具有增強(qiáng)的光合作用的植物及其生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】公開(kāi)了具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物是用編碼異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)基因多核苷酸轉(zhuǎn)化的。所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體可以來(lái)自藻類(lèi)或藍(lán)藻細(xì)菌物種。所述轉(zhuǎn)基因多核苷酸包含在功能性植物啟動(dòng)子的控制下編碼所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列并可選地包括與所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體異源的葉綠體被膜靶向肽。公開(kāi)了形成轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因多核苷酸的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有増強(qiáng)的光合作用的植物及其生產(chǎn)方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的引證
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年12月31日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/922,141的優(yōu)先權(quán)，將其公開(kāi) 內(nèi)容通過(guò)引證整體結(jié)合于此。
[0003] 政府支持聲明
[0004] 本發(fā)明是部分W來(lái)自美國(guó)能源部的政府支持完成的。政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán) 利。
[0005] 序列表
[0006] 通過(guò)引證結(jié)合在于此的序列表是作為ASCII文本文件W電子形式提交的，創(chuàng)建于 12/30/13,優(yōu)先權(quán)信息更新于 12/23/2014,并且命名為"UMA0050PCT_sequence_ST25"。
技術(shù)領(lǐng)域
[0007] 本公開(kāi)設(shè)及使用碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)植物中的光合作用的方法W增強(qiáng)期望的作 物屬性的產(chǎn)量，包括生物質(zhì)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、種子中的油含量、淀粉含量或薦糖含量。此外， 運(yùn)些改變可W導(dǎo)致耐旱性增加。
【背景技術(shù)】
[000引作物生產(chǎn)力受限于許多因素，主要的因素是在光合作用過(guò)程中將光能量光化學(xué)轉(zhuǎn) 化為固定碳的相對(duì)低效率。該低效率的主要促成原因是通過(guò)生產(chǎn)性光和路徑固定C02和在 非生產(chǎn)性的光呼吸路徑中固定02的酶，核酬糖-1,5-二憐酸簇化酶/加氧酶(rubisco)的雙 重特異t生。（Whitney SM,Houtz RL,&Alonso H(2011)Adv曰ncin邑 our underst曰ndin邑曰nd capacity to engineer nature's CO2-sequestering enzyme,Rubisco.Plant Physiol 155(1):27-35.)0
[0009] 植物中的C4和CAM代謝的進(jìn)化表明通過(guò)在rubisco處濃縮C〇2(即通過(guò)最小化光呼 吸作用)來(lái)增加生產(chǎn)性簇化酶活性與非生產(chǎn)性加氧酶的活性的比率顯著地增加植物物種的 環(huán)境范圍和生物質(zhì)產(chǎn)量，最高達(dá)50% (Peterhansel C(2011)Best practice procedures for the establishment of a C4cycle in transgenic CSplants.J Exp Bot 62(9): 3011-3019.)。不幸地是，運(yùn)些復(fù)雜的新陳代謝策略不會(huì)容易地轉(zhuǎn)變?yōu)楦毡榈腃3作物種 類(lèi)，因?yàn)樗鼈円蕾?lài)于不同的，細(xì)胞特異的葉綠體類(lèi)型的詳細(xì)解剖結(jié)構(gòu)（例如C4代謝中的 Kranz解剖學(xué))和生物起源(Peterhansel 2011)。增加光合效率的可替代策略為使用誘變策 略W增加作物物種中rubisco的簇化酶/加氧酶活性的比率。不幸地是，改變r(jià)ubisco的酶性 質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)運(yùn)些目標(biāo)是有挑戰(zhàn)性的（Taniguchi Y,et al.(2008)0ve;rp;roduction of C4photosynthetic enzymes in transgenic rice pi曰nts:曰n approach to introduce the C4-like photosynthetic pathway into rice.J Exp Bot 59(7):1799-1809， Hibberd JM&Covshoff S(2010)The regulation of gene expression required for C4photosynthesis.Annu Rev Plant Biol 61:181-207.)。
[0010] 基于植物種子油的液體運(yùn)輸燃料(例如生物柴油和綠色柴油)作為環(huán)境、經(jīng)濟(jì)和技 術(shù)上可實(shí)行的石油來(lái)源燃料的替代物具有極大的潛力。植物種子油相比當(dāng)前使用的作為燃 料源的源自玉米或甘薦的乙醇具有明顯的優(yōu)勢(shì)。植物油可W直接用現(xiàn)有技術(shù)轉(zhuǎn)化為燃料， 并且因此可W在幾十年內(nèi)替代很大部分的基于石油的燃料。源自種子油的生物燃料是最小 碳中性的。每年用由等量的固定C〇2組成的作物替代作為燃料消耗的生物質(zhì)，并且由于較低 的硫和氮含量，來(lái)自生物燃料的排放是比柴油更清潔的。各種的含油種子作物是美國(guó)農(nóng)業(yè) 的支柱，因此增加運(yùn)些作物的耕作與現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)實(shí)踐是很大程度上相適合的。
[0011] 基于生物油的生物燃料目前在美國(guó)代表相對(duì)小部分的可再生能源市場(chǎng)，在2001年 占5.1%的高速公路柴油市場(chǎng)并且在2015年僅計(jì)劃達(dá)到6.8% (Tyson TK，Bozell J， Wallace R,Petersen E,&Moens L(2004)Biomass oil analysis:research needs and recommendations,National Renewable Energy Laboratory Technical Report,NREL/ TP-510-34796)。在美國(guó)目前的生產(chǎn)依賴(lài)于由食物油生產(chǎn)的傳統(tǒng)方法繁育的作物物種(例如 大豆、葵花和油菜巧），并且因此如生物柴油的燃料主要是由食品工業(yè)的廢產(chǎn)物生成的 (Tyson et al.2004)。因此，用于轉(zhuǎn)化為生物燃料的油的產(chǎn)量相對(duì)較低。增加來(lái)自糧食作物 的種子油直接轉(zhuǎn)換為燃料生產(chǎn)將直接與食物油生產(chǎn)相競(jìng)爭(zhēng)，從而對(duì)食物油價(jià)格和可獲得性 具有負(fù)面后果。增加生物油生產(chǎn)的第二個(gè)限制是油作物物種(大豆或油菜巧)相比其他用于 乙醇生產(chǎn)的商品作物（例如玉米或甘薦）較低的生產(chǎn)力（Johnston M,Foley JA Jolloway T,Kucharik C,Monfreda C(2009)Resetting global expectations from agricultural bio化els.化viron Res Lett 4(1))。因此，基于生物油的燃料的大量增加需要開(kāi)發(fā)具有較 低農(nóng)藝要求的，高生產(chǎn)力的專(zhuān)用含油種子作物。
[0012] 因此，存在對(duì)于具有增強(qiáng)的光合作用和/或作物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物及方法，W及用 于其中的增強(qiáng)植物中的光合作用和作物產(chǎn)量的組合物的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本文公開(kāi)了相比野生型植物，具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)基因植物。
[0014] 在實(shí)施方式中，該轉(zhuǎn)基因植物包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中該轉(zhuǎn)基因植物具有 比不包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相同種類(lèi)的野生型植物至少5%更高的C〇2同化速率。
[0015] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中該轉(zhuǎn)基因植物具有比 不包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相同種類(lèi)的野生型植物至少5%更低的降低的蒸騰速率 (tr曰nspir曰tion r曰te)。
[0016] 在實(shí)施方式中，用包含與編碼異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的多核巧酸可操作地連接的可 植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的重組DNA構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物。
[0017] 本文還公開(kāi)了用于增強(qiáng)植物中的光合作用的方法和組合物。
[0018] 在實(shí)施方式中，重組體多核巧酸包含與可植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接 的編碼異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列，其中編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列可選地進(jìn)一 步可操作地連接至編碼葉綠體被膜祀向膚的核酸序列。
[0019] 在實(shí)施方式中，生產(chǎn)具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)化植物的方法包括用公開(kāi)的重組體 多核巧酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；由該植物細(xì)胞生長(zhǎng)植物直至植物產(chǎn)生種子；W及由其中與未表達(dá) 異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相應(yīng)植物相比，光合作用增強(qiáng)的植物選擇種子。
[0020] 當(dāng)在W下部分中提供詳細(xì)說(shuō)明和實(shí)施例時(shí)，本發(fā)明的運(yùn)些和其他實(shí)施方式、優(yōu)勢(shì) 和特征將變得顯而易見(jiàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0021 ]現(xiàn)在參考附圖，其中，在多個(gè)附圖中，相同的元素編號(hào)相同：
[0022] 圖1示出了融合至藍(lán)藻細(xì)菌BicA碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(上部)或藍(lán)藻細(xì)菌SbtA碳酸氨鹽 轉(zhuǎn)運(yùn)體(下部）的atTic20轉(zhuǎn)運(yùn)膚（"atTic20TP" ;N端)和cMyc表位(C端）的示意圖。
[0023] 圖2示出了將或atTic20TP_BicA_cMyc體外引入分離的葉綠 體中。A.用于體外表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建體，縮寫(xiě)為BicA/SbtA T7(pUC18)，表示BicA或 SbtA存在于質(zhì)粒中。在圖中，"T7啟動(dòng)子"表示T7隧菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；"lacOr表示乳糖操縱 子操縱序列；并且"17終止子"表示T7隧菌體轉(zhuǎn)錄終止子。B.體外表達(dá)和葉綠體蛋白引入試 驗(yàn)的縮略流程圖。C.體外引入[ 35S]atTic20TP_BicA_cMyc融合蛋白的結(jié)果。用分離的葉綠體 在促進(jìn)蛋白質(zhì)引入的條件下溫育體外翻譯的蛋白質(zhì)（泳道1)。〇.體外引入[ 35S]atTic20TP_ SbtA_cMyc融合蛋白的結(jié)果。用分離的葉綠體在促進(jìn)蛋白質(zhì)引入的條件下溫育體外翻譯的 蛋白質(zhì)（泳道1)。蛋白質(zhì)與葉綠體結(jié)合，并且部分處理為其成熟形式(泳道2)。引入之后用嗜 熱菌蛋白酶處理葉綠體(泳道5-7)表明成熟形式已經(jīng)引入。葉綠體分級(jí)為膜和基質(zhì)部分表 明蛋白質(zhì)局部化至葉綠體膜(比較泳道3至4與6至7)。
[0024] 圖3示出了編碼克隆為雙運(yùn)載體(binary vector) ,pEarleyGate 100(右側(cè)）并且 用于亞麻莽的核轉(zhuǎn)化的 atTic20TP_BicA_cMyc、atTic20TP_SbtA_cMyc、CCPl_cMyc 或 LCIA_ CMyc的單基因構(gòu)建體的示意圖。在運(yùn)些圖中，"KanK"表示卡那霉素抗性基因；"LB"表示T-DNA(轉(zhuǎn)化DNA)左邊界序列；"BaK"表示BASTA抗性基因；"35S"表示35S花挪菜花葉病毒啟動(dòng) 子；"0CS"表示章魚(yú)堿合酶轉(zhuǎn)錄終止子;并且"RB"表示T-DNA右邊界序列。
