一株能耐受高砷銻污染并氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS-1菌株及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株既能耐受高砷銻污染又能氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS?1菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)；郵編430072，保藏日期為2016年4月11日，保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M2016190；該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明分離篩選的菌株可以將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷，極大地降低了環(huán)境中砷的危害。本發(fā)明的AS?1菌株具有很強(qiáng)的氧化性和適應(yīng)性，在凈化砷污染方面能夠發(fā)揮重要作用。CCTCC NO：M201619020160411
【專利說明】
一株能耐受高砷銻污染并氧化As (m)的包西氏菌AS-1菌株及 其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種包西氏菌菌株，該菌株可耐受和凈化高砷銻污染，屬于微生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 砷是一種廣泛存在于自然界中的元素。長期暴露會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，例如皮膚病， 癌癥等。無機(jī)態(tài)的砷是砷元素毒性最大是形式，一般情況下土壤、水體、食物中都含有微量 砷。近期的研究發(fā)現(xiàn)，砷的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于先前的認(rèn)知，僅孟加拉國就有7700萬人口暴露在含 砷水中。盡管砷以各種形式存在于自然界中，但目前發(fā)現(xiàn)毒性最大的是水體中的亞砷酸鹽 (H 3As03)以及砷酸鹽(H3As〇4)。而三價(jià)砷的毒性比五價(jià)砷大100倍。
[0003] 銻的毒性和砷相似。三價(jià)銻化合物的毒性較五價(jià)銻強(qiáng)，吸入后會(huì)引起溶血和肝、腎 障礙、肺水腫。銻的毒性和砷相似。三價(jià)銻化合物的毒性較五價(jià)銻強(qiáng)，吸入后會(huì)引起溶血和 肝、腎障礙、肺水腫。世界衛(wèi)生組織規(guī)定:飲用水中銻含量不得超過5ug/L。我國的銻礦儲(chǔ)量 位居世界第一，銻產(chǎn)量約占世界總量的79.6%，很多地區(qū)由于銻礦開采受到嚴(yán)重污染。
[0004] 目前，針對砷銻污染已經(jīng)出現(xiàn)了一些治理方法，主要有以下幾種：一是化學(xué)方法， 比如化學(xué)沉淀，此法效果明顯，但存在二次污染；二是物理方法，比如物理吸附，此法費(fèi)用 高，不利于大范圍應(yīng)用;三是植物修復(fù)方法，將某些能利用砷的植物種植到污染位點(diǎn)，將砷 富集到植物體內(nèi)，再收集植物體并妥善處理，但此法不適應(yīng)處理大面積污染環(huán)境。三是微生 物氧化方法，隨著很多研究者分離篩選出具有氧化能力的菌種，微生物氧化的使用應(yīng)運(yùn)而 生，成為當(dāng)前熱點(diǎn)，但大部分菌株耐受濃度和氧化效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決了【背景技術(shù)】中的問題，提供了一種能耐受高砷銻污染并氧化AS(m)的 包西氏菌AS-1菌株，該菌株可耐受高濃度砷銻污染，并且能高效的將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷， 極大地降低了環(huán)境中砷的毒性并增強(qiáng)了砷的可吸附去除性，達(dá)到對環(huán)境凈化的效果。
[0006] 本發(fā)明人篩選到一株新型砷氧化菌，該菌株被命名為AS-1，屬一種包西氏菌 (Bosea sp. AS-1)，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)； 郵編430072,保藏日期為2016年4月11日，保藏編號(hào)為：CCTCC N0:M2016190;該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007] 由于三價(jià)砷比五價(jià)砷的毒性強(qiáng)100倍，而且三價(jià)砷不帶電荷、具有很強(qiáng)的移動(dòng)性， 不易被去除，對環(huán)境的危害更大;所以提供一種能夠針對性氧化處理三價(jià)砷的微生物是本 領(lǐng)域急需解決的問題。而本發(fā)明分離篩選的菌株可以將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷，極大地降低 了環(huán)境中砷的危害。本發(fā)明的AS-1菌株具有很強(qiáng)的氧化性和適應(yīng)性，在凈化砷污染方面能 夠發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0008] 圖1為Bosea sp.AS-1菌株在2mM/L砷濃度環(huán)境下的生長曲線圖及氧化率曲線圖；
[0009] 圖2為Bosea sp.AS-1菌株在5mM/L砷濃度環(huán)境下的生長曲線圖及氧化率曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局 限于以下實(shí)施例。
