專利名稱：高效表達重組細菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高效表達重組細菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近十年來，隨著我國科學(xué)技術(shù)飛速的進步，畜牧業(yè)也得到了持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展，并成為國民經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)。然而獸藥及藥物性飼料添加劑在促進養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的同時，由于對其長期及不規(guī)范使用，也帶來了嚴重的負面影響:一是養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素造成的病原菌耐藥性越來越嚴重，造成抗生素用量逐年增加，這不僅導(dǎo)致了養(yǎng)殖成本的增加，更嚴重威脅人類安全，如2010年曾引起民眾恐慌的超級耐藥菌(攜帶NDM-1基因)足以為證；二是由于抗生素的持續(xù)添加導(dǎo)致動物性產(chǎn)品藥物殘留，可能引發(fā)致癌、致畸作用嚴重危害人體健康；三是藥物殘留及其代謝產(chǎn)物隨糞尿排除，污染環(huán)境。從發(fā)展看，在食用動物中禁用限用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為世界共識，是大勢所趨。因此，為了控制藥物殘留、提高食品安全及畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，迫切需要開發(fā)新型抗生素替代品。而細菌素因其優(yōu)良的抗菌特性、生物相容性和安全性成為了抗生素的理想替代品。屎腸球菌是美國、我國及多個國家在動物和人上允許使用的益生菌，其某些菌株能夠產(chǎn)生細菌素,而細菌素E50-52是由Enteroco ccus faecium(NRRL B-30746)產(chǎn)生，由39 個氨基酸組成，其氨基酸序列為:TTKNYGNGVCNSVNWCQCGNVWASCNLATGCAAWL CKLA (SEQID N0.2)，不含N端前導(dǎo)肽或信號序列等外延序列，為IIa類的細菌素；在100°C處理15min或在pH3.0-8.4條件下仍保持穩(wěn)定，而乳酸鏈球菌素(Nisin)在中性和堿性條件下會大量失活。與Nisin相比，細菌素E50-52有更加廣泛的熱和酸堿穩(wěn)定性?？梢?，IIa類細菌素E50-52抗菌活力高、源于益生菌、能特異性殺死病原菌、高熱和酸堿耐受性，具有重要的應(yīng)用價值。但是，目前天然產(chǎn)生菌株產(chǎn)量低，分離純化難度大，嚴重制約了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。而運用分子生物學(xué)或基因工程技術(shù)提高細菌素的產(chǎn)量是一種有效可行的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種細菌素E50-52基因。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種高效表達重組細菌素E50-52的基因工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種所述重組細菌素E50-52的制備方法。本發(fā)明提供了一種細菌素E50-52基因，其核苷酸序列如SEQ I D N0.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明還提供了含有所述細菌素E50-52基因的重組表達載體。優(yōu)選地，所述重組表達載體為pET-SUM0-E50-52，其中，SUMO為小分子泛素樣修飾蛋白。所述重組表達載體PET-SUM0-E50-52的構(gòu)建方法為設(shè)計并合成核苷酸序列如SEQID N0.1所示的細菌素E50-52基因，將合成的細菌素E50-52基因克隆到T載體上，構(gòu)建T-E50-52載體，以測序驗證正確的T-E50-52載體為模板，以引物F和引物R為引導(dǎo)進行PCR，將PCR產(chǎn)物克隆至融合表達質(zhì)粒pET-SUMO上，構(gòu)建重組表達載體pET-SUM0-E50-52，經(jīng)PCR擴增、測序驗證正確即得。其中，引物F:ACCACCAAAAACTATGGCAAC (SEQ ID N0.3)引物R:TCACTATTACGCCAGTTTGCACAG (SEQ ID N0.4)本發(fā)明還提供了含有所述重組表達載體的宿主細胞。所述宿主細胞為大腸桿菌Machl -T1K*BL21(DE3)。其中，所述大腸桿菌Mach 1 -T Ik用于保存和擴增重組表達載體pET-SUM0-E50_52，而大腸桿菌BL21 (DE3)則用來表達重組細菌素E50-52。所述宿主細胞的構(gòu)建方法為將測序正確的重組表達質(zhì)粒pET-S UM0-E50-52轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Machl -T1K*BL21(DE3)細胞。本發(fā)明提供了一種高效表達重組細菌素的基因工程菌，所述基因工程菌是攜帶PET-SUM0-E50-52重組表達載體的大腸桿菌BL21 (DE3)，能夠表達重組細菌素E50-52。本發(fā)明還提供了一種重組細菌素E50-52的制備方法，所述方法為:所述含有重組表達載體PET-SUM0-E50-52的基因工程菌BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)SUM0-E50-52融合蛋白在大腸桿菌中的表達，再利用特異性的SUMO蛋白酶對融合蛋白進行切割，經(jīng)N1-NTA Sepharose色譜柱分離純化，獲得重組細菌素E50-52。