[0025] 圖4示出了在分離的葉綠體中體外引入并局部化atTic20TP_SbtA_cMyCeA.將體外 翻譯的[35s]atTic20TP_SbtA_cMyc或[35s]atTic20TP_BicA_cMyc融合蛋白（泳道 1)與分離 的葉綠體在促進(jìn)蛋白質(zhì)引入(import)的條件下溫育。兩種蛋白質(zhì)與葉綠體結(jié)合并且處理為 它們的成熟形式(泳道2)并與葉綠體膜結(jié)合(泳道3)。葉綠體分級(jí)分離(fractionation)為 全部的膜（泳道3)、基質(zhì)（Shoma)(泳道4)、內(nèi)包膜（inner enveIope)(泳道5)和類(lèi)囊體膜 (泳道6)表明SbtA_cMyc或BicA_cMyc與內(nèi)包膜（泳道5)的初級(jí)結(jié)合（primary association)。在可靠的內(nèi)膜蛋白atTic20處分布無(wú)法分辨（第S子圖（panel))，然而 Rubisco的小亞基唯一地W基質(zhì)分離（第四子圖）。8.葉綠體部分中每種引入的蛋白質(zhì)相對(duì) 于總?cè)~綠體中發(fā)現(xiàn)的量的分布的定量分析確定B i C A_cMy C或Sb t A_cMy C在內(nèi)包膜中的局部 化。每種蛋白質(zhì)從左到右，部分為:總體、膜、基質(zhì)、內(nèi)包膜和類(lèi)囊體。
[0026] 圖 5 示出了 atTic20TP_SbtA_cMyc、atTic20TP_BicA_cMyc、CCPl_cMyc 和 LCIA_cMyc Tl轉(zhuǎn)化體的選擇。A.來(lái)自在用BASTA處理之前的±壤上發(fā)芽的轉(zhuǎn)化的亞麻莽的Tl種子的實(shí) 例。B.在用200mg/L的BASTA處理S次后的與A中相同的植物。BASTA抗性轉(zhuǎn)化體是顯而易見(jiàn) 的。C.移植的 BASTA 抗性品系的實(shí)例。D.代表性的 atTic20TP_SbtA_cMyc、atTic20TP_BicA_ cMyc、CCPl_cMyc和LCIA_cMyc Tl轉(zhuǎn)化體的基于PCR的基因分型(genotyping)表明轉(zhuǎn)基因的 存在。在野生型植物中沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因。將擴(kuò)增編碼肌動(dòng)蛋白的基因的引物用作PCR反應(yīng) 的對(duì)照。
[0027] 圖6示出了轉(zhuǎn)化的亞麻莽中CCPl_cMyc或LCIA_cMyc的表達(dá)。將來(lái)自五周的T1CCP1_ cMyc轉(zhuǎn)化體或TlLCIA_cMyc轉(zhuǎn)化體的葉提取物通過(guò)SDS-PAGE解析(resolve)并用抗cMyc免 疫印跡W檢測(cè)CCPl_cMyc(A)或LCIA_cMyc(B)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在每種構(gòu)建體的五個(gè)獨(dú)立的Tl 品系中而非在野生型提取物中W不同的表達(dá)水平檢測(cè)到預(yù)測(cè)的分子大小的蛋白質(zhì)。
[002引圖7示出了用抗cMyc抗體免疫印跡W檢巧化icA_cMyc(A)或SbtA_cMyc(B)的，來(lái)自 IOiig的魏豆葉綠體和5至30yg的亞麻莽葉綠體的總體(T)、膜(P)和可溶解的基質(zhì)（S)部分的 結(jié)果的照片。
[0029] 圖8示出了在表達(dá)CCPl_cMyc的亞麻莽T3純合品系中植物C〇2同化作用、氣孔下 (substomatal)C〇2濃度、氣孔導(dǎo)度（stoma1:al conductance)和蒸騰作用的圖。（A)在恒定的 400皿〇1/1112大氣0)2和恒定光照下的0)2同化作用。（8)4中的植物的氣孔下0)2濃度斯，（〇 來(lái)自A的C〇2同化作用與來(lái)自B的Ci的比率。（D)來(lái)自A的葉的氣孔導(dǎo)度。化)來(lái)自A的葉在恒定 的50%濕度下的蒸騰速率。誤差棒(error bar)代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0030] 圖9示出了當(dāng)水在7天期間內(nèi)保留時(shí)，37和50天的亞麻莽CCP1-20植物比較野生型 (野生型，wild type)的照片。
[0031] 圖10示出了在亞麻莽CCP1-20和野生型(對(duì)照)植物W250ml/天或175ml/天誘水的 限制條件下葉含水量的圖。誘水值對(duì)應(yīng)于田地值(field value)的典型范圍。符號(hào)**和*分 別表示在雙尾t測(cè)試中P = O. Ol和P = 0.0 5處的顯著性。
[0032] 圖11示出了代表性的CCPl亞麻莽品系在受限的水處理下C〇2同化速率(A)和種子 產(chǎn)量(B)的圖。種子產(chǎn)量量化為每株植物的種子重量。
[0033] 圖12示出了 CCP1-20和野生型（對(duì)照）植物在不同的氮肥施加下氮利用效率(A)和 碳/氮比率(B)的圖。
[0034] 圖13示出了在不同的氮下生長(zhǎng)的野生型(WT)亞麻莽和T3純合CCPl亞麻莽的A/Ci 曲線(xiàn)。（A)在標(biāo)明的不同的氮肥比率下生長(zhǎng)的亞麻莽品系CCP1-20和野生型植物的A/Ci (凈 0)2同化速率A相對(duì)于計(jì)算的氣孔下C〇2濃度Ci)曲線(xiàn)。（B)WT亞麻莽和兩種獨(dú)立的表達(dá)CCP1_ cMyc的純合CCPl_cMyc轉(zhuǎn)化品系的A/Ci曲線(xiàn)。對(duì)每個(gè)散點(diǎn)圖示出最佳匹配趨勢(shì)線(xiàn)。在插圖中 示出兩種品系中CCPl_cMyc的表達(dá)水平。
[0035] 圖14示出了來(lái)自在充足的氮的氮;標(biāo)記為"標(biāo)準(zhǔn)溫室條件"）或減少的氮 (1化pm的氮)下生長(zhǎng)的CCP1-20亞麻莽和野生型(對(duì)照)植物的種子產(chǎn)量的圖。種子產(chǎn)量測(cè)量 為每株植物的總種子重量。每個(gè)樣品代表平均最少10株植物。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤 差。
[0036] 圖15顯示了來(lái)自田地測(cè)試的CCPl亞麻莽品系相對(duì)于野生型（對(duì)照)植物的生物質(zhì) 產(chǎn)量數(shù)據(jù)。
[0037] 圖16顯示了來(lái)自田地測(cè)試的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體品系相對(duì)于野生型（對(duì)照）植物的種 子產(chǎn)量數(shù)據(jù)。
[0038] 圖17顯示了來(lái)自田地測(cè)試的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體品系相對(duì)于野生型（對(duì)照）植物的油 產(chǎn)量數(shù)據(jù)。符號(hào)*表示假設(shè)不等方差(unequal variance)的兩個(gè)樣品的t測(cè)試中P = 0.05處 的顯著性。
[0039] 圖18顯示了 BicA或SbtA亞麻莽T3純合品系和野生型(對(duì)照)植物中的植物C〇2同化 作用和內(nèi)部[C02]的圖。A.恒定的400皿ol/m 2大氣C〇2和恒定光照下的C〇2同化作用.B.轉(zhuǎn)基 因品系中的氣孔下C〇2 (Ci)。C. C〇2同化作用與Ci的比率。光照水平是600皿01 Hf 2S-I。植物在 2加侖花盆中生長(zhǎng)。在5周的植物上進(jìn)行測(cè)量。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。**和*分別表 示在雙尾t巧聯(lián)中P = O. Ol和P = 0.0 5處的顯著性。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本文公開(kāi)了包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)基因植物。已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)工程化 W包括外源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的植物示出了增強(qiáng)的碳光合捕獲/固定速率。表達(dá)外源碳酸氨 鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的植物展現(xiàn)出相對(duì)于野生型植物更高的C〇2同化速率。轉(zhuǎn)基因植物還示出增加的 水和氮利用率和生物質(zhì)生產(chǎn)的總體增加。公開(kāi)的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出通過(guò)工程化增加 C〇2在 rubisco的可用性來(lái)增加作物生產(chǎn)力的潛力。
[0041] 由于將來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌和其他生物體的C〇2濃縮機(jī)制的蛋白質(zhì)引入植物，轉(zhuǎn)基因植 物具有改善的通過(guò)光合作用固定碳的能力。例如，SbtA蛋白質(zhì)是藍(lán)藻細(xì)菌碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體， 其增加 C〇2可用性并適應(yīng)于較低的C〇2。因此增大光合作用的產(chǎn)量可W增加作物產(chǎn)量。此外， 除可用于植物生長(zhǎng)的固定碳的量增加之外，轉(zhuǎn)基因植物還可W導(dǎo)致增加的氮利用率和減少 的需水量。
[0042] 藍(lán)藻細(xì)菌和藻類(lèi)進(jìn)化出兩種替代的高效碳濃縮機(jī)制(CCM) W增加簇化酶/加氧酶 的活性（Price GD, et al.(2013)J Exp Bot 64(3) :753-768. ,Meyer M&Griffiths H (2013)J Exp Bot 64(3) :769-786.)。第一種使用高親合性的碳酸氨鹽膜轉(zhuǎn)運(yùn)體W增加細(xì) 胞的HC03-1。第二種策略在藍(lán)藻細(xì)菌中稱(chēng)為簇酶體并且藻類(lèi)中稱(chēng)為淀粉核的微室內(nèi)隔絕 rubisco與碳酸酢酶。肥化-由碳酸酢酶在微室中迅速轉(zhuǎn)化為CO2W顯著增加 rubisco處的C〇2 濃度，從而將碳同化增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0043] 近來(lái)的研究已經(jīng)模型化植物細(xì)胞的內(nèi)隔室內(nèi)的二氧化碳傳導(dǎo)。運(yùn)些研究表明葉綠 體被膜在細(xì)胞內(nèi)形成對(duì)C〇2擴(kuò)散有顯著抗性的阻隔化vans JR&Von Caemmerer 8(1996) Plant Physiol 110(2):339-:346.,Tholen D&Zhu XG(2011)Plant Physiol 156(1):90-105.)，由此限制葉綠體基質(zhì)中由rubisco固定碳的速率化vans&Von Caemmerer 1996; Price GD,Badger MR,&von Caemmerer S(2011)Plant Physiol 155(1):20-26.)。在葉綠 體被膜中引入來(lái)自微生物和藻類(lèi)CCM的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體具有減輕該擴(kuò)散阻隔的潛力。已經(jīng) 在藍(lán)藻細(xì)菌中確認(rèn)了多個(gè)確定的且提出的肥化-轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括化+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體（sympoder) (BicA和SbtA)、ATP驅(qū)動(dòng)的（BCTl)和NADPH驅(qū)動(dòng)的（NDHU)吸收系統(tǒng)(Price GD,Badger MR, Woodger FJ,化ong BM(2008)J Exp Bot 59(7):1441-1461.)0
[0044] 此外，響應(yīng)低CO2環(huán)境綠藻如萊茵衣藻表達(dá)誘導(dǎo)>1000倍的假定葉綠體H(XV轉(zhuǎn)運(yùn) 體。運(yùn)些包括局部化在葉綠體被膜的LCIA和CCP巧日CCP2(CCPl/2)轉(zhuǎn)運(yùn)體(Miura K，et al. (2004)PlantPhysioll35(3):1595-1607;ChenZY，Lavi即eLL，MasonCB，&Moron巧JV (1997)Plant I%ysiolll4(l) :265-273. ;Spalding MH&Jef打巧 M(1989)Plant Physiol89 (I) :133-137. KLCIA是促進(jìn)的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的甲酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的成員 (Mariscal V，et al.(2006)Protist 157(4) :421-433) eLCIA 在爪贍卵母細(xì)胞中的表達(dá)提 供了其用作低親合性碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的證據(jù)。也提出CCPl和CCP2用作碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。它 們局部化在衣藻中的葉綠體被膜并且與線(xiàn)粒體載體蛋白的家族相關(guān)，包括ADP/ATP易位體 (translocatorKMoroney JV&Mason CB(1991)&n J Bot 69(5):1017-1024. ;Ramazanov Z,Mason CE,Geraghty AM,Spalding MH,&Moroney JV(1993)Plant Physiol 101(4): 1195-1199. )dCCP1和CCP2是96%-致的。它們的基因位于包括多個(gè)編碼另外的CCM組分的 基因的基因簇內(nèi)（Merchant SS, et al.(2007)Science 318(5848) :245-250.)。
[0045] 已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中局部化至植物的葉綠體被膜的異源碳酸氨鹽 轉(zhuǎn)運(yùn)體(例如來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌或藻類(lèi))的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物中光合作用水平的顯著改善。
[0046] 本文公開(kāi)了具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)基因植物。