[0011] 菌株的篩選、分離和鑒定
[0012] 本實(shí)施例中從中國湖南省錫礦山砷污染的表層土壤，加一定濃度NaAs02進(jìn)行富集 培養(yǎng)，再對富集培養(yǎng)的土樣進(jìn)行稀釋并涂布含有一定濃度NaAs0 2的MMM固體培養(yǎng)基平板，培 養(yǎng)長出砷抗性菌，挑取不同形態(tài)的菌落劃線得單菌落，再接種到MMM液體培養(yǎng)基，用KMn〇4法 檢測出砷氧化菌，用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光（HPLC-HG-AFS)測As(m)和As (V )濃度，并計(jì)算氧化率。再對檢測出的砷氧化菌做16S核糖RNA基因（16S rDNA)、形態(tài)學(xué)等 相關(guān)鑒定工作，最終得到包西氏菌，該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013] 詳細(xì)技術(shù)步驟如下：
[0014] (1)樣品采取:2015年7月采取湖南省錫礦山尾礦壩滲濾水附近土壤。
[0015] (2)樣品富集：精確稱量100g于250ml滅菌錐形瓶中，加2.51111的50〇11^的似48〇 2置 30 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。
[0016] (3)砷抗性菌分離:精確稱量NaAs02富集土樣10g于裝有90ml無菌生理鹽水的錐形 瓶中，置于30°C搖床中振蕩0.5h。再依次取lml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至10- 3、10-4、 10-5，分別取〇. lml涂布到含5mM/L的MMM固體培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，置30°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天，長出的菌株為砷抗性菌，將平板置4°C冰箱中待用。MMM固體培養(yǎng)基 配方如下，1L 培養(yǎng)基包括：大量元素：7.568g Na2HP04.7H20，lg KH2P04，lg NH4C1， 0.3gMgS04 · 7H20;酵母提取物lg;微量元素5ml和維生素10ml;5mM As(m)，1.5%的瓊脂。 大量元素和瓊脂121°C高壓滅菌，其它過濾滅菌。
[0017] 1L微量元素包括：50g EDTA，22g ZnS04 · 7H20,5.54g CaC12,5.06g MnC12 · 4H20,4.99g FeS04 · 7H20,l.lg(NH4)6Mo7024 · 4H20,1.57g CuS04 · 5H20 andl.61g CoC12 · 7H20.
[0018] 1L維生素包括：0 · 002g b io t in，0 · 002g fo 1 i c ac i d，0 · 01 gpyr i doxine hydrochloride，0·005g nicotinic acid，0.005g pantothenic acid，0.0001g B12， 0.005g p-aminobenzoic acid?and 0.005g thioctic acid〇
[0019] (4)劃線分離:將步驟(3)中得到的砷抗性菌挑取不同菌落劃線，確保得到單菌落， 劃線用MMM培養(yǎng)基平板，待菌長出后放4 °C冰箱中待用并用甘油冷凍管保存三份于-80 °C冰 箱。
[0020] (5)砷氧化菌篩選:將步驟(4)中得到的砷抗性菌的菌落轉(zhuǎn)接到MMM液體培養(yǎng)基中， 砷濃度為5nM/L，置30°C搖床中振蕩培養(yǎng)，待菌長濃后用KMn〇4檢測其氧化性。方法如下，取 lml上述培養(yǎng)的MMM菌液到1.5ml離心管中，離心，取上清液到新的離心管中，再加入100μ1 0.01Μ ΚΜη〇4溶液，若ΚΜη〇4由粉紅色變?yōu)槌壬f明沒有氧化，若ΚΜη〇4仍為粉紅色說明發(fā)生 氧化(KMn〇4可以將NaAs〇2氧化為Na3As〇4，菌液中如存在NaAs〇2，則KMn〇4發(fā)生變色）。嫌疆液體 培養(yǎng)基配方同MMM固體培養(yǎng)基，只是不含瓊脂。
[0021] (6)砷氧化菌的分類鑒定:一是利用16S rDNA鑒定，即采用原核生物16S rDNA通用 引物27F(5 'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3 '）和1492R(5 'GGYTACCTTGTTACGACTT3 '）進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增其16S rDNA并測序，再與國際NCBI GenBank(www.ncbi .nlm.nih.gov)核苷酸數(shù)據(jù)庫對 比，核苷酸同源性為99%。鑒定為Shinella sp·;二是革蘭氏染色分析。Shinella sp.AS-1 菌學(xué)特征如下:桿狀;革蘭氏陰性;菌落呈圓形，中間凸起，呈乳白色，端生鞭毛，無芽孢。大 小約（0.5~1)μπι x(l .5~2)μπι。三是擴(kuò)增砷氧化酶基因一aoxB，采用引物M1-2F(5'_ CCACTTCTGCATCGTGGGNTGYGGNTA-3 '）和M3-2R(5 '-TGTCGTTGCCCCAGATGADNCCYTTYTC-3 '）進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，體系為25ul，其中Ex Taq 12.5ul，Ml-2F lul，M3-2R lul，RNA-free water 8 . 5u 1 , DNA 2ul〇 得至Ijl058-llllbp 的條帶，再與國際 NCBI GenBank (www.ncbi .nlm.nih.gov)核苷酸數(shù)據(jù)庫對比，核苷酸同源性為97%，確定為砷氧化酶基因。 上述aoxB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示所示。
