一種從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法，屬于蝸牛酶提取技術領域。本發(fā)明以蛞蝓為原料，粉碎得勻漿液與制得的咪唑鹽離子液體混合，攪拌萃取，過濾得含有蝸牛酶的離子液體，加入磷酸鹽溶液，分層后在向其中加入硫酸銨，離心得沉淀，再向沉淀物中加入三羥甲基氨基甲烷?鹽酸緩沖溶液，經(jīng)透析濃縮，得蝸牛酶液，進行凍干，從而得到從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法。實例證明，本發(fā)明方法獨特新穎，利用蛞蝓為原料，變害為寶，且在提取的過程中無需對原料內(nèi)臟進行分離，簡化了工藝，縮短了時間，最終制得的蝸牛酶純度高達95％以上，收率提高至90％以上，在常溫下活性保持良好，可進行大規(guī)模量產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。
【專利說明】
一種從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明公開了一種從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法，屬于蝸牛酶提取技術領域。
【背景技術】
[0002]蝸牛酶是很有價值的一種酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶，可以用于酵母細胞壁的破碎，因此廣泛用于細胞生物學和基因工程學的研究；它可做飼料添加劑，從而提高飼料的消化率;也可用作果汁澄清，橘子脫囊衣，果醬制作等。
[0003]在現(xiàn)有技術中，蝸牛酶的提取主要活體蝸牛在刺激下自身分泌出來的蝸牛粘液和蝸牛的內(nèi)臟為原料，蝸牛粘液成分包括蛋白質(zhì)，蝸牛酶，黏液素，硫酸軟骨素蛋白多糖，羥基乙酸等;蝸牛的嗦囊及消化道中含有20多種酶，蝸牛酶是多種混合酶;其中有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等;價值高，廣泛應用在細胞學，基因工程學領域，在醫(yī)學上，飼料的添加劑，保健品都有應用。
[0004]目前蝸牛酶的提取方法存在工藝復雜、操作性差和提純率低的缺陷，保存條件高使得蝸牛酶價格居高不下，不能實現(xiàn)量產(chǎn)，除此以外，國內(nèi)并有沒有完成有效的提取蝸牛酶的提取技術，一方面蝸牛粘液的提取非常困難，不能對蝸牛內(nèi)臟進行有效的分離，在提取的過程中，蝸牛酶損害嚴重，而且蝸牛酶的保存困難，影響保管運輸。
[0005]蛞蝓又稱水蜒蚰、鼻涕蟲，是一種軟體動物，是一種食性復雜和食量較大的有害動物。蛞蝓是蔬菜作物的主要有害生物之一，對葉菜類蔬菜以及果瓜、豆類蔬菜幼苗造成很大的為害，蔬菜被害后，葉片或葉球被食成孔洞或缺刻，排出的糞便污染葉面或包球，使細菌易侵入，造成菜葉或葉球腐爛，不堪食用，也極大地影響了蔬菜的品質(zhì)。
[0006]因此，目前提供一種工藝簡單、操作性強，提純率高并且能夠有效提高蝸牛酶得率的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術問題:針對目前傳統(tǒng)方法在提取蝸牛酶的過程中，仍存在工藝復雜、操作性差和提純率低問題，另外在提取過程中對蝸牛內(nèi)臟不能有效進行分離，導致蝸牛酶損害嚴重，不能實現(xiàn)量產(chǎn)的現(xiàn)狀，提供了一種以蛞蝓為原料，粉碎得勻漿液與制得的咪唑鹽離子液體混合，攪拌萃取，過濾得含有蝸牛酶的離子液體，加入磷酸鹽溶液，分層后在向其中加入硫酸銨，離心得沉淀，再向沉淀物中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液，經(jīng)透析濃縮，得蝸牛酶液，進行凍干，從而得到從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法。該方法獨特新穎，利用蛞蝓為原料，變害為寶，且在提取的過程中無需對原料內(nèi)臟進行分離，簡化了工藝，縮短了時間，最終制得的蝸牛酶純度高達95%以上，收率提高至90%以上，在常溫下活性保持良好，可進行大規(guī)模量產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。
[0008]為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:
(I)用清水洗凈兩只重量均為30?40g新鮮活體野蛞蝓，將洗凈的蛞蝓放入燒杯中，向燒杯中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸鹽溶液，將燒杯中的物質(zhì)倒入高速組織搗碎機中，以8000?lOOOOr/min的速度勻漿20?30min，充分粉碎得勻漿液，備用；
(2)量取200?300mL去離子水加入到單口燒瓶中，向單口燒瓶中加入2?3gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制溫度為O?5°C，邊攪拌邊向燒瓶中加入100?200mL質(zhì)量濃度為40%六氟磷酸溶液，攪拌反應2?3h，自然冷卻至室溫，分液，得有機相，用飽和碳酸鈉洗滌有機相，直至有機相呈中性，再減壓蒸餾，得到無色液體，即咪唑鹽離子液體；
(3)將上述咪唑鹽離子液體和I?2g磷酸氫二鉀加入到上述步驟(I)備用的勻漿液中，攪拌萃取40?50min，過濾，得濾液，將濾液靜置分層，去上層，得到含有蝸牛酶的離子液體；
(4)向上述含有蝸牛酶的離子液體中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸鹽溶液，攪拌50?60min，靜置分層，分液得到含有蝸牛酶的磷酸鹽溶液，即粗酶液；
(5)向上述粗酶液中加入3?5g硫酸錢，攪拌10?20min，于O?4°C冰箱內(nèi)，靜置5?6h，用4000?6000r/min離心機離心10?20min，得沉淀，將沉淀加入到盛有100?200mLpH7.4?7.6三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的燒杯中，攪拌10?20min后，裝入透析袋中用去離子水透析72?74h，將保留液置于濃縮罐中濃縮3?4h，得到蝸牛酶液；
(6)將上述蝸牛酶液置于-10?-15°C真空冷凍干燥器內(nèi)，凍干24?26h，得到白色粉末，即蝸牛酶。
[0009]本發(fā)明的應用方法是:在本發(fā)明制得的蝸牛酶中加入去離子水稀釋10倍，之后將退楽后的純棉紡織用品在8 O?8 5 °C的溫水中漂洗I?3次，洗后扎干，以5?8m /m i η的速度浸扎稀釋后的蝸牛酶液，扎后在60?65°C蒸汽條件下堆置，并用80?85°C的溫水再次漂洗I?3次后烘干即可。經(jīng)檢測，加入本發(fā)明制得的蝸牛酶后，處理純棉紡織用品潤濕時間由原來的30?32s提升至10?12s，百度值Wr由原有的55?56提升至78?80，效果極其顯著。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明方法獨特新穎，原料簡單易得，利用蛞蝓為原料，變害為寶，且在提取的過程中無需對蛞蝓內(nèi)臟進行分離，簡化了工藝的同時縮短了時間，綠色環(huán)保；
(2)本發(fā)明制得的蝸牛酶純度高達95%以上，收率提高至90%以上，在常溫下保持8?10年，活性仍保持良好，可進行大規(guī)模量產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0011]首先用清水洗凈兩只重量均為30?40g新鮮活體野蛞蝓，將洗凈的蛞蝓放入燒杯中，向燒杯中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸鹽溶液，將燒杯中的物質(zhì)倒入高速組織搗碎機中，以8000?10000r/min的速度勻漿20?30min，充分粉碎得勻漿液，備用；然后量取200?300mL去離子水加入到單口燒瓶中，向單口燒瓶中加入2?3g1-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制溫度為O?5°C，邊攪拌邊向燒瓶中加入100?200mL質(zhì)量濃度為40%六氟磷酸溶液，攪拌反應2?3h，自然冷卻至室溫，分液，得有機相，用飽和碳酸鈉洗滌有機相，直至有機相呈中性，再減壓蒸餾，得到無色液體，即咪唑鹽離子液體;接下來將上述咪唑鹽離子液體和I?2g磷酸氫二鉀加入到上述備用的勻漿液中，攪拌萃取40?50min，過濾，得濾液，將濾液靜置分層，去上層，得到含有蝸牛酶的離子液體;之后向上述含有蝸牛酶的離子液體中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸鹽溶液，攪拌50?60min，靜置分層，分液得到含有蝸牛酶的磷酸鹽溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入3?5g硫酸錢，攪拌10?20min，于O?4°C冰箱內(nèi)，靜置5?6h，用4000?6000r/min離心機離心10?20min，得沉淀，將沉淀加入到盛有100?200mLpH7.4?7.6三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的燒杯中，攪拌10?20min后，裝入透析袋中用去離子水透析72?74h，將保留液置于濃縮罐中濃縮3?4h，得到蝸牛酶液;最后將上述蝸牛酶液置于-10?-15°C真空冷凍干燥器內(nèi)，凍干24?26h，得到白色粉末，即蝸牛酶。