[0047] 在實(shí)施方式中，該轉(zhuǎn)基因植物包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植 物包含編碼與可植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接的異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的重組體 核酸序列，其中該核酸序列可選地進(jìn)一步編碼與異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體可操作地連接的葉綠 體被膜祀向膚。在實(shí)施方式中，用包含與編碼異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的多核巧酸可操作地連 接，和可選地與編碼葉綠體被膜祀向膚的多核巧酸可操作地連接的可植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 序列的重組DNA構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物。在運(yùn)些實(shí)施方式的任一個(gè)中，表達(dá)的異源碳酸氨 鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體局部化至葉綠體被膜。
[0048] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有比同樣種類(lèi)的野生型植物的C〇2同化速率至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C〇2 同化速率。在本文中野生型植物是指不包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的植物。
[0049] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有比同樣種類(lèi)的野生型植物的蒸騰速率至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%或至少25%更低的蒸騰速率。
[0050] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有比同樣種類(lèi)的野生型植物的種子產(chǎn)量至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40或至少50%更高的種子產(chǎn)量。
[0051] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有比同樣種類(lèi)的野生型植物的水利用率(W肥）至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的WUE。
[0052] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有比同樣種類(lèi)的野生型植物的氮利用率(N肥）至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的NUE。
[0053] 在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有比同樣種類(lèi)的野生型植物的成熟速率至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的成熟速率。
[0054] 在本文中，"碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體"蛋白質(zhì)是通過(guò)任何轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)碳酸氨鹽的蛋白 質(zhì)。碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的類(lèi)別包括陰離子交換體和Na7HC〇3-i協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[0055] 在任何公開(kāi)的實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體可W是來(lái)自藍(lán)藻菌的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn) 體，例如BicA多膚或SbtA多膚，或來(lái)自藻類(lèi)的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，例如CCPl多膚或LCIA多膚。 藍(lán)藻菌可W是集胞藻，例如集胞藻（Synechococ州S)PCC6803,或聚球藻（Synechococcus)， 例如聚球藻P(X700。藻類(lèi)可W是衣藻屬，例如萊茵衣藻。
[0056] 為本發(fā)明的目的，"植物"是指所有植物界的高等和低等植物的種和屬。該術(shù)語(yǔ)包 括成熟的植物、種子、芽和苗，W及部分、繁育材料、植物器官組織、原生質(zhì)體、愈傷組織和其 他培養(yǎng)物，例如源自他們的細(xì)胞培養(yǎng)物，W及所有其他給出功能或結(jié)構(gòu)單元的植物細(xì)胞的 組的種類(lèi)。成熟的植物是指處于任何超過(guò)苗的發(fā)育階段的植物。苗是指處于早期發(fā)育階段 的幼小、不成熟的植物。
[0057] "植物"包括所有一年生和多年生的單子葉或雙子葉植物并且包括(舉例來(lái)說(shuō)，但 不限于)南瓜屬、菩薇屬、葡萄屬、胡桃屬、草替屬、蓮屬、首猜屬、紅豆草屬、=葉草屬、胡盧 己屬、班豆屬、相枯屬、亞麻屬、天竺葵屬、木馨屬、胡蘿h屬、擬南芥屬、蕓苔屬、蘿h屬、芥子 屬、顛茄屬、辣椒屬、曼巧羅屬、賞窘屬、番茄屬、煙草屬、輪螺屬、矮牽牛屬、毛地黃屬、牛至 屬、菊宦屬、向日葵屬、窩宦屬、雀麥屬、天口冬屬、金魚(yú)草屬、宣草屬化eterocallis)、龍面 花屬(Nemesia)、天竺葵屬、泰屬(Panieum)、狼尾草屬、毛賞屬、千里光屬、蝴蝶花屬、黃瓜 屬、紫水晶屬(Browallia)、大豆屬、魏豆屬、菜豆屬、黑麥草屬、稻屬、玉蜀泰屬、燕麥屬、大 麥屬、黑麥屬、小麥屬、高梁屬、云杉屬和白楊屬的那些。
[0058] 優(yōu)選的植物是來(lái)自W下植物家族的那些:寬科、菊科(Asteraceae)、蕓苔科、石竹 科、襲科、菊科(Composi化e)、十字花科、葫蘆科、唇形科、豆科、蝶形花科、百合科、亞麻科、 錦葵科菩薇科、茜草科、虎耳草科、玄參科、茄科、梧桐科、番杏科、山茶科、傘形科。
[0059] 本發(fā)明可W特別有利地應(yīng)用與雙子葉植物生物體。優(yōu)選的雙子葉植物具體選自雙 子葉作物植物如，例如菊科(Asteraceae)如向日葵屬、萬(wàn)壽菊屬或金盞花屬及其他；菊科 (Compositae),具體地窩宦屬，非常具體地栽培屬(窩宦)及其他;十字花科，具體地蕓苔屬， 非常具體地油菜屬（油巧油菜）、蕓苔中（campestris)(甜菜）、oleracea CV Tastie(卷屯、 菜）、oleracea CV Sonwball W菜花）和oleracea CV Emperor(花挪菜）和其他甘藍(lán)類(lèi)；W 及擬南芥屬，非常具體地南芥屬(thaliana)，和水芹或卡諾拉(canola)及其他;葫蘆科如甜 瓜、南瓜(pumpkin)/南瓜（squash)或西葫蘆及其他;豆科，具體地大豆屬，非常具體地大豆 屬(max) (soybean)、黃豆，和首猜、魏豆、菜豆(bean)或花生及其他;茜草科，優(yōu)選地唇形亞 綱如，例如阿拉比卡咖啡（Coffea arabica)或大果咖啡（Coffea Iiberica)(咖啡樹(shù))及其 他;茄科，具體地番茄屬，非常具體地西紅柿(esculentum)屬（西紅柿（西紅柿））、茄屬，非常 具體地馬鈴馨（tuberosum)屬（馬鈴馨（potato))和茄子(melongena)(茄子(aubergine)) W 及辣椒屬，非常具體地辣椒(annuum)屬(辣椒(pepper))和煙草或紅辣椒及其他;梧桐科，優(yōu) 選地五啞果亞綱如，例如可可（Theobroma cacaoK可可樹(shù))及其他；山茶科，優(yōu)選地五啞果 亞綱如，例如野茶樹(shù)(Camellia sinensis)或茶樹(shù)(Thea sinensis)(茶樹(shù)（tea shrub))及 其他;傘形科，具體地胡蘿h屬(非常具體地胡蘿Kcarota)屬（胡蘿K胡蘿h))和芹屬（非常 具體地堇（graveolens dulce)(芹菜））及其他；W及亞麻巧、棉花、大麻、亞麻、黃瓜、渡菜、 胡蘿K糖甜菜和各種樹(shù)木、堅(jiān)果和葡萄藤屬，具體地香蕉和奇異果。
[0060] 還包括有觀賞植物，實(shí)用或觀賞樹(shù)木、花弁、插瓶花、灌木或草皮?？蒞提及的植物 為(舉例來(lái)說(shuō)但不限于)被子植物、苔薛植物如，例如苔類(lèi)(liver flower)和薛類(lèi)(苔薛）；藤 類(lèi)如羊齒、馬尾和石松;裸子植物如松柏類(lèi)、蘇鐵類(lèi)、銀杏和買(mǎi)麻騰(Gnetatae),菩薇科的家 族如玫瑰，石南科如杜酷花屬(rhododeiKlron)和杜酷花(azalea)，大戟科如一品紅和己豆， 石竹科如石竹花，茄科如矮牽?；ǎ嗷绿迫绶侵拮匣绿?，鳳仙花科如含羞草，蘭科如蘭 花，尊尾科如唐富蒲(gladioli)、尊尾花、小蒼蘭和番紅花，菊科如金盞花，牛兒苗科如天竺 葵，百合科如龍血樹(shù)(化acena)，?？迫鐭o(wú)花果，天南星科如龜背竹和許多其他。
[0061] 用于轉(zhuǎn)化特別感興趣的是油類(lèi)作物植物的植物。油類(lèi)作物植物被理解為是含油量 是自然地較高和/或其可W用于油類(lèi)的工業(yè)生產(chǎn)的植物。運(yùn)些植物可W具有高含油量和/或 特定的在工業(yè)上感興趣的脂肪酸成分。優(yōu)選的植物是具有至少按重量計(jì)1%的脂質(zhì)含量的 那些。油類(lèi)作物包括，舉例來(lái)說(shuō):玻璃宦(Borago Officinalis)(玻璃宦(borage));亞麻莽 屬(亞麻莽）；蕓苔屬如蕓苔、歐洲油菜(B.napus)、憲菁、埃塞俄比亞芥(B.carinataK芥末、 油巧油菜或憲菁油菜）；大麻（Cannabis sativa)(大麻（hemp));紅花（Carthamus t i nc tori us)(紅花（safflower));挪子（Co COS nucifera)(挪子（CO conut));海甘藍(lán) (化ambe abyssinicaK兩節(jié)莽）；專(zhuān)距花屬（產(chǎn)生中鏈長(zhǎng)度，特別是用于工業(yè)應(yīng)用的脂肪酸 的專(zhuān)距花屬物質(zhì)）；非洲油棟桐化Iaeis guinensis)(非洲油棟桐(A打ican oil palm));美 洲油棟桐（美洲油棟桐(American oil palm));大豆(Glycine max)(大豆（soybean));陸地 棉（美洲棉）；海島棉（埃及棉）；草本棉（亞洲棉）；向日葵化eIianthus anmms)(向日葵 (sunflower));亞麻（Linum usitatissimum)(亞麻半子或亞麻（flax));月見(jiàn)草（Oenothera biennis)(月見(jiàn)草（evening primrose));油橄攬（橄攬）；水稻（0;ryza sativa)(水稻 (rice));篇麻（Ricinus communis)(藍(lán)麻（castor));芝麻（Sesamum indicum)(芝麻 (sesame));小麥屬(小麥）；玉米屬(玉米），和各種堅(jiān)果屬諸如，例如胡桃或扁桃。
[0062] 亞麻莽屬，通常稱(chēng)為亞麻莽，是歐洲的地中海區(qū)域和亞洲當(dāng)?shù)氐?，并且看起?lái)特別 適應(yīng)于冷半干旱氣候區(qū)域(干草原和大草原）。亞麻莽屬在歷史上作為含油種子作物培養(yǎng)W 生產(chǎn)植物油和動(dòng)物飼料。其已經(jīng)引入加拿大的高原區(qū)域和美國(guó)的部分作為工業(yè)的含油種子 作物。由于其種子的高含油量(~35%)、其抗凍性、短生產(chǎn)周期(60-90天)和抗蟲(chóng)性，其是用 于增強(qiáng)光合作用W改善其作為生物燃料的生產(chǎn)來(lái)源的潛力的感興趣的目標(biāo)。
[0063] 本文還公開(kāi)了重組體多核巧酸，包含與可植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接 的編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列，其中編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列可選地進(jìn)一步可 操作地連接至編碼葉綠體被膜祀向膚的核酸序列。
[0064] 在一些實(shí)施方式中，編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列進(jìn)一步包含編碼表位標(biāo)記的 序列，W幫助表達(dá)的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的親合性捕獲或局部化。表位標(biāo)記是，其中將已知的表 位借助遺傳工程融合至重組體蛋白質(zhì)的技術(shù)。第一個(gè)可商購(gòu)的表位標(biāo)記最初是設(shè)計(jì)用于蛋 白質(zhì)純化的。此外，通過(guò)選擇可獲得對(duì)其的抗體的表位，該技術(shù)使得可W檢測(cè)不可獲得對(duì)其 的抗體的蛋白質(zhì)。表位標(biāo)記的另外的實(shí)例包括FLAG、6X化S、谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、HA、 cMyc、AcV5或串連親和純化表位標(biāo)記。