具體地，本發(fā)明制備所述重組細菌素的方法包括如下步驟:1、SUM0-E50-52融合蛋白在大腸桿菌中的表達設(shè)計并合成細菌素E50-52基因，克隆到融合表達質(zhì)粒pET_SUM0，構(gòu)建重組載體PET-SUM0-E50-52,經(jīng)PCR擴增、測序驗證正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)SUM0-E50-52融合蛋白在大腸桿菌中的表達，通過N1-NTA Sep harose色譜柱純化，并經(jīng)Bandscan軟件、Bradford蛋白分析法測定純度、表達量,結(jié)果顯示融合蛋白SUM0-E50-52純度大于90%，表達量為117mg/L。2、表達產(chǎn)物E50-52的分離純化及活性檢測利用特異性 的SUMO蛋白酶對融合蛋白進行切割，通過N1-NT A S印harose色譜柱純化重組細菌素，并經(jīng)Bandscan軟件、Bradfor d蛋白分析法及MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜測定其純度、表達量及分子量，最后驗證重組細菌素的抗菌活性。結(jié)果表明融合蛋白被高效酶切，純化后，重組細菌素E50-52純度大于95%，表達量為16mg/L。經(jīng)質(zhì)譜測定分析及抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，重組細菌素分子量與天然細菌素分子量相吻合，并具有同天然細菌素相似的抑菌活性，即獲得了重組細菌素E50-52。本發(fā)明還對表達產(chǎn)物E50-52的生物特性及應(yīng)用進行了研究。用標準大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌株平板鑒定活性，并通過測定表明本發(fā)明重組細菌素E50-52對病毒、常見細菌均有較強的抑制作用；動物攻毒保護試驗、急性毒性試驗、全身性過敏試驗和長期毒性試驗表明該重組細菌素E50-52是安全的，可依此方法研制新型高效抗生素替代品。本發(fā)明還提供了所述方法制備的重組細菌素E50-52在制備抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種含有有效劑量的所述方法制備的重組細菌素E50-52的抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑。本發(fā)明還提供了所述方法制備的重組細菌素E50-52在制備治療動物腸道疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種含有所述方法制備的重組細菌素E50-52的治療動物腸道疾病的藥物。進一步優(yōu)選地,所述動物為雞。本發(fā)明的優(yōu)點在于:(I)本發(fā)明通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達重組細菌素E50-52的基因工程菌，提高了細菌素E50-52的產(chǎn)量。(2)本發(fā)明通過基因工程方法生產(chǎn)細菌素E50-52，成本低于化學(xué)合成法；且只需一次酶切即可得到重組細菌素E50-52，純化步驟簡便，得率高。(3)本發(fā)明的重組細菌素抗菌活性及穩(wěn)定性較好，且不易產(chǎn)生耐藥性，可作為理想的抗生素替代品和人畜生物性藥物、飼料添加劑、防腐劑、消殺劑等。


圖1是pET-SUM0-E50-52重組表達載體構(gòu)建示意圖。圖2是重組表達載體pET-SUM0-E50-52的PCR鑒定圖，其中M為marker II ; I為重組表達載體PET-SUM0-E50-52。圖3是pET- SUM0-E50-52重組表達載體測序圖，框中為目的序列。圖4是SUM0-E50-52融合蛋白表達情況分析圖，其中M為蛋白質(zhì)低分子量markers ;1為未誘導(dǎo)菌體破碎上清；2，4為1.5mM IPTG誘導(dǎo)后菌體破碎上清；3為菌體破碎后不溶蛋白；箭頭所示區(qū)域為融合蛋白。圖5是SUM0-E50-52純化情況分析圖，其中M為蛋白質(zhì)低分子量markers ；1為洗脫峰樣品；2為穿透樣品；3為菌體破碎后沉淀；4為菌體破碎后上清；箭頭所示區(qū)域為純化后的融合蛋白。圖6是融合蛋白SUM0-E50-52酶切及E50-52純化情況分析圖，其中M為蛋白質(zhì)低分子量markers ；1為純化的SUM0-E50-52融合蛋白；2為酶切后樣品；3為純化的重組細菌素 E50-52。圖7是重組細菌素E50-52分子量質(zhì)譜檢測。圖8是重組細菌素E50-52對金黃色葡萄球菌抑菌活性檢測；其中I為重組細菌素E50-52 (32yg/mL，加樣量IOOyL) ;2為陰性對照(PBS) ；3為SUM0-E50-52融合蛋白(130μ g/mL，加樣量 100 μ L)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，本發(fā)明實施例中所用的實驗材料、試劑和儀器等均可市售獲得，若未具體指明，實施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。