[0012]實例I
首先用清水洗凈兩只重量均為30g新鮮活體野蛞蝓，將洗凈的蛞蝓放入燒杯中，向燒杯中加入300mLpH7.4磷酸鹽溶液，將燒杯中的物質(zhì)倒入高速組織搗碎機中，以8000r/min的速度勻漿20min，充分粉碎得勻漿液，備用；然后量取200mL去離子水加入到單口燒瓶中，向單口燒瓶中加入2g1-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制溫度為O 0C，邊攪拌邊向燒瓶中加入10mL質(zhì)量濃度為40%六氟磷酸溶液，攪拌反應2h，自然冷卻至室溫，分液，得有機相，用飽和碳酸鈉洗滌有機相，直至有機相呈中性，再減壓蒸餾，得到無色液體，即咪唑鹽離子液體;接下來將上述咪唑鹽離子液體和Ig磷酸氫二鉀加入到上述備用的勻漿液中，攪拌萃取40min，過濾，得濾液，將濾液靜置分層，去上層，得到含有蝸牛酶的離子液體;之后向上述含有蝸牛酶的離子液體中加入300mLpH7.4磷酸鹽溶液，攪拌50min，靜置分層，分液得到含有蝸牛酶的磷酸鹽溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入3g硫酸銨，攪拌1min，于O V冰箱內(nèi)，靜置5h，用4000r/min離心機離心1min，得沉淀，將沉淀加入到盛有100mLpH7.4三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的燒杯中，攪拌1min后，裝入透析袋中用去離子水透析72h，將保留液置于濃縮罐中濃縮3h，得到蝸牛酶液;最后將上述蝸牛酶液置于-10°C真空冷凍干燥器內(nèi)，凍干24h，得到白色粉末，即蝸牛酶。
[0013]本實例操作簡便，使用時，在本發(fā)明制得的蝸牛酶加入去離子水稀釋10倍，之后將退漿后的純棉紡織用品在80°C的溫水中漂洗I次，洗后扎干，以5m/min的速度浸扎稀釋后的蝸牛酶液，扎后在60°C蒸汽條件下堆置，并用80°C的溫水再次漂洗I次后烘干即可。經(jīng)檢測，加入本發(fā)明制得的蝸牛酶后，處理純棉紡織用品潤濕時間由原來的30s提升至10s，百度值Wr由原有的55提升至78，效果極其顯著。
[0014]實例2
首先用清水洗凈兩只重量均為35g新鮮活體野蛞蝓，將洗凈的蛞蝓放入燒杯中，向燒杯中加入350mLpH7.5磷酸鹽溶液，將燒杯中的物質(zhì)倒入高速組織搗碎機中，以9000r/min的速度勻漿25min，充分粉碎得勻漿液，備用;然后量取250mL去離子水加入到單口燒瓶中，向單口燒瓶中加入2.5gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制溫度為3°C，邊攪拌邊向燒瓶中加入150mL質(zhì)量濃度為40%六氟磷酸溶液，攪拌反應2.5h，自然冷卻至室溫，分液，得有機相，用飽和碳酸鈉洗滌有機相，直至有機相呈中性，再減壓蒸餾，得到無色液體，即咪唑鹽離子液體;接下來將上述咪唑鹽離子液體和1.5g磷酸氫二鉀加入到上述備用的勻漿液中，攪拌萃取45min，過濾，得濾液，將濾液靜置分層，去上層，得到含有蝸牛酶的離子液體;之后向上述含有蝸牛酶的離子液體中加入350mLpH7.5磷酸鹽溶液，攪拌55min，靜置分層，分液得到含有蝸牛酶的磷酸鹽溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入4g硫酸銨，攪拌15min，于3°C冰箱內(nèi)，靜置5.5h，用5000r/min離心機離心15min，得沉淀，將沉淀加入到盛有150mLpH7.5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的燒杯中，攪拌15min后，裝入透析袋中用去離子水透析73h，將保留液置于濃縮罐中濃縮3.5h，得到蝸牛酶液;最后將上述蝸牛酶液置于-13°C真空冷凍干燥器內(nèi)，凍干25h，得到白色粉末，即蝸牛酶。