[0065] 可W由其獲得碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的種類(lèi)的實(shí)例包括東方曲殼藻、阿格藻屬、透 明雖形藻（Amphiprora hyaline)、咖啡形雙眉藻、咖啡形雙眉藻線(xiàn)型變屬（Amphora coffeiformis var.linea)、咖啡形雙眉藻點(diǎn)狀變屬（Amphora coffeiformis var .punc1:a1:a)、咖啡形雙眉藻盾狀變屬（Amphora coffeiformis var. taylori)、咖啡形雙 眉藻薄狀變屬(Am地ora coffeiformis var.tenuis)、優(yōu)美雙眉藻、優(yōu)美雙眉藻頭狀變屬 (八111口110^(1日1；[。日1：133；[1]1日￥日1'.。日9；[1日1：日）、雙眉藻屬、魚(yú)腥藻、纖維藻、鑲型纖維藻、布朗尼 葡萄藻、包特氏菌屬、叢粒藻、葡萄藻（BotiTococcus sudeticus)、片球藻、Bracteococ州S medionuc Ieatus、四鞭藻、纖細(xì)角毛藻、牟勒氏角毛藻、牟勒氏角毛藻廣鹽變屬 (畑aetoceros muelleri var.subsalsum)、角毛藻屬、具孔衣藻、小球藻（畑lore Ila 曰nitr曰t曰）、小球藻（Chlorell曰曰nt曰rctic曰）、小球藻（Chlorell曰曰ureoviridis)、小球藻 (加 Iorella Candida)、小球藻（加 Iorella capsulate)、干枯小球藻（加 lore Ila desiccate)、楠圓小球藻、浮水小球藻、融合小球藻（畑IorelIa fuse a)、小球藻變屬 (畑Iorella fusca var.vacuolata)、小球藻（畑Iorella glucotropha)、水溪小球藻 (Chlorella infusionum)、水溪小球藻海岸變屬（Chlorella infusionum var.actophila)、7jC溪小球藻變屬（Chlorella infusionum var.auxenophila)、小球藻 (Chlorella kessleri)、小球藻（Chlorella lobophora)、小球藻（Chlorella luteoviridis)、小球藻變屬（Chlorella Iuteoviridis var.aureoviridis)、小球藻變屬 (Chlorella luteoviridis var. lutescens)、小球藻（Chlorella miniata)、小球藻 (Ch Iorella minutissima)、小球藻（Chlorella mu tabilis)、小球藻（Chlorella nocturna)、小球藻（化Iorella ovalis)、小球藻（Qilorella parva)、嗜光小球藻、小球藻 (Chlorella pringsheimii)、原始小球藻、原始小球藻酸居變屬、規(guī)則小球藻、規(guī)則小球藻 極小變屬、規(guī)則小球藻變屬（化lore Ila regular is var .umbricata)、小球藻（Qilore Ila re isiglii)、嗜糖小球藻、海洋小球藻楠圓變屬、海水小球藻、單純小球藻、耐熱性小球藻、 小球藻屬、球抱小球藻、小球藻(ChlorelIa Stigmatophora)、萬(wàn)尼氏小球藻、普通小球藻、 小球藻(化IorelIa vulgaris fo.T&rtia)、普通小球藻自養(yǎng)變屬、普通小球藻綠色變屬、普 通小球藻普通變屬、普通小球藻變屬（Qilorella vulgaris var.vulgaris fo.Te;rtia)、普 通小球藻變屬（畑Iorella vulgaris var.vulgaris fo.Viridis)、小球藻（化Iorella xanthella)、小球藻（Chlorella zofingiensis)、小球藻（Chlorella trebouxioides)、普 通小球藻、水溪綠球藻、綠球藻屬、綠梭藻、藍(lán)隱藻、金球藻屬、卡氏球巧板藻屬、隱甲藻、隱 藻屬、隱秘小環(huán)藻、梅尼小環(huán)藻、小環(huán)藻屬、衣藻（化1日1117(101]1〇]1日8 1]1〇6?〇13；[；0、萊茵衣藻、衣 藻屬、杜氏藻屬、杜氏藻化unaliella bardawil)、杜氏藻(Dunaliella biocula1:a)、顆粒杜 氏藻(DunalielIa granulate)、海生杜氏藻、微小杜氏藻、己夫杜氏藻、杜氏藻(DunalielIa pei;rcei)、杜氏藻化unaliellap;rimolecta)、鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina)、陸生杜氏 藻（DunalielIa terricola)、杜氏藻（DunalielIa tertiolecta)、綠色杜氏藻、杜氏藻 (Dunaliella tertiolecta)、綠色獨(dú)球藻、獨(dú)球藻屬、后棘藻屬、裸藻屬、披刺藻屬、克羅脆 桿藻、脆桿藻屬、藍(lán)股藻屬、絲藻屬、雨生紅球藻、膜胞藻屬、等鞭金藻（Isochry sis aff .Galbana)、等鞭金藻（Isockrysis ga化ana)、麟孔藻、微星藻、微星藻、微小單針藻、單 針藻屬、保囊菌屬、鹽生微綠球藻、微綠球藻、截形舟形藻、舟形藻（Navicula biskanterae)、舟形藻（Navicula pseudotenelloides)、具膜舟形藻（Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻、舟形藻屬、腎鞭藻屬、腎鞭藻屬、普通菱形藻、亞歷山大菱形藻、 新月菱形藻、普通菱形藻、細(xì)端菱形藻、碎片菱形藻、漢氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、 小頭菱形藻、微小菱形藻、楠圓微小菱形藻(NitzscMa pusilla elliptica)、微小菱形藻 (Nitzschia pusilla monoensis)、四邊微小菱形藻（Nitzschia quadrangular)、菱形藻 屬、掠鞭藻屬、小卵囊藻、卵泡藻、卵囊藻屬、沼澤顫藻、顫藻屬、亞短顫藻(顫藻SiAbrevis)、 類(lèi)小球藻(ParachlorelIa kessleri)、嗜酸鹽藻(Pascheria acidophila)、己夫藻屬、S角 褐指藻、隧菌體、席藻屬、扁藻屬、顆石藻（Pleurochrysis carter ae)、顆石藻 (Pleurochiysis dentate)、顆石藻屬(Pleurochrysis sp.)、威克海姆原壁藻(Prototheca wickerh am ii)、原壁藻（Prototheca stagnora)、波多黎各原壁藻（Prototheca portoricensis)、原壁藻(Prototheca moriformis)、饒氏原壁藻(Prototheca zopf ii)、7jC 生假小球藻（Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻（Pyramimonas sp.)、桑甚藻、不透明紅 球菌、綠球藻（Sarcinoid chrysophyte)、被甲柵藻、裂殖壺菌、水棉、純頂螺旋藻、裂絲藻 屬、集球藻屬、集胞藻、萬(wàn)壽菊、孔雀草、四角藻、四片藻屬、瑞典四片藻、威氏海鏈藻W及鮮 綠球藻(Viridiella fridericiana) 0
[0066]在一些實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自藍(lán)藻菌并且編碼藍(lán)藻細(xì)菌碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn) 體的核酸序列進(jìn)一步包含編碼與碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列可操作地連接的葉綠體被膜祀 向膚的序列。藍(lán)藻菌的實(shí)例包括集胞藻屬，例如集胞藻屬PCC6803和聚球藻屬，例如聚球藻 P(X7002。在本文中"葉綠體被膜祀向膚"是指當(dāng)嵌合體蛋白表達(dá)自核基因組時(shí)，可W祀向包 括該膚的嵌合體蛋白至葉綠體被膜，如葉綠體內(nèi)包膜的膚序列。適合的葉綠體被膜祀向膚 的實(shí)例包括葉綠體被膜膜蛋白的前體的轉(zhuǎn)運(yùn)膚，例如擬南芥atTic20前體（Uniprot Q8GZ79,版本52;NP_171986.3)的轉(zhuǎn)運(yùn)膚(aa 1-110);葉綠體丙糖憐酸醋/憐酸醋易位體前 體的轉(zhuǎn)運(yùn)膚，例如魏豆葉綠體憐酸丙糖醋/憐酸醋易位體前體化niprot P21727,版本73)的 轉(zhuǎn)運(yùn)膚(aa 1-72);擬南芥白化屬或淺綠突變型1蛋白（GenBank登錄號(hào)BAB62076.1的氨基酸 1-51)的轉(zhuǎn)運(yùn)膚，或萊茵衣藻CCPl前體或LCIA前體的轉(zhuǎn)運(yùn)膚。
[0067] 藍(lán)藻細(xì)菌碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體可W是依賴(lài)化+的肥03-轉(zhuǎn)運(yùn)體，例如BicA多膚或SbtA多 膚。BicA在海洋藍(lán)藻細(xì)菌的基因組中廣泛表現(xiàn)并且屬于許多細(xì)菌中的目前注釋為硫酸鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體或透性酶的真核和原核轉(zhuǎn)運(yùn)體的大家族(SulP家族）。
[0068] 在一些實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自藻類(lèi)。藻類(lèi)可W是衣藻屬或任何下表1和 2中列舉的藻類(lèi)。衣藻屬可W是，例如萊茵衣藻。藻類(lèi)碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體可W是CCPl多膚或 LCIA多膚.
[0069] 在實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體包含集胞藻屬PCC6803的SbtA基因（核巧酸序列， 沈Q ID NO: 1，登錄號(hào)NC_000911.1，區(qū)域：1600659.. 1601783 ;GI: 16329170;多膚序列，SEQ ID ^:2，登錄號(hào)郵_441：340.1)。
[0070] 在實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體包含聚球藻屬PCC7002的BicA基因（核巧酸序列， 沈QIDN0:3，登錄號(hào)NC_010475.1，區(qū)域：2452833..2454533);多膚序列，SEQIDN0:4，登 錄號(hào) YP_001735604.1)。
[0071] 在實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體包含萊茵衣藻的CCPl基因（核巧酸序列，SEQ ID N0:5,登錄號(hào)XM_001692145.1的編碼序列）；多膚序列，SEQ ID N0:6,登錄號(hào)XP_ 001692197.Do
[0072] 在實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體包含萊茵衣藻的LCIA蛋白基因（核巧酸序列，SEQ ID N0:7,登錄號(hào)XM_001691161.1的編碼序列）；多膚序列，SEQ ID N0:8,登錄號(hào)XP_ 001691213.Do
[0073] 只要碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體具有碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體包括與SbtA、 BicAXCPl或LCIA同源的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。"同源物"是用于本領(lǐng)域的統(tǒng)稱(chēng)術(shù)語(yǔ)，表示擁有與 對(duì)象序列高度的序列相關(guān)性的多核巧酸或多膚序列。運(yùn)種相關(guān)性可W通過(guò)確定比較的序列 之間一致性和/或相似性的程度來(lái)量化。落在該統(tǒng)稱(chēng)術(shù)語(yǔ)內(nèi)的是術(shù)語(yǔ)"直系同源物 (odholog)"，意指是另一物種的多核巧酸或多膚的功能等效物的多核巧酸或多膚，W及 "橫向同源物(paralog)"，意指當(dāng)認(rèn)為在相同的物種內(nèi)時(shí)，功能上類(lèi)似的序列。存在于相同 的物種中的橫向同源物或其他物種中的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的直系同源物可W通過(guò)在本 領(lǐng)域中眾所周知的分子生物技術(shù)，不用過(guò)度的實(shí)驗(yàn)而容易地識(shí)別。如在本文中使用的SbtA、 BicA、CCPl或LCIA分別指訊tA、BicA、CCPl或LCIAW及它們的同源物和直系同源物。
[0074] 具有與萊茵衣藻CCP1、萊茵衣藻LCIA、聚球藻屬PCC7002BicA或集胞藻屬 PCC6803SbtA顯著的相似性，適用于實(shí)施公開(kāi)的方法W生成具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)基因 植物的已知的編碼序列和/或蛋白質(zhì)序列在下表1-4中列出。對(duì)于萊茵衣藻CCPl或萊茵衣藻 LCIA，運(yùn)些編碼序列和蛋白質(zhì)序列是通過(guò)用適當(dāng)?shù)牟樵?xún)序列的GenBank的tBLASTN捜索確定 的，如表1-2中所示。表1-2中僅示出具有<E-10的E值的序列。對(duì)于聚球藻屬PCC7002BicA或 集胞藻屬PCC6803SbtA，蛋白質(zhì)序列是通過(guò)用適當(dāng)?shù)牟樵?xún)序列的GenBank的BLASTP捜索確定 的，如表3-4所示。在表3和4中僅分別示出具有與聚球藻屬PCC7002BicA或集胞藻屬 PCC6803訊tA>60%的氨基酸序列一致性的序列。
[0075] 表1.使用萊茵衣藻CCPl蛋白的登錄號(hào)XM_001692145由GenBank的tBLASTN捜索確 定的示出與萊茵衣藻CCPl顯著的相似性的DNA和蛋白質(zhì)序列。 「nn7Al






















[0116]
[0117] 如在本文中使用的兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的"百分比同源度"是使用 Karlin and Altschul(1990)Proc.化tl.Acad.Sci. ,U.S.A.87:2264-2268的算法確定的。 運(yùn)樣的算法被結(jié)合在Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol. 215:403-410的NBLAST和XBLAST 程序中。用NBLAST程序，分?jǐn)?shù)=100，字長(zhǎng)12進(jìn)行BLAST核巧酸捜索W獲得與本發(fā)明的核酸分 子同源的核巧酸序列。用XBLAST程序，分?jǐn)?shù)= 50,字長(zhǎng)=3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)捜索W獲得與參 照多膚(例如SEQ ID N0:5)同源的氨基酸序列。為獲得間隙比對(duì)(gapped alig皿ent)用于 比較目的，如在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的利用 間隙化AST(gapped BLAST)。當(dāng)利用化AST和間隙化AST程序時(shí)，通常使用默認(rèn)參數(shù)（見(jiàn) http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0118] 此外，包括基本與編碼SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚的多核巧酸相同的多核巧酸。 "基本上相同"是指具有與參照氨基酸或核酸序列的序列至少約85%，具體地約90%，并且 更具體地約95%或更多相同的序列的多膚或多核巧酸。對(duì)于多膚，參照多膚序列的長(zhǎng)度通 常為至少約16氨基酸，或具體地至少約20氨基酸，更具體地至少約25氨基酸，并且最具體地 至少約35氨基酸。對(duì)于核酸，參照核酸序列的長(zhǎng)度通常為至少約50核巧酸，具體地至少約60 核巧酸，更具體地至少約75核巧酸，并且最具體地至少約110核巧酸。