融合表達質(zhì)粒pET-SUMO，大腸桿菌(Escherichiacoli )Machl -TlK、BL21 (DE3)均購自Invitrogen (美國)公司。T載體購自天根生化科技(北京)有限公司。AB4700MALD1-T0F/T0F 質(zhì)譜儀購自美國 AB 公司。英國種短毛豚鼠、SPF級KM雄鼠、昆明種小鼠及大鼠均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。肉仔雞購自北京華都集團有限責(zé)任公司。致病性雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌E.coli K88、單增李斯特菌Listeriamonocytogenes IVDC C53005、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923 均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。MDCK細胞，HEP-2細胞分別購自中國獸藥監(jiān)察所。實施例1重組細菌素E50-52的制備1、設(shè)計并合成E50-52基因序列根據(jù)GenBank公布的bacteriocin E50-52氨基酸序列及大腸桿菌密碼子使用偏好(參考http://www.kazusa.0r.jp/codon)進行基因序列設(shè)計合成細菌素E50-52基因,合成的細菌素E50-52基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。設(shè)計序列提交Invitrogen公司進行基因合成,合成后連入T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到Τ-Ε50-52載體，測序驗證。2、構(gòu)建 pET-SUM0-E50-52 重組質(zhì)粒
·
由于使用的表達載體pET-SUMO是線性化的且含有突出的T堿基，故以T_E50_52載體為模板，以引物F和引物R為引導(dǎo)進行PCRJf PCR產(chǎn)物進行純化，可以通過“TA克隆”的方式將純化的PCR產(chǎn)物與載體pET-SUMO連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-SUM0-E50-52。PET-SUM0-E50-52重組表達載體的構(gòu)建見圖1所示。其中，引物F:ACCACCAAAAACTATGGCAAC (SEQ ID N0.3)引物R:TCACTATTACGCCAGTTTGCACAG (SEQ ID N0.4)3、pET-SUM0-E50-52重組表達載體轉(zhuǎn)化(I)取10 μ L連接產(chǎn)物，加入到裝有200 μ L大腸桿菌Machl -T1K感受態(tài)細胞的離心管中，用帶槍頭的微量移液器輕輕混勻，冰浴30min。(2)迅速將離心管置于冰上lOmin，無菌條件下加入400 μ L LB液體培養(yǎng)基，180r/min, 37°C振蕩培養(yǎng)45min，復(fù)蘇細菌，使抗生素抗性基因表達。(3)將復(fù)蘇的細菌在室溫下5000r/min離心5min,棄去500 μ L上清,用剩余100 μ L
LB重懸細菌。(4)混勻后將菌液轉(zhuǎn)移至含卡那霉素的LB瓊脂平板上，用無菌的涂布玻璃棒使菌液均勻的涂布于平板表面，37°C靜置lh，待菌液被吸收后，將平板倒置放于培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng) 12-16h。同時設(shè)兩個試驗對照組，以確保試驗的準確性，其他操作與試驗組相同。對照組1:用同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，正常情況下，該組在含卡那霉素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)；對照組2:用同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，取10 μ L菌液涂布于不含卡那霉素的LB平板上，正常情況下，此組會有大量菌落出現(xiàn)。
涂板LB平板培養(yǎng)過夜后挑陽性菌落進行重組質(zhì)粒提取，然后進行PCR驗證，經(jīng)
2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,驗證正確的質(zhì)粒送Invitrogen測序。測序正確的E50-52基因序列(3 ’端含終止密碼子:TAATAGTGA):ACCACCAAAAACTACGGTAACGGTGTTTGCAACTCTGTTAACT GGTGCCAGTGCGGTAACGTTTGGGCTTCTTGCAACCTGGCTACCGGTTGCGCTGCTTGGCTGTGCAAACTGGCT TAATAGTGA，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.5 所示。重組細菌素質(zhì)粒以引物F和引物R進行PCR，所得產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，其中PET-SUM0-E50-52質(zhì)粒經(jīng)PCR后得到126bp片段，對應(yīng)條帶1，另經(jīng)Invitrogen測序結(jié)果正確(如圖3所示，框中為目的序列)(此序列同SEQ ID N0.5)。通過以上步驟，制得了含細菌素E50-52基因的pET-SUM0-E50_52重組表達載體和大腸桿菌Machl -T1KI程菌。4、構(gòu)建細菌素大腸桿菌融合表達工程菌及純化SUM0-E50-52融合蛋白將測序正確的質(zhì)粒pET-SUM0-E50-52，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，得到高效表達重組細菌素E50-52的基因工程菌。挑選陽性轉(zhuǎn)化子接種于含卡那霉素(50μ g/ml)的IOmL LB(1%葡萄糖)培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm培養(yǎng)至光密度(0D600)為
