具有低溫降解多環(huán)芳烴功能的交替假單胞菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株具有低溫降解石油功能的交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp.QN?1，其保藏號為CGMCC No.11635。該菌株篩選自我國北方受石油污染的海域，可在低溫條件下降解石油，特別是可在0℃的極端環(huán)境降解石油中的萘。本發(fā)明的交替假單胞菌QN?1可應(yīng)用于海洋石油污染的生物修復(fù)工作，尤其可應(yīng)用于我國北方海域冬季(包括冰期)等低溫環(huán)境下萘的降解。CGMCC No.1163520151109
【專利說明】
具有低溫降解多環(huán)芳烴功能的交替假單胞菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株海洋低溫菌及其在海洋萘污染生物修復(fù)中 的應(yīng)用。所述菌株能在〇°C~15°C的低溫條件下降解石油烴，特別是具有在0°C的極端條件 下高效降解石油烴中萘的特點(diǎn)，可用于我國北方海域溢油污染和萘污染的生物修復(fù)工作。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著海洋運(yùn)輸業(yè)的高速發(fā)展和海洋開采業(yè)的快速崛起，海洋溢油事故日益頻發(fā)， 危害巨大。特別是低溫海域發(fā)生的溢油由于溫度低，使有機(jī)污染物持久存在，會對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài) 系統(tǒng)造成更大的危害。石油中多環(huán)芳烴(PAHs)具有廣泛的毒性、致癌性及致畸誘變作用，通 過生物累積及食物鏈的傳遞作用，會給海洋生物和人類健康帶來極大危害，已經(jīng)引起各國 學(xué)者的高度重視。雖然PAHs在原油中的含量僅占1%左右，但通常溢油總量較大，因此其中 PAHs的含量不容忽視。利用微生物修復(fù)海洋溢油具有成本低、效果好、對環(huán)境負(fù)面影響小、 無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因此日益受到人們的重視。環(huán)境溫度對石油的生物降解影響很大，而我 國北方海域冬季的海洋表面溫度較低，大約在2 °C左右，部分海域也會有結(jié)冰期。雖然目前 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些海洋石油烴低溫降解菌，但菌源主要來自極地環(huán)境，而且多是烷烴低溫降 解菌，PAHs低溫降解菌非常少。由于自然環(huán)境相當(dāng)復(fù)雜，外源菌的進(jìn)入會給本地生態(tài)環(huán)境帶 來諸多問題。為了避免引入大量外來菌種而造成海洋原有生態(tài)系統(tǒng)的破壞，進(jìn)行生物修復(fù) 時(shí)應(yīng)選用土著菌種。但是，目前我國關(guān)于海洋石油烴低溫降解菌的研究較少，特別是對海洋 PAHs低溫降解菌的研究成果更為匱乏。萘為常見的PAHs，本發(fā)明的內(nèi)容是提供一株篩選自 我國北方受污染海域的石油降解菌，該菌為交替假單胞菌，可在低溫條件下降解石油，特別 是可在0°C的極端環(huán)境下高效地降解萘。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一株在低溫條件下可降解石油 的海洋石油降解菌。該菌株篩選自我國北方受石油污染的海域，可在低溫條件下降解石油 中的多環(huán)芳烴，特別是可在〇°C的極端環(huán)境下高效地降解石油中的萘。
[0004] 本發(fā)明所提供的具有在低溫條件下降解多環(huán)芳烴功能的交替假單胞菌 (Pseudoalteromonas sp. )QN-1是從膠州灣海域篩選獲得的。2013年11月22,中石化輸油儲 運(yùn)公司濰坊分公司輸油管線破裂。事故發(fā)生后，部分原油沿著雨水管線進(jìn)入膠州灣，污染附 近海域。溢油發(fā)生一周后，取表層被原油污染的海水，經(jīng)過篩選得到Pseudoalteromonas sp.QN-1〇
[0005] 該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱:CGMCC，地址 為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101)保藏，保藏 號為CGMCC No. 11635，保藏日期為2015年11月09日。
[0006] 本發(fā)明的Pseudoalteromonas sp · QN-1 的特征如下：
[0007] (1)菌落特征:乳白、近似圓形、隆起、光滑、濕潤。
[0008] (2)遺傳學(xué)特征：16S rDNA分析，表明其屬于交替假單胞菌屬 (卩8611(1〇&]^61'01]10的8)。菌株？8611(1〇&]^61'01]1011&8 8。.(^-1的163抑嫩序列具體可見序列 表。
[0009] (3)萘降解性能特征：在0 °C的條件下，經(jīng)過3 0天的降解實(shí)驗(yàn)后，萘降解率可達(dá) 80.6%〇