[0119] 通常，可W通過(guò)雜交確認(rèn)同源序列，其中雜交處于嚴(yán)格的條件下。使用嚴(yán)格雜交 (即洗涂核酸片段兩次，其中每次洗涂為用2X氯化鋼和巧樣酸鋼(SCC緩沖液；1.150mM氯化 鋼和15mM巧樣酸鋼，pH 7.0)和0.1 %十二烷基硫酸鋼(SDS)在室溫下30分鐘，隨后在50°C下 用2X SCC和0.1 %SDS洗涂一次30分鐘;并且然后洗涂?jī)纱危渲忻看蜗赐繛橛?XSCC在室溫 下10分鐘），可W確定包含最多約25至約30%的堿基對(duì)錯(cuò)配，或約15至約25%的堿基對(duì)錯(cuò) 配，或約5至約15 %的堿基對(duì)錯(cuò)配的同源序列。
[0120] 編碼SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚序列的多核巧酸允許制備具有特異地雜交至運(yùn) 種基因序列的能力的相對(duì)短的DNA(或RNA)序列。較短的核酸序列可W用作在給定的樣品中 檢測(cè)互補(bǔ)序列的存在的探針，或可W用作引物W檢測(cè)、擴(kuò)增或突變編碼SbtA、BicA、CCPl或 LCIA多膚的DNA序列的限定片段。用于雜交研究的核酸序列長(zhǎng)度可W大于或等于約14核巧 酸W保證片段有足夠長(zhǎng)度形成穩(wěn)定的和選擇性的雙鏈分子。例如，通過(guò)直接由化學(xué)方法合 成片段，通過(guò)應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)，如PCR技術(shù)，或通過(guò)由含有適當(dāng)?shù)牟迦胛锖瓦m合的限制位 點(diǎn)的重組質(zhì)粒剪切選定的核酸片段來(lái)制備運(yùn)種片段。
[0121] 術(shù)語(yǔ)碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體包括編碼訊tA、BicA、CCPl或LCIA多膚或含有置換、插入或刪 除多膚主鏈的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的多核巧酸。相關(guān)的多膚通過(guò)將同源度分配給各種刪除、置換和 其他修改來(lái)與SbtA、BicA、CCPl或LCIA比對(duì)。同源性可W沿著整個(gè)多膚或多核巧酸，或沿著 連續(xù)殘基的子集確定。百分比相同性是當(dāng)比較兩個(gè)序列時(shí)氨基酸或核巧酸相同的百分比。 相似性百分比是當(dāng)比較兩個(gè)序列時(shí)氨基酸或核巧酸化學(xué)上類(lèi)似的百分比。訊tA、BicA、CCPl 或LCIA與同源的多膚優(yōu)選地是大于或等于約75%、優(yōu)選地大于或等于約80%，更優(yōu)選地大 于或等于約90 %或最優(yōu)選地大于或等于約95 %相同的。
[0122] 例如，可W通過(guò)常規(guī)的位點(diǎn)定向誘變多核巧酸(其是用于程序地確定分子的殘基 功能上重要與否的一個(gè)途徑），由隨機(jī)突變、由化學(xué)合成或由多膚的化學(xué)品或酶切割來(lái)產(chǎn)生 同源的多膚。
[0123] 在多膚序列與參照序列小于100%相同的情況下，不相同的位置優(yōu)選地但并非必 要地為參照序列的保守置換。保守置換通常包括在W下的組內(nèi)的置換:甘氨酸和丙氨酸;鄉(xiāng) 氨酸、異亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酷胺和谷氨酷胺;絲氨酸和蘇氨酸;賴(lài)氨 酸和精氨酸；W及苯丙氨酸和酪氨酸。
[0124] 在認(rèn)為特定的多膚具有與限定長(zhǎng)度的參照多膚特定的百分比相同性時(shí)，該百分比 相同性是相對(duì)于參照膚。因此，50%相同于100氨基酸長(zhǎng)的參照多膚的膚可W是完全相同于 參照多膚的50氨基酸長(zhǎng)的部分的50氨基酸多膚。其也可W是在參考多膚的整個(gè)長(zhǎng)度上50% 與其相同的100氨基酸長(zhǎng)的多膚。當(dāng)然，許多其他的多膚符合該標(biāo)準(zhǔn)。
[01巧]在本文中設(shè)及SbtA、BicA、CCPl或LCIA的核巧酸或氨基酸序列也包括設(shè)及運(yùn)些序 列的自然存在的變體。不同于SEQ ID N0:l、3、5或7(核巧酸)和2、4、6或8(氨基酸)并且保持 生物功能的非自然存在的變體也包括在本文中。優(yōu)選地，該變體包含具有保守的氨基酸變 化，即類(lèi)似的帶電或不帶電氨基酸的變化的多膚。遺傳編碼的氨基酸通常分為四個(gè)家族： (1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸）；堿性(賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸）；（3)非極性(丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）；W及(4)不帶電極性(甘氨酸、天 冬酷胺、谷氨酷胺、半脫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)共 同歸類(lèi)為芳香族氨基酸。由于每個(gè)家族的成員具有與相同家族的其他成員類(lèi)似的物理的與 化學(xué)性能，有理由期待用異亮氨酸或鄉(xiāng)氨酸單獨(dú)替換亮氨酸、用谷氨酸單獨(dú)替換天冬氨酸、 用絲氨酸單獨(dú)替換蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸類(lèi)似地替換氨基酸對(duì)得到的分子的結(jié) 合性能不會(huì)具有主要的影響。氨基酸的變化是否產(chǎn)生功能的多膚可W容易地通過(guò)試驗(yàn)含有 SbtA、BicA、CCPl或LCIA衍生物的轉(zhuǎn)基因植物的性能來(lái)確定。
[01%] 設(shè)及訊tA、BicA、CCPl或LCIA也設(shè)及SbtA、BicA、CCPl或LCIA的多膚衍生物。如在本 文中使用的"多膚衍生物"包括來(lái)自天然存在的SbtA、BicA、CCPl或LCIA的不同長(zhǎng)度的那些 多膚，并且包含如在SbtA、BicA、CCPl或LCIA中發(fā)現(xiàn)的相同的一級(jí)順序中約五個(gè)或更多個(gè)的 氨基酸。具有與訊tA、BicA、CCPl或LCIA基本上相同的氨基酸序列但是擁有少數(shù)的基本上不 影響SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚衍生物分別與SbtA、BicA、CCPl或LCIA特異的分子，如抗體 相互作用的能力的氨基酸置換的多膚是在SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚衍生物的定義之內(nèi) 的。多膚衍生物還包括糖基化的形式，與其他分子的聚集結(jié)合物和與不相關(guān)的化學(xué)部分的 共價(jià)結(jié)合物。
[0127] 在一個(gè)實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(例如，Sbt A、Bi CA、CCP1或LCIA基因或它們的 同源物)在適用于體內(nèi)表達(dá)如，例如植物表達(dá)系統(tǒng)的載體中表達(dá)。碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體多核巧酸 插入在重組體表達(dá)載體或多個(gè)載體中。術(shù)語(yǔ)"重組體表達(dá)載體"是指已經(jīng)通過(guò)插入或結(jié)合碳 酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體遺傳序列來(lái)操縱的質(zhì)粒、病毒或其他在本領(lǐng)域中已知的方式。術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"通 常在本文中根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)命名規(guī)則，由在大寫(xiě)字母和/或數(shù)字之前和/或 之后的小寫(xiě)的P標(biāo)明。在本文中公開(kāi)的質(zhì)粒是可商購(gòu)的，公眾在無(wú)限制的基礎(chǔ)上可獲得的， 或可W通過(guò)常規(guī)應(yīng)用眾所周知的，公開(kāi)的程序由可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。許多質(zhì)粒及其他克 隆和表達(dá)載體是眾所周知的和容易獲得的，或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W容易地構(gòu)建許多適 于使用的其他質(zhì)粒。運(yùn)些載體轉(zhuǎn)化至適合的宿主細(xì)胞W形成用于生產(chǎn)多膚的宿主細(xì)胞載體 系統(tǒng)。
[0128] 術(shù)語(yǔ)重組體多核巧酸或核酸是指通過(guò)由遺傳工程技術(shù)或由化學(xué)合成通過(guò)人工操 作多核巧酸的分離的片段實(shí)現(xiàn)結(jié)合兩個(gè)另外分離的序列片段而制成的多核巧酸。運(yùn)樣做 時(shí)，可W將期望的功能的多核巧酸區(qū)段結(jié)合W生成期望的功能的組合。
[0129] 在本文中可互換地使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純化的"是指核酸、多膚或其他生物部 分，其從其自然地相關(guān)聯(lián)的組分中移開(kāi)。術(shù)語(yǔ)"分離的"可W指單獨(dú)的并且分離于在自然界 中發(fā)現(xiàn)該分子的整個(gè)生物體，或基本上沒(méi)有其他同樣類(lèi)型的生物大分子存在下存在的多 膚。術(shù)語(yǔ)"分離的"相對(duì)于多核巧酸可W指核酸分子完全或部分沒(méi)有在自然界與其正常地關(guān) 聯(lián)的序列;或如其存在于自然界中，但是具有與之關(guān)聯(lián)的異源序列的序列;或脫離自染色體 的分子。通常使用分析化學(xué)技術(shù)，例如聚丙締酷胺凝膠電泳或高效液相色譜確定純度和均 勻性。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"純化的"是指核酸或蛋白質(zhì)是至少85%純的，具體地至少 90%純的，更具體地至少95%純的，或更加具體地至少99%純的。
[0130] 術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因是指包含編碼蛋白質(zhì)或RNA分子的編碼序列的重組體多核巧酸或核 酸。
[0131] 碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體多核巧酸插入適合于植物、細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中的表達(dá)的載體中，該載體進(jìn)一步包含在植物、細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)核酸分子所需的，與編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸分子可操作地連接的調(diào)控元 件。用于植物表達(dá)適合的載體包括T-DNA載體。"可操作地連接"是指其中如此描述的組分處 于允許它們W它們希望的方式作用的關(guān)系的排列（jux化postion)。連接與編碼序列可操作 地連接的表達(dá)控制序列從而在與表達(dá)控制序列相適合的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。如在 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)控制序列"是指調(diào)節(jié)其可操作地連接的核酸序列的表達(dá)的核酸序 列。當(dāng)表達(dá)控制程序控制和調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯(視情況)時(shí)，表達(dá)控制程序可操作 地連接至核酸序列。因此，表達(dá)控制序列可W包括適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白 質(zhì)編碼基因之前的起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子的剪接信號(hào)(如果存在內(nèi)含子的話(huà)）、基因的 正確讀取框架的維護(hù)W允許mRNA正確的翻譯，W及終止密碼子。術(shù)語(yǔ)"控制序列"旨在至少 包括其存在可W影響表達(dá)的組分，并且還可W包括其存在是有利的另外的成分，例如，前導(dǎo) 序列和融合配偶體(fusion padner)序列。表達(dá)控制序列可W包括啟動(dòng)子。"啟動(dòng)子"是指 足W引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。還包括足W致使啟動(dòng)子依賴(lài)的基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞類(lèi)型特異、組織 特異是可控制的，或可W由外部信號(hào)或試劑誘導(dǎo)的那些啟動(dòng)子元件，運(yùn)種元件可W位于基 因的5'或3'區(qū)域。包括組成型和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子兩者。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的，存在顯示表達(dá) 的介導(dǎo)調(diào)節(jié)的序列從而只有當(dāng)植物或植物組織可使用誘導(dǎo)物(例如光)時(shí)轉(zhuǎn)錄相關(guān)的序列。 示例性的啟動(dòng)子是35S花挪菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子，提供基礎(chǔ)表達(dá)并避免轉(zhuǎn)基因植物的 過(guò)表達(dá)。