0.6-0.8，加入IPTG至終濃度1.5mM，37°C誘導(dǎo)表達5h，離心收集菌體。加入5倍體積裂解緩沖液(50mM K3PO4, 400mM NaCl, IOOmM KCl, 10% 甘油，0.5%Triton X-100, IOmM 咪唑，ρΗ7.8)重懸菌體，冰浴條件下進行超聲破碎(工作時間2s、間歇時間8s、200w、45個循環(huán))。4°C、13，OOOg離心2min，收集上清液；沉淀用等體積的去離子水溶解，制備樣品，進行Tricine-SDS-PAGE分析。菌體經(jīng)超聲破碎后離心，上清經(jīng)N1-NTA柱親和層析，用平衡緩沖液((50mM Na3PO4, 500m M NaCl, pH7.4))平衡柱體，再用10-400mM咪唑進行梯度洗脫，流速控制在2ml/min，用核酸蛋白檢測儀進行監(jiān)測，收集洗脫峰。將重組表達質(zhì)粒pET-SUM0-E50-52轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)中，IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析證實，融合蛋白SUM0-E50-52已得到高效的表達，見圖4所示，其中，M為蛋白質(zhì)低分子量markers ；1為未誘導(dǎo)菌體破碎上清；2，4為1.5mM IPTG誘導(dǎo)后菌體破碎上清；3為囷體破碎后不溶蛋白；fif頭所不區(qū)域為融合蛋白。菌體超聲破碎上清經(jīng)N1-NTA柱親和層析純化后，收集洗脫峰進行經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析顯示，融合蛋白SUM0-E50-52被高效的純化。SUM0-E50-52純化情況分析如圖5所示,其中M為蛋白質(zhì)低分子量markers ; I為洗脫峰樣品；2為穿透樣品；3為菌體破碎后沉淀；4為菌體破碎后上清；箭頭所示區(qū)域為純化后的融合蛋白。經(jīng)Bandscan軟件(BioMarin Pharmaceutical Inc., UK)分析其純度大于90%,經(jīng)Bradford蛋白分析法測定其表達量為130mg/L。5、融合蛋白的酶切及目的細菌素的純化收集的融合蛋白經(jīng)150mM NaCl透析12h，4°C后，加入SUMO蛋白酶及10XSUM0蛋白酶緩沖液(500mM Tris-HCl, ρΗ8.0, 2%Igepal (NP-40)，1.5M NaCl, IOmM DTT)，30°C切割3h，再經(jīng)N1-NTA柱親和層析，收集流出液，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測。Tricine-SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白SUM0-E50-52被高效酶切，圖6是融合蛋白SUM0-E50-52酶切及E50-52純化情況分析圖，其中M為蛋白質(zhì)低分子量markers ；1為純化的SUM0-E50-52融合蛋白；2為酶切后樣品SUM0_tag ；3為純化的重組細菌素E50-52。經(jīng)Bandscan 軟件(BioMarin Pharmaceutical Inc., UK)分析其純度大于 95 %,經(jīng) Bradford蛋白分析法測定其表達量分別為16mg/L。實施例2重組細菌素E50-52MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜分子量檢測取0.5μ L重組細菌素純化樣品，與質(zhì)譜檢測所需基質(zhì)按1:3混合點于靶上，自然晾干后，利用AB4700MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜儀掃描重組細菌素分子量。質(zhì)譜條件:離子源加速電壓為20kV，N2激光器，激光波長337nm，激光頻率200Hz，離子延遲提取時間(Pulse ionextraction, PIE) 330ns,質(zhì)譜信號單次掃描累加 2000 次，使用 peptide II standard kit(Bruker)離子峰校正(m/zl000-m/z7000)。檢測結(jié)果通過Data Explorer V4.5軟件進行分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組細菌素E50-52的分子量為3339.72Da (如圖7所示)，天然E50-52的分子量為3337.7±0.3，結(jié)果表明本發(fā)明制備的重組細菌素E50-52分子量與天然E50-52分子量相吻合。實施例3重組細菌素E50-52的抗菌活性驗證(I)杯碟法檢測抑菌活性米用杯碟法，以金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923為試驗菌株，將供試菌懸浮液200 μ L涂布于營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基,并將牛津杯放于其上,加入100 μ L重組細菌素，以同體積未酶切的融合蛋白或PBS為陰性對照，37°C培養(yǎng)8-12h。