[0010] 本發(fā)明還提供交替假單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)QN_l在低溫條件下降解石 油中的應(yīng)用，優(yōu)選地，該菌降解石油中的石油烴，更優(yōu)地該菌高效地降解萘。所述低溫條件 是指0°C~15°C，尤其是指0°C。本發(fā)明的交替假單胞菌QN-1可應(yīng)用于海洋石油污染的生物 修復(fù)中，尤其可應(yīng)用于低溫環(huán)境中。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 本發(fā)明的？8611(1〇31丨61'01]101^8 8口.(^-1是一株高效海洋低溫萘降解菌，即使是在0 °c的條件下還能保持較高的萘降解活力。
[0013] 本發(fā)明的菌株培養(yǎng)方法簡單，培養(yǎng)基原料易得。該菌株對萘降解能力強(qiáng)，對菲和蒽 等PAHs也具有一定降解能力，對石油中烷烴也具有一定降解能力，適用于海洋萘污染的生 物修復(fù)工作，也可為我國北方海域溢油(包括冰期溢油）的生物修復(fù)工作提供優(yōu)良的PAHs降 解菌。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。另外，下述實(shí)施例中，如無特殊說明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方 法，所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)試劑公司購買。
[0015] 下述實(shí)施例采用的培養(yǎng)基及其組成為如下：
[0016] MMC培養(yǎng)基為：NaCl 24g，NH4N03 1.0g，KCl 0.7g，KH2P〇4 2.0g，Na2HP〇43.0g， MgS〇4.7H20 7.0g，微量元素 CaCl2 0.02mg/L，F(xiàn)eCl3.6H20 0.5mg/L，CuS〇4〇.005mg/L， MnCl2.4H2〇 0.005mg/L，ZnS〇4.7H20 0.1mg/L，加去離子水至lL，pH 7.4;
[0017] 2216E液體培養(yǎng)基為：蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸高鐵0. lg，加去離子水至lOOOmL， pH值7.4~7.8;
[0018] 2216E瓊脂培養(yǎng)基為:蛋白胨5g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0. lg，瓊脂15g，加去離子水至 100〇1^，？田直7.4~7.8。
[0019] 實(shí)施例1菌株P(guān)seudoalteromonas sp · QN-1的分離與鑒定 [0020]菌株P(guān)seudoalteromonas sp.QN-Ι的分離
[0021] (1)樣品采集:膠州灣；
[0022] (2)富集馴化:于250mL三角瓶中加入100mL MMC培養(yǎng)液，120°C下滅菌15min。二氯 甲烷用0.22μπι孔徑的耐有機(jī)溶劑濾膜過濾除菌。稱取0.2g萘溶于20mL除菌后的二氯甲烷 中，然后轉(zhuǎn)入到已滅菌的l〇〇mL MMC培養(yǎng)液里，放于搖床上振蕩過夜使二氯甲烷揮發(fā)。待二 氯甲烷揮發(fā)后，加入海水樣品5mL，置入低溫生化培養(yǎng)箱，于120r/min、10 °C下振蕩培養(yǎng)30d， 然后從中取5mL培養(yǎng)液再次轉(zhuǎn)接:將5mL培養(yǎng)液加入到含有0.2g萘的100mL MMC培養(yǎng)液中（處 理方法同上），于120r/min條件下培養(yǎng)30d。每輪培養(yǎng)溫度降低1°C，直至0°C，并在0°C條件下 長期馴化。
[0023] (3)分離純化:將經(jīng)過富集馴化的微生物培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，并在2216E固體培 養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，〇°C培養(yǎng)直至長出清晰菌落。挑選生長良好的菌落，在已滅菌的2216E 固體培養(yǎng)基上分3個(gè)區(qū)域進(jìn)行劃線，置入生化培養(yǎng)箱，于0°C下培養(yǎng)。挑取3區(qū)具有生長優(yōu)勢 的單菌落，進(jìn)行二次劃線分離。如此反復(fù)多次劃線，直到分離出菌落單一的菌株，命名為菌 株QN-1〇
[0024] 2.菌株P(guān)seudoalteromonas sp.QN-Ι的鑒定
[0025] (1)菌落特征:乳白、近似圓形、隆起、光滑、濕潤。
[0026] (2)遺傳學(xué)特征：16S rDNA分析，表明其屬于交替假單胞菌屬 (Pseudoalteromonas)，被分類為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。該菌株已在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No . 11635，保藏日 期為2015年 11 月09日。16S rDNA序列如SEQ ID No.l。
[0027] 實(shí)施例2菌株P(guān)seudoalteromonas sp · QN-1 的發(fā)酵