[0132] 關(guān)于編碼序列，術(shù)語(yǔ)"植物可表達(dá)"是指編碼序列(核巧酸序列）可W有效地由植物 細(xì)胞、組織和/或整個(gè)植物表達(dá)。如在本文中使用的，植物可表達(dá)的編碼序列具有符合在植 物細(xì)胞中可接受的基因表達(dá)的GC組合物，足夠低的CpG含量從而編碼序列的表達(dá)不會(huì)受植 物細(xì)胞的限制，W及符合植物基因的密碼子使用。在期望植物可表達(dá)的基因的特性與那些 自然存在的基因相同時(shí)，植物可表達(dá)的同源物會(huì)具有同義的編碼序列或基本上同義的編碼 序列?；旧贤x的編碼序列是其中存在編碼與比較序列類(lèi)似的氨基酸的密碼子，或如果 取代的氨基酸在性能上與其替換的氨基酸不類(lèi)似，該變化對(duì)至少一種該酶的底物的酶活性 沒(méi)有顯著的影響的序列。如在本文中討論的，應(yīng)充分理解在大多數(shù)情況下，氨基酸序列存在 一些靈活性因而功能不會(huì)顯著地變化。氨基酸序列中的保守變化和生成的類(lèi)似的蛋白質(zhì)可 W容易地使用如本文中公開(kāi)的那些流程來(lái)測(cè)試。在期望植物可表達(dá)的基因具有不同的性能 時(shí)，氨基酸序列與野生型的基因相比可W存在變化，并且增強(qiáng)的光合作用的性能可W容易 地如本文中描述的確定。
[0133] "植物可表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列"是可W在植物、植物組織和/或植物細(xì)胞中 起作用W影響它們結(jié)合的核巧酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)的那些。包括定性地控制基因表達(dá) (響應(yīng)于環(huán)境信號(hào)如光，或W組織特異的方式打開(kāi)或關(guān)閉基因表達(dá))的5'序列和有利地增加 下游基因表達(dá)的水平的定量調(diào)節(jié)序列。用作翻譯控制序列的序列基序的實(shí)例是核糖體結(jié)合 位點(diǎn)序列。聚腺巧酸化信號(hào)是位于祀序列下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的實(shí)例。示例性的側(cè)翼序列 包括根瘤±壤桿菌Ti質(zhì)粒的nos基因的3'側(cè)翼序列。還可W利用細(xì)菌的merA編碼序列的上 游未翻譯序列W改善植物中其他序列的表達(dá)。
[0134] 植物可表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可選地包含組成型啟動(dòng)子W驅(qū)動(dòng)貫穿整個(gè)植物或大 部分的植物組織的基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，組成型啟動(dòng)子在比單子葉植物 (endogenous plant)基因啟動(dòng)子更高的水平下驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，組成型 啟動(dòng)子在至少比單子葉植物基因啟動(dòng)子至少兩倍更高，具體地至少五倍更高，并且更具體 地至少十倍更高的水平下驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。適合的組成型啟動(dòng)子包括植物病毒啟動(dòng)子如花挪 菜花葉病毒(CaMV)35S和19S啟動(dòng)子。示例性的植物病毒啟動(dòng)子是花挪菜花葉病毒35S啟動(dòng) 子。適合的組成型啟動(dòng)子進(jìn)一步包含組成地表達(dá)的植物基因的啟動(dòng)子，如植物泛素、 Rubi SCO，和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如ACTl和ACT2植物肌動(dòng)蛋白基因。示例性的植物基因啟動(dòng)子包 括來(lái)自擬南芥的4機(jī)2啟動(dòng)子（座位413618780;56〇10^):12)和來(lái)自水稻的4(：1'1啟動(dòng)子 (GenBank登錄號(hào)S44221.1;SEQ ID NO: 13)。
[0135] 在調(diào)控元件將連接至組成型啟動(dòng)子時(shí)，通常使用截短的（或最小的）啟動(dòng)子，例如 截短的花挪菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。其他組成型啟動(dòng)子的截短的版本也可W用于提供 CAAT和TATA同源區(qū)域;運(yùn)種啟動(dòng)子序列可W源自根瘤±壤桿菌T-DNA基因如nos、ocs和mas W及植物病毒基因如CaMV 19S基因或擬南芥的ACT2基因的那些。在本文中具體地舉例的翻 譯控制序列是細(xì)菌信號(hào)的ATG翻譯起始密碼子的8和13上游之間的核巧酸并且來(lái)自植物的 ATG翻譯起始密碼子的1至7上游核巧酸。
[0136] 最小啟動(dòng)子含有RNA聚合酶結(jié)合和引發(fā)轉(zhuǎn)錄所需的DNA序列信號(hào)。對(duì)于RNA聚合酶 II啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的約20至50堿基對(duì)上游的TATA同源序列基序和轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)的約50至120堿基對(duì)上游的CAAT同源序列基序所識(shí)別的。按照慣例，轉(zhuǎn)錄上游的核 巧酸由延伸自起始位點(diǎn)的上游(在5'方向）逐漸增大的數(shù)目開(kāi)始。在一個(gè)實(shí)施方式中，在植 物組織中由最小啟動(dòng)子引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是較低的并且不會(huì)正面或負(fù)面地響應(yīng)環(huán)境的或發(fā)育信 號(hào)。示例性的適合用于植物的最小啟動(dòng)子是截短的CaMV 35S啟動(dòng)子，其含有35S基因的-90 至+8的區(qū)域。在期望高水平的基因表達(dá)時(shí)，可W將上調(diào)基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與在 其中使用的最小啟動(dòng)子可操作地連接。運(yùn)種定量的調(diào)節(jié)序列列舉為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)調(diào)節(jié)序列如增 強(qiáng)子。
[0137] 在一個(gè)實(shí)施方式中，植物可表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括組織或器官特異的啟動(dòng)子W 在選擇的器官如根或芽W及其中的組織中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，器官特異的 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)地下的組織如根和根毛中的基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，器官特異的啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)地上組織如芽和葉中的基因表達(dá)。示例性的葉特異的啟動(dòng)子是SRSl啟動(dòng)子.在一個(gè)實(shí) 施方式中，器官特異的啟動(dòng)子在花和生殖組織中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。
[0138] 植物可表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可選地包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子W響應(yīng)于選擇的刺激驅(qū)動(dòng) 基因表達(dá)。適合的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如SRSl啟動(dòng)子，和葉綠素 A/13結(jié)合蛋 白可光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。
[0139] 用于構(gòu)建重組DNA分子的載體的選擇取決于期望的功能性，例如復(fù)制、蛋白質(zhì)表達(dá) W及要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體包含原核復(fù)制子，即當(dāng)引入原核宿主細(xì)胞 如細(xì)菌宿主細(xì)胞時(shí)，具有引導(dǎo)自主復(fù)制并染色體外維持重組DNA分子的能力的DNA序列。此 夕h載體還可W包含，當(dāng)引入那些轉(zhuǎn)化細(xì)胞中時(shí)，其表達(dá)為細(xì)菌宿主細(xì)胞帶來(lái)選擇性?xún)?yōu)勢(shì)， 如耐藥性的基因。適合的細(xì)菌耐藥性基因是帶來(lái)對(duì)氨節(jié)西林或四環(huán)素（W及其他選擇性試 劑)的耐性的那些。新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶基因具有其在真核W及原核細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。
[0140] 載體通常包括對(duì)于插入重組DNA分子方便的限制位點(diǎn)。適合的載體質(zhì)粒包括可獲 得自 BioRad Laboratories (Richmond，Cal if.)的pUC8、pUC9、地R322和地R329 W及可獲得 自曲a;rmacia(Piscataway，N.J.)的pPL、地和K223 W及可獲得自 Stratagene化a Jolla, Calif .)的pBLUESCRIPT'K和pBS。適合的載體包括，例如可獲得自Stratagene化a Jol Ia，Cal if.)的包括AZAP載體的A隧菌體載體。其他示例性的載體包括pCMU。其他適當(dāng)?shù)?載體還可W根據(jù)已知的方法合成;例如，載體pCMU/K哺pCMUII，其是pCMUIV的修飾。
[0141] 能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)重組體核酸序列并且能夠在宿主植物細(xì)胞中引導(dǎo)穩(wěn)定整 合的適合的表達(dá)載體包括源自根瘤±壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體，和一些其他已知 在植物中作用的表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，見(jiàn)Verma et al. ,NO.W087/00551通過(guò)引證結(jié)合在本 文中。其他適合的表達(dá)載體包括用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的通路克?。╣ateway cloning)相容植物目標(biāo)載體，例如pEarleyGate 系列化 arley et al. The Plant Journal Volume 45,Issue 4,pages 616-629,February 2006)。
[0142] 表達(dá)和克隆載體可選地含有可選擇標(biāo)記，即編碼用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生存或 生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)的基因。雖然運(yùn)種標(biāo)記基因可W攜帶在另一多核巧酸序列上共同引入宿 主細(xì)胞，其最經(jīng)常包含在克隆載體上。僅標(biāo)記基因已經(jīng)引入其中的那些宿主細(xì)胞會(huì)在選擇 性的條件下生存和/或生長(zhǎng)。適合的選擇基因編碼的蛋白質(zhì)(a)帶來(lái)對(duì)抗生素或其他毒性物 質(zhì)，例如氨節(jié)西林、新霉素、甲氨蝶嶺等的抗性；（b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷的缺點(diǎn);或(C)提供不可由 復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素。適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)記的選擇將部分取決于宿主細(xì)胞。
[0143] 選擇轉(zhuǎn)基因植物最常使用的標(biāo)記之一是對(duì)草錠麟（W各種商品名包括Basta和 Finale出售的除草劑)的耐性。對(duì)草錠麟的耐性是由編碼草下麟乙酷轉(zhuǎn)移酶(PAT)的細(xì)菌雙 丙氨麟抗性基因（BAR)帶來(lái)的。草錠麟選擇的主要優(yōu)點(diǎn)是其可^在±壤中生長(zhǎng)的植物上進(jìn) 行并且不需要使用無(wú)菌技術(shù)。
[0144] 在一個(gè)實(shí)施方式中，將碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列克隆入適用于在不同的組成型啟 動(dòng)子，包括CaMV 35S啟動(dòng)子W及來(lái)自擬南芥和水稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制下在亞麻莽中 表達(dá)的載體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，由器官或組織特異的或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)碳酸氨鹽 轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列。示例性的組織特異啟動(dòng)子是葉特異的SRSl啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，將 碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列克隆入包含啟動(dòng)子、方便的克隆位點(diǎn)和nos轉(zhuǎn)錄終止子(NOSt)的 植物表達(dá)盒構(gòu)建體或載體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，將碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體克隆入祀arlygate質(zhì) 粒中的植物表達(dá)盒中。
[0145] 使用表達(dá)載體其他DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)方法 進(jìn)行的。"轉(zhuǎn)化"是指結(jié)合新的DNA(即細(xì)胞外源的DNA)后在細(xì)胞中誘導(dǎo)的永久的或暫時(shí)的遺 傳變化。在細(xì)胞是植物細(xì)胞時(shí)，永久的遺傳變化通常是通過(guò)將DNA引入細(xì)胞的基因組實(shí)現(xiàn) 的。"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞"是指借助重組DNA技術(shù)將編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（例如SbtA、 BicAXCPl或LCIA多膚）的DNA分子或其片段引入其中（或引入其前體)的細(xì)胞(例如原核的 或真核的）。