[0015]本實例操作簡便，使用時，在本發(fā)明制得的蝸牛酶加入去離子水稀釋10倍，之后將退漿后的純棉紡織用品在83°C的溫水中漂洗2次，洗后扎干，以7m/min的速度浸扎稀釋后的蝸牛酶液，扎后在63°C蒸汽條件下堆置，并用83°C的溫水再次漂洗2次后烘干即可。經(jīng)檢測，加入本發(fā)明制得的蝸牛酶后，處理純棉紡織用品潤濕時間由原來的31s提升至11s，百度值Wr由原有的55.5提升至79，效果極其顯著。
[0016]實例3
首先用清水洗凈兩只重量均為40g新鮮活體野蛞蝓，將洗凈的蛞蝓放入燒杯中，向燒杯中加入400mLpH7.6磷酸鹽溶液，將燒杯中的物質(zhì)倒入高速組織搗碎機中，以10000r/min的速度勻漿30min，充分粉碎得勻漿液，備用；然后量取300mL去離子水加入到單口燒瓶中，向單口燒瓶中加入3gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制溫度為5°C，邊攪拌邊向燒瓶中加入200mL質(zhì)量濃度為40%六氟磷酸溶液，攪拌反應3h，自然冷卻至室溫，分液，得有機相，用飽和碳酸鈉洗滌有機相，直至有機相呈中性，再減壓蒸餾，得到無色液體，即咪唑鹽離子液體；接下來將上述咪唑鹽離子液體和2g磷酸氫二鉀加入到上述備用的勻漿液中，攪拌萃取50min，過濾，得濾液，將濾液靜置分層，去上層，得到含有蝸牛酶的離子液體;之后向上述含有蝸牛酶的離子液體中加入400mLpH7.6磷酸鹽溶液，攪拌60min，靜置分層，分液得到含有蝸牛酶的磷酸鹽溶液，即粗酶液;然后向上述粗酶液中加入5g硫酸銨，攪拌20min，于4°C冰箱內(nèi)，靜置6h，用6000r/min離心機離心20min，得沉淀，將沉淀加入到盛有200mLpH7.6三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的燒杯中，攪拌20min后，裝入透析袋中用去離子水透析74h，將保留液置于濃縮罐中濃縮4h，得到蝸牛酶液;最后將上述蝸牛酶液置于-15°C真空冷凍干燥器內(nèi)，凍干26h，得到白色粉末，即蝸牛酶。
[0017]本實例操作簡便，使用時，在本發(fā)明制得的蝸牛酶加入去離子水稀釋10倍，之后將退漿后的純棉紡織用品在85°C的溫水中漂洗3次，洗后扎干，以8m/min的速度浸扎稀釋后的蝸牛酶液，扎后在65°C蒸汽條件下堆置，并用85°C的溫水再次漂洗3次后烘干即可。經(jīng)檢測，加入本發(fā)明制得的蝸牛酶后，處理純棉紡織用品潤濕時間由原來的32s提升至12s，百度值Wr由原有的56提升至80，效果極其顯著。
【主權項】
1.一種從蛞蝓中提取蝸牛酶的方法，其特征在于具體提取步驟為: (1)用清水洗凈兩只重量均為30?40g新鮮活體野蛞蝓，將洗凈的蛞蝓放入燒杯中，向燒杯中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸鹽溶液，將燒杯中的物質(zhì)倒入高速組織搗碎機中，以8000?10000r/min的速度勻漿20?30min，充分粉碎得勻漿液，備用； (2)量取200?300mL去離子水加入到單口燒瓶中，向單口燒瓶中加入2?3gl-甲基-5-氯咪唑，移入冰水浴中，控制溫度為O?5°C，邊攪拌邊向燒瓶中加入100?200mL質(zhì)量濃度為40%六氟磷酸溶液，攪拌反應2?3h，自然冷卻至室溫，分液，得有機相，用飽和碳酸鈉洗滌有機相，直至有機相呈中性，再減壓蒸餾，得到無色液體，即咪唑鹽離子液體； (3)將上述咪唑鹽離子液體和I?2g磷酸氫二鉀加入到上述步驟(I)備用的勻漿液中，攪拌萃取40?50min，過濾，得濾液，將濾液靜置分層，去上層，得到含有蝸牛酶的離子液體； (4)向上述含有蝸牛酶的離子液體中加入300?400mLpH7.4?7.6磷酸鹽溶液，攪拌50?60min，靜置分層，分液得到含有蝸牛酶的磷酸鹽溶液，即粗酶液； (5)向上述粗酶液中加入3?5g硫酸錢，攪拌10?20min，于O?4°C冰箱內(nèi)，靜置5?6h，用4000?6000r/min離心機離心10?20min，得沉淀，將沉淀加入到盛有100?200mLpH7.4?.7.6三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液的燒杯中，攪拌10?20min后，裝入透析袋中用去離子水透析72?74h，將保留液置于濃縮罐中濃縮3?4h，得到蝸牛酶液； (6)將上述蝸牛酶液置于-10?-15°C真空冷凍干燥器內(nèi)，凍干24?26h，得到白色粉末，即蝸牛酶。
【文檔編號】C12N9/00GK105936894SQ201610477420
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】董曉, 張明, 孟浩影
【申請人】董曉