[0028] 用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌苔至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養(yǎng)基的三角 瓶錐形中，低溫振蕩培養(yǎng)7(1(0°(：，12(^/1^11)，成為種子液；將種子液按10%體積比加入 2216E液體培養(yǎng)基中，0 °C下培養(yǎng)7天，獲得發(fā)酵液。
[0029] 實(shí)施例3在0°C條件下菌株P(guān)seudoalteromonas sp.QN-1萘降解率的測定
[0030] (1)降解菌種子液
[0031]用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌苔至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養(yǎng)基的三角 瓶錐形中，低溫振蕩培養(yǎng)7d(0°C，120r/min)。
[0032] (2)降解培養(yǎng)
[0033] 稱取0.2g萘溶于20mL已過濾滅菌的正己烷中，移至裝有100mL已滅菌的MMC液體培 養(yǎng)基的三角瓶錐形中，放置到振蕩器上振蕩直至正己烷揮發(fā)完全，按照10%的接種量接種 降解菌種子液，低溫振蕩培養(yǎng)30d(0°C，12〇 r/min)。以不接種降解菌的培養(yǎng)液作為空白組。 [0034] (3)萃取
[0035]降解培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)液中加入3mL 50%的硫酸溶液進(jìn)行酸化。將酸化后的培 養(yǎng)液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振蕩后靜置。液體明顯分層后把下層液體轉(zhuǎn)至三角瓶中，上層液離心后通過鋪滿無水硫 酸鈉的砂芯漏斗過濾除水后收集，進(jìn)行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上層液，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)，進(jìn)行氣相色譜分析。
[0036] (4)氣相色譜法測量
[0037] 氣相色譜儀實(shí)驗(yàn)條件:載氣N2流量25mL/min;H2流量30mL/min;汽化室溫度280 °C ; 毛細(xì)管色譜柱30(1)111\0.32((1)111111小10檢測器溫度300°(：;柱頭壓力145即&;進(jìn)樣量為14^ 進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。氣相色譜程序升溫條件:初始溫度60°C，每分鐘升溫20°C，在100°C 保留2min，然后每分鐘升溫20°C，在280°C保留5min。
[0038] 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用正己燒做為溶劑，分別配制50ppm、100ppm、200ppm、300ppm、 400ppm、500ppm的萘標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜分析，以萘濃度為橫坐標(biāo)，峰面積 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039]將空白組和實(shí)驗(yàn)組的萘溶液進(jìn)行氣相色譜分析，得到出峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可 得萘濃度。
[0040] (5)結(jié)果
[0041 ] 萘降解率的計(jì)算:降解率D = (Co-&) /Co X 100 %
[0042]式中Co:空白瓶(不加菌）中萘的濃度;&:實(shí)驗(yàn)瓶(加菌）中萘的濃度。
[0043]計(jì)算結(jié)果降解率為80.6%，說明在0°C條件下本發(fā)明的菌株對萘具有高效的降解 能力。
[0044] 實(shí)施例4菌株P(guān)seudoalteromonas sp · QN-1石油經(jīng)降解率的測定
[0045] (1)降解菌種子液
[0046] 0°C組：用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌苔至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養(yǎng)基 的三角瓶錐形中，低溫振蕩培養(yǎng)7d(0°C，120r/min)。
[0047] 15°C組：用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌苔至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養(yǎng)基 的三角瓶錐形中，低溫振蕩培養(yǎng)5d( 15°C，120r/min)。
[0048] (2)降解培養(yǎng)