[0146] 在本發(fā)明上下文中，重組體宿主細(xì)胞是遺傳地修改W含有分離的DNA分子的那些。 可W通過(guò)適合于特定的細(xì)胞類(lèi)型的方式引入DNA，包括但不限于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電 穿孔。
[0147] 本文還包括已經(jīng)用碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。"轉(zhuǎn)基因植物"是遺傳 地修改W含有并表達(dá)重組DNA序列為調(diào)控RNA分子或蛋白質(zhì)的事物。如在本文中具體列舉 的，轉(zhuǎn)基因植物是遺傳地修改W含有并表達(dá)與在植物細(xì)胞或組織或整個(gè)植物中作用的轉(zhuǎn)錄 控制序列可操作地連接或在其調(diào)控控制下的重組DNA序列。如在本文中使用的，轉(zhuǎn)基因植物 還包含初始轉(zhuǎn)基因植物的后代，其中那些后代含有并且能夠在本文中描述的植物可表達(dá)的 轉(zhuǎn)錄控制序列的調(diào)控控制下表達(dá)重組體編碼序列。含有轉(zhuǎn)基因胚的種子包括在該定義之 內(nèi)。
[0148] 表達(dá)重組體基因的，轉(zhuǎn)基因植物的群體之內(nèi)的單株植物可W具有不同的基因表達(dá) 水平。不同的基因表達(dá)歸因于多種因素，包括重組體基因的多重拷貝、染色質(zhì)的影響和基因 抑制。因此，轉(zhuǎn)基因植物的表型可W測(cè)量為群體內(nèi)的單個(gè)植物的百分比。在一個(gè)實(shí)施方式 中，大于或等于約25%的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)表型。具體地，大于或等于約50%的轉(zhuǎn)基因植物表 達(dá)表型。更具體地，大于或等于約75%的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)表型。表型是增加的C〇2同化、降低 的蒸騰速度、增加的水分利用率、增加的氮利用率或增加的種子產(chǎn)量。
[0149] 轉(zhuǎn)基因植物是用包含與植物可表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接的碳酸氨鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體編碼序列的重組體多核巧酸或核酸分子轉(zhuǎn)化的。適合的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列包括 與碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因同源的序列。示例性的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因包括集胞藻屬 PCC6803SbtA(沈Q ID N0:1)、聚球藻屬PCC7002BicA(沈Q ID N0:3)、萊茵衣藻CCPUSEQ ID N0:5)和萊茵衣藻LCIA(SEQ ID N0:7)。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)異源的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)，其 局部化至植物的葉綠體被膜，例如內(nèi)包膜。在一個(gè)實(shí)施方式中，碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是與CCPl蛋 白質(zhì)同源的。適合的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)包括來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)。 示例性的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)包括集胞藻屬？此68035^4(56〇10^):2)、聚球藻屬 PCC7002BicA(沈Q ID N0:4)、萊茵衣藻CCPUSEQ ID N0:6)和萊茵衣藻LCIA(SEQ ID NO: 8)。
[0150] 本發(fā)明人已經(jīng)用在核基因組中編碼異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的重組DM分子轉(zhuǎn)化了植 物。表達(dá)的重組體碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體局部化至葉綠體的內(nèi)包膜。表達(dá)重組體異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體基因的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞相比不包含重組體異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的同樣種類(lèi)的 野生型植物示出了增強(qiáng)的C〇2同化和降低的蒸騰速度。轉(zhuǎn)基因植物相比不包含重組體異源 碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的同樣種類(lèi)的野生型植物還示出了增加的種子產(chǎn)量。
[0151] 將包括植物可表達(dá)的基因或其他感興趣的DNA的重組DNA構(gòu)建體通過(guò)適合的方法 插入植物的基因組中。合適的方法包括，例如根瘤±壤桿菌介導(dǎo)的的DNA轉(zhuǎn)移、直接DNA轉(zhuǎn) 移、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、電穿孔、共培養(yǎng)、擴(kuò)散、粒子轟擊、顯微注射、基因槍、憐酸巧共沉 淀、病毒載體和其他技術(shù)。適合的植物轉(zhuǎn)化載體包括源自根瘤±壤桿菌的Ti質(zhì)粒的那些。除 源自±壤桿菌的Ti或根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體外，可W使用替代方法將DNA構(gòu)建體 插入植物細(xì)胞。可W通過(guò)選擇轉(zhuǎn)化的種子或選擇轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并隨后再生來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植 物。
[0152] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在CaMV 35S啟動(dòng)子和3'OCS終止子的控制下將碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn) 體編碼序列亞克隆至植物表達(dá)T-DNA雙運(yùn)載體pEarleyGatelOO中。先前證明該編碼序列和 啟動(dòng)子在大多數(shù)植物組織中是強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄表達(dá)的。使用真空滲入技術(shù)轉(zhuǎn)化亞麻莽，并且篩選 BASTA耐性的Tl生成種子。生產(chǎn)用分離的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體多核巧酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。在一 個(gè)實(shí)施方式中，植物還表達(dá)第二碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列。
[0153] 在一個(gè)實(shí)施方式中，生長(zhǎng)(例如在±壤上)并收獲轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施方式中， 與地下組織分開(kāi)收獲地上組織。適合的地上組織包括芽、莖、葉、花、谷粒和種子。示例性的 地下組織包括根和根毛。在一個(gè)實(shí)施方式中，收獲整個(gè)植物并隨后將地上組織與地下組織 分離。
[0154] 通過(guò)W下非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步地說(shuō)明本發(fā)明。技術(shù)人員想到的任何列舉的成 分和方法的變化旨在處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0155] 實(shí)施例
[0156] 實(shí)施例1.碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)載體的構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化
[0157] 訊tA基因融合的構(gòu)建和祀向至葉綠體的確認(rèn)
[0158]將基因構(gòu)建體設(shè)計(jì)為將來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌的SbtA(集胞藻屬（Syncchocystis) PCC6803)碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體祀向至葉綠體。框內(nèi)編碼的每種構(gòu)建體融合來(lái)自擬南芥的 atTic20的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)膚（110氨基酸)至SbtA的N-末端W在由亞麻莽核基因組表達(dá)時(shí)將蛋 白質(zhì)祀向至葉綠體（圖l)〇AtTic20是良好表征的葉綠體內(nèi)包膜（inner envelope membrane)蛋白（Chen et al.，2000，Plant Physiol.122:813-822)。此外，含有 C-末端的基 因融合至C-Myc表位標(biāo)記(邱itope化g)W便于確認(rèn)在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)和局部化。示例 性的訊構(gòu)建體提供為沈Q ID N0:11。
[0159] 將SbtA(atTic20TP_SbtA_cMyc)構(gòu)建體插入含有上游隧菌體T7啟動(dòng)子和下游T7終 止子序列的源自PUC18的載體PJe邱ress414中，W允許使用T7連接的轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)體外翻 譯構(gòu)建體。
[0160] 將構(gòu)建體在[35S]甲硫氨酸的存在下翻譯并用分離的魏豆葉綠體溫育W研究它們 適當(dāng)?shù)仂胂蛑寥~綠體并結(jié)合內(nèi)包膜的能力。如由atTic20轉(zhuǎn)運(yùn)膚的切割W產(chǎn)生較高移動(dòng)性 的物質(zhì)（泳道2)證明的，蛋白質(zhì)引入反應(yīng)的分析（圖2)表明體外翻譯產(chǎn)物(泳道1)引入至分 離的葉綠體中。處理葉綠體隨后引入嗜熱菌蛋白酶W消化葉綠體外側(cè)剩余的蛋白質(zhì)表明兩 種蛋白質(zhì)的處理的形式是保護(hù)不受蛋白水解的并且因此被完全引入(比較泳道2和5)。為確 認(rèn)轉(zhuǎn)運(yùn)體整合至葉綠體膜中，通過(guò)堿提?。╝lkaline extraction)和差示沉降 (differential sedimentation)分離基質(zhì)和膜部分。隨膜顆粒部分分離的轉(zhuǎn)運(yùn)體（比較泳 道6和7)符合適當(dāng)?shù)牟迦搿?br>[0161] 將[35S]甲硫氨酸標(biāo)記的atTic20TP_SbtA_cMyc引入分離的魏豆葉綠體中，并且隨 后將葉綠體分離W產(chǎn)生內(nèi)包膜、基質(zhì)和類(lèi)囊體部分。將分布與引入atTic20的那些、真實(shí)的 內(nèi)包膜蛋白和Rubisco的小亞基（SSU)，已知的基質(zhì)蛋白質(zhì)相比較。圖4示出atTic201T_ SbtA_cMyc被引入，處理成其成熟形式(SbtA_cMyc)，并主要結(jié)合至膜部分（圖4A，第二子圖， 比較泳道1、2和3)。訊tA_cMyc主要隨內(nèi)包膜分離（圖4A，第二子圖，比較泳道4-6和圖4B)。大 于75%的蛋白質(zhì)與內(nèi)包膜相結(jié)合（圖4B)。該分布模式與引入的前atTic20(pre-atTic20) (圖44，第立子圖和4B)相似，表明SbtA_cMyc適當(dāng)?shù)鼐植炕羶?nèi)包膜。相對(duì)地，引入的SSU幾 乎唯一地局部化至基質(zhì)部分（圖4A底部子圖和4B)。體外引入試驗(yàn)的結(jié)果是明確的，并且因 此我們已經(jīng)將訊tA碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體祀向至葉綠體的內(nèi)包膜。
[0162] 通過(guò)核轉(zhuǎn)化構(gòu)建用于將訊tA融合物引入植物的轉(zhuǎn)化載體
[0163] 將單獨(dú)的編碼atTi c20TF*_SbtA_cMyc的單基因構(gòu)建體插入基于祀ar IeyGate 100 (PEG 100)的，含有修改的35S花挪菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子的雙植物轉(zhuǎn)化載體中W提供在 轉(zhuǎn)基因植物中的基礎(chǔ)表達(dá)和避免過(guò)表達(dá)。將運(yùn)些構(gòu)建體（圖3; "PEG IOOSbtA")由±壤桿菌 介導(dǎo)的，基于確立的方法的化u&Kang，2008，Plant Cel 1 Rep，27，273-278)花器浸薩轉(zhuǎn)化法 (floral dip transformation)轉(zhuǎn)化至亞麻莽中。對(duì)每種載體轉(zhuǎn)化45-50株植物。收集來(lái)自 TO植物的種子。
[0164] 使用存在于T-DNA插入中的BASTA可選擇標(biāo)記篩選來(lái)自運(yùn)些植物的Tl巧苗。圖5示 出了通過(guò)施加200mg/L的BASTA除草劑成功選擇Tl巧苗(seedling)的實(shí)例（圖5,比較A和B)。 移植耐BASTA的植物（圖5C)并且使用來(lái)自T1品系的基因組DNA與基因特異性引物(Sb tA)或 對(duì)照引物(肌動(dòng)蛋白）的PCR的基因分型確定該品系為atTi c20TP_SbtA_cMyc轉(zhuǎn)化體(見(jiàn)圖5D 中的實(shí)例）。野生型亞麻莽基因組DNA對(duì)肌動(dòng)蛋白對(duì)照是陽(yáng)性的，但是缺乏轉(zhuǎn)基因（圖5D)。