第2天觀測抑囷效果。如圖8所示，酶切前的融合蛋白無抗菌活性，經(jīng)酶切、純化后的重組細菌素E50-52顯示出對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。(2)重組細菌素最小抑菌濃度(MIC)的檢測微量稀釋法測定重組細菌素對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC25923、大腸桿菌 E.coli K88、單增李斯特菌 Listeria monocytogenes IVDC C53005最小抑菌濃度。具體操作步驟如下:將處于對數(shù)生長期的指示菌接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔接種105個細胞(90yL)。將經(jīng)純化的重組細菌素配制成系列濃度梯度溶液，各取10μ L分別加入培養(yǎng)孔中，混勻，每組重復(fù)3個孔，設(shè)只加培養(yǎng)基的孔為陰性對照。37°C培養(yǎng)箱孵育12h后取出，用酶標儀測定600nm處OD值，以在小孔內(nèi)OD值無變化的最低重組細菌素濃度為MIC。如表I結(jié)果所示，重組細菌素E50-52的最小抑菌濃度與天然細菌素最小抑菌濃度吻合，這說明重組細菌素E50-52與天然細菌素具有相似的抑菌活性。表I重組及天然細菌素E50-52最小抑菌濃度
權(quán)利要求
1.一種細菌素E50-52基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述細菌素E50-52基因的重組表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為PET-SUM0-E50-52, SUMO為小分子泛素樣修飾蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體的構(gòu)建方法為合成權(quán)利要求1所述的細菌素E50-52基因，將合成的細菌素E50-52基因克隆到T載體上，構(gòu)建T-E50-52載體，以T-E50-52載體為模板，以引物F和引物R為引導(dǎo)進行PCR，將PCR產(chǎn)物克隆至融合表達質(zhì)粒pET-SUMO上，構(gòu)建重組表達載體pET-SUM0-E50-52 ； 其中，引物F的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.含有權(quán)利要求2-4任一項所述重組表達載體的宿主細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌Machl -T1K*BL21(DE3)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞的構(gòu)建方法為將權(quán)利要求2-4任一項所述重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Machl -T1K或BL21 (DE3)細胞。
8.一種制備重組細菌素E50-52的方法，其特征在于，所述方法為權(quán)利要求6或7所述大腸桿菌BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)SUM0-E50-52融合蛋白在大腸桿菌中的表達，再利用特異性的SUMO蛋白酶對融合蛋白進行切割，經(jīng)N1-NTA Sepharose色譜柱分離純化，獲得重組細菌素E50-52。
9.權(quán)利要求8所述方法制備的重組細菌素E50-52在制備抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述方法制備的重組細菌素E50-52在制備治療動物腸道疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效表達重組細菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述基因工程菌是攜帶pET-SUMO-E50-52重組表達載體的大腸桿菌BL21(DE3)，所述基因工程菌是通過將核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的細菌素E50-52基因克隆到融合表達質(zhì)粒pET-SUMO上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞構(gòu)建的。所述基因工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)SUMO-E50-52融合蛋白在大腸桿菌中的表達，再利用特異性的SUMO蛋白酶對融合蛋白進行切割，可獲得所述重組細菌素E50-52。本發(fā)明的重組細菌素抗菌活性及穩(wěn)定性較好，且不易產(chǎn)生耐藥性，可作為理想的抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑、消殺劑等。
文檔編號A23K1/16GK103233019SQ20131017799
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月14日
發(fā)明者張日俊, 馬青山, 王慶, 黃燕, 楊軍香 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)