[0037]具體步驟如下:挑取酵母受體菌的單菌落接種于25mLYro液體培養(yǎng)基中，30°C搖床 過夜；以5%接種量轉(zhuǎn)接501111^?0液體培養(yǎng)基，30°(：搖床培養(yǎng)至00 = 1.3-1.5;4°(：離心， 5000rpm，5min，棄上清；用50mL冰預(yù)冷無菌水將菌體重懸；4°C離心5000rpm，5min，棄上清； 用25mL冰預(yù)冷無菌水將菌體重懸；4°C離心5000rpm，5min，棄上清;再用5mL lmol/L的冰預(yù) 冷的山梨醇洗滌1次，重懸，4°C，5000rpm離心5min，棄上清;加入適量體積lmol/L的冰預(yù)冷 的山梨醇，重懸;分裝至無菌EP管中，每管80μ1，以備轉(zhuǎn)化。將提取的共表達(dá)載體pGAPZA-X用 酶AvrII線性化，在80μ1酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入用合適酶切位點(diǎn)線性化的質(zhì)粒l-5yg冰上放 置15分鐘，迅速加入0.2cm電擊杯中（冰預(yù)冷），1500v電擊，迅速加入lml冰預(yù)冷的山梨醇，涂 含有200μg/ml Zeocin的YPDS平板，培養(yǎng)3-4天后挑取單克隆。
[0038]實(shí)施例2:共表達(dá)基因工程菌株的酶活測(cè)定及蛋白電泳
[0039]培養(yǎng)方法：菌株在種子活化后接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)基YPD，于30°C、220rpm條件下 培養(yǎng)14h，轉(zhuǎn)接至優(yōu)化后的生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)24h，再將菌株 轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中23°C、220rpm每24h添加1.5%的甲醇，誘導(dǎo)堿性果膠酶的表達(dá)。
[0040] 酶活測(cè)定條件為:發(fā)酵液SOOOrpm離心10min，胞外PGL即包含于發(fā)酵上清液之中， 取一定量做檢測(cè)。PGL反應(yīng)體系：含0.2 %聚半乳糖醛酸（底物）的甘氨酸-NaOH緩沖液 (0.2mol · L-· L-1的CaC12，pH9.4)2mL，待測(cè)樣品20yL，無活性的酶液為空白對(duì) 照。PGL反應(yīng)條件為:將反應(yīng)體系置于45°C下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol · L-〇終止 反應(yīng)，在235nm處測(cè)定吸光度值。
[0041] 選用碧云天SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒配制12%分離膠和5%濃縮膠，具體操作方 法見產(chǎn)品說明書。樣品與5X上樣緩沖液以體積比4:1混合，沸水浴10min，冷卻后上樣。電泳 時(shí)，80V恒壓電壓，待指示劑進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)至150V，待指示劑至膠底時(shí)結(jié)束電泳。用 考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色，染色lh后脫色(SDS-PAGE圖譜見附圖2)。
[0042]實(shí)施例3:3L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
[0043]從固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基（500ml三角瓶中裝液量50ml) 中30 °C，220rpm培養(yǎng)24h作為種子液，然后以10 %接種量接種于包含800ml分批發(fā)酵培養(yǎng)基 (85%磷酸26.7ml/L，CaS〇4 0.93g/L，K2S〇4 18.2g/L，MgS〇4.7H20 14.9g/L，K0H 4.13g/L， 甘油AO.Og/UPTMi 4.35ml/L)的3L發(fā)酵罐(美國(guó)NBS公司）中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500r/min，通 氣量為2vvm，50 %氨水及30 %磷酸控制pH5.5，生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為30°C，當(dāng)甘油耗盡溶氧反 彈時(shí)以指數(shù)流加方式補(bǔ)加50%(w/v含12ml/L PTM!)甘油，待甘油再次耗盡溶氧反彈時(shí)，饑 餓培養(yǎng)lh，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基（100%甲醇含12ml/L PTM!)，同時(shí)溫度降低至22°C，攪拌轉(zhuǎn) 速升高至900r/min，誘導(dǎo)PGL表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用分階段流加方式:0-8h流速2ml/h，8-90h 流速9.6ml/h，>90h流速2ml/h。每隔12h取樣一次，測(cè)定生物量，酶活，蛋白含量等參數(shù)。 [0044] 搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵96h時(shí)，重組菌Pichia pastoris GS11/PGL-ER01-UBC1的酶活為 450.12U/ml，相比于比共表達(dá)分子伴侶前的出發(fā)菌株P(guān)ichia pastoris GS115_pPIC9K_PGL (酶活為301.32U/ml)及單獨(dú)共表達(dá)單個(gè)分子伴侶的重組菌株P(guān)ichia pastoris GS115/ PGL-ER01 (酶活408 · 27U/ml)及Pichia pastoris GS115/PGL-UBC1 (酶活368 · 54U/ml)，分別 提高了49.4%、10.3%及22.1 % (共表達(dá)重組菌株搖瓶發(fā)酵時(shí)發(fā)酵性能見附圖3)，同時(shí)在3L 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)Pichia pastoris GS115/PGL-ER01-UBC1最大酶活達(dá)到1362.31U/ml(重 組菌分批補(bǔ)料發(fā)酵性能見圖4)，相比于未共表達(dá)分子伴侶的重組菌株GS115/PGL的 934.34U/ml有明顯提高，提高了45.8%，實(shí)現(xiàn)了堿性果膠酶高效表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效表達(dá)堿性果膠酶的重組菌株，其特征在于，是將畢赤酵母EROl及UBCl基因 組合連接到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZA，并轉(zhuǎn)化至重組表達(dá)堿性果膠酶的畢赤酵母中。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效表達(dá)堿性果膠酶的重組菌株，其特征在于，所述重組 表達(dá)堿性果膠酶的畢赤酵母，是以Pichia pastoris GS115為宿主，以pPIC9K為表達(dá)載體， 表達(dá)基因序列如SEQ ID NO. 1所示的堿性果膠酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效表達(dá)堿性果膠酶的重組菌株，其特征在于，所述EROl 基因的序列是NCBI中GenBank登錄號(hào)XM_002489600.1記載的序列，所述UBCl基因的序列是 NCBI中GenBank登錄號(hào)XM_002493814 · 1記載的序列。4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 合成獲得EROl及UBCl基因； (2) 將步驟（1)獲得的ERO1及UBC1基因分別連接到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZA上，得到重 組質(zhì)粒pGAPZA-EROl，pGAPZA-UBCl; (3) 將步驟（2)獲得的重組質(zhì)粒pGAPZA-EROI、pGAPZA-UBCI，根據(jù)Bg 1 Π 與BamH I為同 尾酶效應(yīng)構(gòu)建雙基因組合共表達(dá)載體PGAPZA-ER01-UBC1; (4) 將步驟(3)獲得的重組質(zhì)粒pGAPZA-EROl-UBCl轉(zhuǎn)化重組表達(dá)堿性果膠酶的畢赤酵 母中。5. -種應(yīng)用權(quán)利要求1-3任一所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，是將重組菌活化后接種至生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY 中于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)24h，然后再轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，于23°C、220rpm下每 24h添加1.5%的甲醇誘導(dǎo)堿性果膠酶的表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY按每升計(jì)含有：蛋白 胨20g，酵母粉IOg，甘油40g，YNB13 · 4g，以pH6 · 0的0 · IM的磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至pH6 · 0;所述 誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY按每升計(jì)含有：蛋白胨20g，酵母粉IOg，甲醇90ml，YNBl3.4g，以pH6.0的 0.1 M的磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至pH6.0。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，是將活化后的菌液接種于裝液量20~30 % 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500~550r/min，通氣量為1.5~2vvm，控制pH5.5-6.0，生 長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為28-30°C;當(dāng)甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以指數(shù)流加方式補(bǔ)加甘油，待甘油再次耗 盡溶氧反彈時(shí)，饑餓培養(yǎng)1~2h，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時(shí)將溫度降低至20-22Γ，攪拌轉(zhuǎn) 速升高至900-1000r/min，誘導(dǎo)PGL表達(dá)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有:85 %磷酸26.7ml/L， CaS〇4 0.93g/L，K2S〇4 18.2g/L，MgS〇4.7H20 14.9g/L，K0H 4.13g/L，甘油40.0g/L， PTMd. 35ml/L;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有12ml/L PTM^甲醇。10. 權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌在食品、紡織、環(huán)?；蛟旒堉械膽?yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK105950491SQ201610346038
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】劉松, 陳雙全, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)