[0049] 0°C組:稱取0.5g原油溶于20mL已過濾滅菌的正己烷中，移至裝有100mL已滅菌的 MMC液體培養(yǎng)基的三角瓶錐形中，放置到振蕩器上振蕩直至正己烷揮發(fā)完全，按照10%的接 種量接種菌株？8611(1〇31丨61'〇1]1〇1^3 8。.(^-1種子液，低溫振蕩培養(yǎng)60(1(0<€，1201'/111；[11)。以 不接種降解菌的培養(yǎng)液作為空白組。
[0050] 15°C組:稱取0.5g原油溶于20mL已過濾滅菌的正己烷中，移至裝有100mL已滅菌的 MMC液體培養(yǎng)基的三角瓶錐形中，放置到振蕩器上振蕩直至正己烷揮發(fā)完全，按照10%的接 種量接種菌株?8611(1〇31丨61'〇1]1〇1^3 3。.(^-1種子液，低溫振蕩培養(yǎng)60(1(15<€，1201'/111；[11)。以 不接種降解菌的培養(yǎng)液作為空白組。
[0051 ] (3)萃取
[0052]降解培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)液中加入3mL 50%的硫酸溶液進(jìn)行酸化。將酸化后的培 養(yǎng)液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振蕩后靜置。液體明顯分層后把下層液體轉(zhuǎn)至三角瓶中，上層液離心后通過鋪滿無水硫 酸鈉的砂芯漏斗過濾除水后收集，進(jìn)行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上層液。
[0053] (4)原油標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
[0054] 稱取O.lg油樣品溶于正己烷中，移至100ml的容量瓶中，定容得到濃度為l.OOmg/ ml的油標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。移取5ml油標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于50ml容量瓶中，用正己烷定容，得到濃度 為0. lmg/ml油標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別移取一定量的0. lmg/ml油標(biāo)準(zhǔn)使用液于25ml容量瓶中，用 正己烷定容，得到一系列已知濃度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm處測其吸光度。 以油濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0055] (5)吸光度測量
[0056]采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測量。在227nm的波長下，以正己烷的吸光度為參比，用 10mm石英比色皿測萃取液吸光度。若吸光值超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則對萃取液按照1/10的比 例逐級稀釋。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出其相應(yīng)的濃度。
[0057] (6)結(jié)果
[0058] 降解率的計(jì)算:降解率D = (Co-Ci) /Co X 100 %
[0059]式中Co:空白瓶(不加菌）中原油的濃度;&:實(shí)驗(yàn)瓶(加菌）中原油的濃度。
[0060] 計(jì)算結(jié)果為在0°C和15°C條件下，石油烴降解率分別為21 %和40%。說明在低溫條 件下本發(fā)明的菌株對石油烴具有一定的降解能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株在海洋環(huán)境中具有低溫降解多環(huán)芳經(jīng)功能的交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp .QN-I，其保藏號為CGMCC No .11635。2. 如權(quán)利要求1所述的交替假單胞菌QN-I在低溫條件下降解石油中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述交替假單胞菌QN-I降解多環(huán)芳烴。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述交替假單胞菌QN-I降解萘。5. 根據(jù)權(quán)利要求2~4的任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述低溫條件為(TC~15°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求2~4的任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述降解石油的環(huán)境為海洋 環(huán)境。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述低溫條件為(TC。
【文檔編號】C02F3/34GK105907677SQ201610290987
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】郭平, 林建國, 曹賓霞
【申請人】大連海事大學(xué)