[0022] (7)銻耐受檢測：由于該菌分離與高砷及銻污染土壤，進(jìn)一步檢測此株菌能否耐受 銻污染環(huán)境，通過在MMM培養(yǎng)基中添加酒石酸銻鉀(KSbC4H4〇7)發(fā)現(xiàn)，Bosea sp.AS-Ι至少可 耐受600mg/L 的 Sb(m)。
[0023]菌株的保藏：
[0024]該菌株可以在MMM固體或液體培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)，培養(yǎng)后可在4°C下短期保藏。若長 期保藏，可使用甘油冷凍管或冷凍干燥管保藏菌株比較合適。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)；郵編430072,保藏日期為2016年4月11日，保藏編 號(hào)為：CCTCC N0:M2016190。
[0025] 菌株的性能研究：
[0026] 下面給出本發(fā)明所提供的包西氏菌AS-1菌株的性能研究結(jié)果：
[0027] 1、菌株的生長曲線和三價(jià)砷氧化曲線
[0028]挑取菌株接種到lOmlMMM液體培養(yǎng)基，置30°C搖床中震蕩培養(yǎng)48h作為種子菌液用 于接種。此時(shí)細(xì)胞密度〇D6QQ為0.25，保存在4°C冰箱做種子菌液備用。以1 %的接種量吸取 lml菌液到新鮮lOOmlMMM培養(yǎng)基中，As濃度分別為2mM/L、5mM/L，，置30°C搖床中震蕩培養(yǎng)， 每隔2小時(shí)取一次樣，直至A S(m)完全氧化。取lml菌液用分光光度法測細(xì)胞密度(OD600)，以 不加菌株的培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn);將2mM/L的菌液稀釋2000倍(75yg/l)，5mM/L的菌液稀釋5000倍 (75yg/l)后取lml，用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光(HPLC-HG-AFS)測A S(m)和As (V)濃度。依次繪制生長曲線和氧化曲線圖，分別如圖1和圖2所示，圖1中：三價(jià)砷濃度為 2mM/L;X軸--時(shí)間，取樣間隔2h;左軸Y--溶液在600nm波長處的吸光度;右Y軸--三價(jià) 砷氧化率(As ( V )/As (總））；圖2中：三價(jià)砷濃度為5mM/L; X軸--時(shí)間，取樣間隔2h;左軸 Y--溶液在600nm波長處的吸光度;右Y軸--三價(jià)砷氧化率(As( V )/As(總））。
[0029 ] 2、檢測包西氏菌AS-1菌株的最大耐受砷濃度
[0030]檢測包西氏菌AS-1菌株的最大耐受砷濃度，將細(xì)菌分別接種到砷濃度分別為5mM/ L、8mM/L、12mM/L、15mM/L、20mM/L、30mM/L、40mM/L和50mM/L的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置30 °C 搖 床中震蕩培養(yǎng)，觀察到多大濃度后培養(yǎng)基不會(huì)渾濁。經(jīng)試驗(yàn)得到AS-1菌株的最大耐受砷濃 度為1100mg/L，證明本發(fā)明提供的AS-1菌株能夠耐受高濃度砷。
[0031] 3、檢測包西氏菌對三價(jià)銻的最大耐受濃度
[0032]檢測包西氏菌AS-1菌株的最大耐受銻濃度，將細(xì)菌分別接種到銻濃度分別為到三 價(jià)砷濃度分別為 1 ΟΟμΜ/L、200yM/L、500yM/L、800yM/L、ImM/L、2mM/L、3mM/L、4mM/L 和 5mM/L 的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置30°C搖床中震蕩培養(yǎng)，觀察到多大濃度后培養(yǎng)基不會(huì)渾濁。
[0033] 經(jīng)試驗(yàn)得到Bosea sp.AS-Ι至少可耐受濃度為600mg/L的三價(jià)鋪。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株既能耐受高砷銻污染又能氧化As(m)的包西氏菌(Bosea Sp.)AS-l菌株，該菌 株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)；郵編430072，保藏日期為 2016年4月11日，保藏編號(hào)為：CCTCC N0:M2016190,該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1 所示。2. 權(quán)利要求1所述包西氏菌AS-1菌株的用途，其特征在于：用于將無機(jī)三價(jià)砷氧化為無 機(jī)五價(jià)砷。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述包西氏菌AS-1菌株的用途，其特征在于:用于處理含砷廢水。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105936884SQ201610531399
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】魯小璐, 張旖寧, 王紅梅
【申請人】中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）