[01化]將亞麻莽葉綠體從由atTi c20TP_SbtA_cMyc構(gòu)建體表達(dá)SbtA_cMyc的品系中分離。 在分離葉綠體之后，使用抗-CMyc抗體的免疫印跡實(shí)驗(yàn)示出轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)局部化至葉綠 體，處理至其成熟形式，并且結(jié)合至葉綠體膜（圖7B)。選擇純合的T3轉(zhuǎn)基因品系用于光合作 用分析。
[0166] 表達(dá)來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌的BicA的亞麻莽核轉(zhuǎn)化體的生成
[0167] 在祀G 100中生成與上述的對(duì)于SbtA的那些相似的表達(dá)藍(lán)藻細(xì)菌BicA碳酸氨鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體的構(gòu)建體(見(jiàn)圖1和圖3)。
[0168] 將運(yùn)些構(gòu)建體（"pEG 100BicA_cMyc")通過(guò)基于確立方法的，±壤桿菌介導(dǎo)的花器 浸薩轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至亞麻莽中。對(duì)每種載體轉(zhuǎn)化45-50株植物，并且收集來(lái)自TO植物的種子。 使用如上文描述的存在于T-DNA插入中的BASTA(草錠麟)可選擇標(biāo)記篩選來(lái)自運(yùn)些植物的 Tl巧苗。通過(guò)基因組DNA的PCR確認(rèn)Tl轉(zhuǎn)化植物（圖加）。將亞麻莽葉綠體從由atTic20TP_ BicA_cMyc構(gòu)建體表達(dá)BicA的品系中分離。在分離葉綠體之后，使用抗-cMyc抗體的免疫印 跡實(shí)驗(yàn)示出轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)局部化至葉綠體，處理至其成熟形式，并且結(jié)合至葉綠體膜（圖 7A)。
[0169] 隨后，選擇純合的T3轉(zhuǎn)基因品系用于光合作用分析。
[0170] 表達(dá)來(lái)自衣藻的CCPl碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的亞麻莽核轉(zhuǎn)化體的生成
[0171] 來(lái)自衣藻的CCPl基因作為增加葉綠體[0)2]的轉(zhuǎn)運(yùn)體是對(duì)SbtA有吸引力的替代。 CCPl已經(jīng)示出增加低[C02]耐受性并且應(yīng)當(dāng)含有對(duì)于葉綠體祀向的所有植物特異信息，
[0172] 我們將稠合至cMyc表位標(biāo)記的CCPl插入pEG 100雙運(yùn)載體（圖3)和轉(zhuǎn)化的亞麻莽 屬植物。使用BASTA選擇篩選T1轉(zhuǎn)化體(作為實(shí)例見(jiàn)圖5A-C)并由PCR確認(rèn)基因型（圖5D)。
[0173] CCPLcMyc品系示出較快的Tl成熟。使用可商購(gòu)的cMyc單克隆抗體通過(guò)Tl植物提 取物的免疫印跡法測(cè)試轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。由5個(gè)隨機(jī)選擇的5周大的Tl轉(zhuǎn)化體和對(duì)照野生型植 物制備葉提取物（圖6A)。將對(duì)應(yīng)來(lái)自每種品系的25iig和50iig蛋白質(zhì)的提取物由SDS-PAGE解 析并免疫印跡CCP l_cMy C的存在。圖6表明所有檢驗(yàn)的CCP l_cMy C的T1品系（圖6A)表達(dá)預(yù)測(cè) 的分子質(zhì)量的免疫活性蛋白質(zhì)。野生型對(duì)照沒(méi)有展現(xiàn)出免疫活性。品系展現(xiàn)出相當(dāng)大的蛋 白質(zhì)表達(dá)的可變性，提供一系列的用于基因?qū)夂蠀?shù)的影響的表型分析的植物。收集來(lái) 自Tl轉(zhuǎn)化體的T2種子。
[0174] 選擇純合的T3品系用于表達(dá)CCP l_cMy C的CCP1亞麻莽品系。如W下描述的對(duì)選擇 的純合品系分析轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)光合作用(C〇2同化)的影響、水和氮的利用率和種子產(chǎn)量。
[0175] 表達(dá)來(lái)自衣藻的LCIA的亞麻莽核轉(zhuǎn)化體的生成
[0176] 在祀G 100中生成與上文對(duì)于CCPl表達(dá)所描述的相似的表達(dá)來(lái)自衣藻的LCIA的構(gòu) 建體(圖3)。
[0177] 將運(yùn)些構(gòu)建體通過(guò)基于確立方法的，±壤桿菌介導(dǎo)的花器浸薩轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至亞麻 莽中。對(duì)每種載體轉(zhuǎn)化45-50株植物。收集來(lái)自TO植物的種子。
[0178] 使用BASTA選擇篩選Tl轉(zhuǎn)化體(作為實(shí)例見(jiàn)圖5A-C)并通過(guò)PCR確認(rèn)基因型（圖5D)。 選擇表達(dá)單獨(dú)的來(lái)自衣藻的LCIA基因的LCIA亞麻莽品系的純合T3品系并隨后分析各種功 能。
[0179] 使用可商購(gòu)的cMyc單克隆抗體通過(guò)Tl植物提取物的免疫印跡法測(cè)試轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)。由5個(gè)隨機(jī)選擇的5周大的Tl轉(zhuǎn)化體和對(duì)照野生型植物制備葉提取物（圖6B)。將來(lái)自每 種品系的對(duì)應(yīng)25iig和50iig的蛋白質(zhì)的提取物由SDS-PAGE解析并免疫印跡LCI A_cMy C的存 在。圖6表明所有檢驗(yàn)的LCIA_cMy C的T1品系（圖6B)表達(dá)預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量的免疫活性蛋白 質(zhì)。野生型對(duì)照沒(méi)有展現(xiàn)出免疫活性。
[0180] 堆疊構(gòu)建體和表達(dá)堆疊構(gòu)建體的植物轉(zhuǎn)化體的生成
[0181] 除單基因表達(dá)構(gòu)建體外，生成其中表達(dá)多個(gè)碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的多個(gè)"堆疊 (stacked)"表達(dá)構(gòu)建體。構(gòu)建與上文對(duì)于藍(lán)藻細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)體或衣藻轉(zhuǎn)運(yùn)體描述的相似，對(duì)于 特定的基因適當(dāng)?shù)氖?堆疊"在轉(zhuǎn)化入植物中的表達(dá)載體中。
[0182] 具體地，制成表達(dá)來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌的BicA和SbtA兩者的堆疊基因構(gòu)建體并隨后轉(zhuǎn)化 入亞麻莽中。
[0183] 另外，制成表達(dá)來(lái)自衣藻的CCPl和LCIA兩者的堆疊基因構(gòu)建體并隨后轉(zhuǎn)化入亞麻 莽中。
[0184] 分離并測(cè)試生成自每種堆疊構(gòu)建體的T3植物。
[0185] 在下表中提供相關(guān)的亞麻莽轉(zhuǎn)基因品系的狀態(tài)的總結(jié)。
[0186] 表5.單獨(dú)和共同表達(dá)的碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)基因品系的總結(jié)
[0187]
[0188] 實(shí)施例2.植物轉(zhuǎn)化體的功能測(cè)試
[0189] 在相同條件下生長(zhǎng)的CCPl亞麻莽轉(zhuǎn)基因品系和野生型植物的光合參數(shù)
[0190] 檢驗(yàn)四種各自為單獨(dú)的CCPl亞麻莽轉(zhuǎn)化體的純合T3品系W確定它們?cè)敿?xì)的光合 和碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)性能。對(duì)每種品系在最少=個(gè)生物復(fù)制體(=株植物)上進(jìn)行所有的測(cè)量。 我們?cè)趲追NCCPl亞麻莽品系中確定了相比野生型植物的顯著差異。
[0191] 使用具有3cmX2cm采樣室的便攜式光合作用系統(tǒng)化I-6400XT，Li-C0R Inc.， Lincoln,肥，USA)測(cè)量?jī)艄夂献饔?、?xì)胞間C〇2(Ci)、氣孔導(dǎo)度（Stomatal conductance)和 蒸騰作用。在4-5周大的植物上在開(kāi)花之前測(cè)量氣體交換。
[0192] 在恒定的400皿ol/m2的C〇2濃度(213皿ol/m2的平均Ci)下，我們觀察到植物中CCP 1亞麻莽的同化速率的最小差異（圖8A)。然而，我們觀察到單獨(dú)的CCPl亞麻莽品系與野生型 相比Ci(圖8B)、氣孔導(dǎo)度（圖8D)和蒸騰速率（圖8E)的顯著差異。在轉(zhuǎn)基因品系中相比野生 型植物氣孔導(dǎo)度降低27-32%之間，并且蒸騰作用降低30-31%。當(dāng)對(duì)Ci校正同化速率時(shí)，品 系CCPl-20、CCPl-34和CCP1-48各自展現(xiàn)出19%、14%和17%的同化作用/(：1增加（圖8〇。
[0193] 運(yùn)些數(shù)據(jù)表示轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)降低蒸騰作用和氣體交換（即關(guān)閉氣孔)來(lái)響應(yīng)較 高的C〇2轉(zhuǎn)運(yùn)能力。
[0194] 水利用率(WUE)和氮利用率(NUE)
[01M]基于對(duì)CCPl亞麻莽轉(zhuǎn)基因植物觀察到的顯著的氣孔導(dǎo)度和蒸騰作用降低（圖8)， 我們?cè)O(shè)置了表型測(cè)試W就水利用率比較CCP1-20和野生型植物?；驹硎腔陬A(yù)期降低 的蒸騰作用會(huì)導(dǎo)致降低的水利用并增加對(duì)減少灌概的耐受性。
[0196] 將轉(zhuǎn)基因和WT巧苗在Pro-mix生長(zhǎng)培養(yǎng)基上萌發(fā)并將兩周大的巧苗移植至5"的花 盆。作為第一次定性測(cè)量W肥，我們使CCP1-20和野生型植物生長(zhǎng)至開(kāi)花起始(37天)或種子 成熟起始(50天）的階段并完全停止誘水7天，其中每天觀察枯萎的癥狀。CCP1-20在兩個(gè)階 段均展現(xiàn)出干旱耐受性的顯著增加（圖9)。在缺水7天之后CCP1-20植物保持健康，然而野生 型植物枯萎并開(kāi)始干枯。
[0197] 檢驗(yàn)運(yùn)些植物的水利用率(WUE)和氮利用率(NUE) W測(cè)試由于降低的C〇2需求增加 的C〇2同化將導(dǎo)致氣體交換的變化和由于減少的rubisco合成導(dǎo)致氮需求減少的假說(shuō)。
[019引通過(guò)確定在受限的水情下生長(zhǎng)的野生型和CCP1-20植物的葉水含量來(lái)定量地測(cè)量 WUE。如Ba;rrs(Australian Jourmal of Biological Sciences, 1962,15:413-428)中描述 的，在相等尺寸的葉上測(cè)量相對(duì)葉水含量。在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下WT和CCPl-20之間的水含量沒(méi) 有顯著不同。在《250ml/天的水下水含量的差異是可檢測(cè)的。圖10示出了在250ml/天和 175ml/天的水下的葉水含量。選擇運(yùn)些值是因?yàn)樗鼈兎謩e對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)季節(jié)過(guò)程中~15in和~ IOin的降雨量（Spring Camelina Production Guide 2009) oWT植物的田地試驗(yàn)表明當(dāng)降 雨從 10增加至 15in/季時(shí)產(chǎn)量增加50% (Spring Camelina Production Guide 2009)。 CCPl-20植物在250ml/天和175ml/天的水下分別展現(xiàn)出相對(duì)WT 25%和71 %的水含量增加。 在175ml/天下的水含量?jī)H比在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下觀察到的低27%。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明CCP1-20植 物的WUE顯著增加。
[0199] 在恒定的大氣[C02]下在水受限條件下在更大的代表組的CCPl品系中測(cè)量C〇2同 化示出了相對(duì)于野生型植物2-14%之間的同化增加（圖11A)。除了CCP1-34外，由每株植物 的種子重量測(cè)量的，CCPl亞麻莽植物的種子產(chǎn)量在運(yùn)些條件下在所有品系中增加了 7-50% 之間（圖11B)。在所有的CCPl轉(zhuǎn)基因品系中相比野生型植物沒(méi)有檢測(cè)到種子的含油量的顯 著差異(數(shù)據(jù)未示出）。
[0200] 使用兩個(gè)參數(shù)測(cè)量氮利用率(NUE)(圖12)。首先，作為葉含氮量的函數(shù)測(cè)量C〇2同 化速率（圖12A)。將兩周大的WT和轉(zhuǎn)基因植物移植至充滿(mǎn)賠石(vermiculite)的5'花盆中。 將植物用含有如標(biāo)明的不同濃度的氮的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液（Hoagland ' S nutrient solution)處理。在4周大植物的成熟葉上測(cè)量?jī)艄夂献饔?。然后收獲葉片，干燥并通過(guò)催化 燃燒確定總含氮量。在12ppm的氮肥料施加下CCP1-20展現(xiàn)出相比野生型29%的NUE的增加。 在25ppm的氮下CCP1-20和野生型植物之間的NUE的差異降低至19%并且在更高的氮施加下 是不可辨別的。1化pm和25ppm的氮分別相當(dāng)于±壤中24磅/英畝和50磅/英畝的田地施加。 在田地中推薦的施加率是30磅/英畝（Spring Camelina Production Guide 2009)。在 的氮下在CCPl-20和野生型之間觀察到15%的碳/氮含量比差異（圖12B)，符合CCPl-20 中 NUE 的增力日。我們的標(biāo)準(zhǔn)溫室施加為~ 20 化 pm 的氮。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明CCPl-20 相對(duì)于野生 型植物展現(xiàn)出顯著增加的饑正。在試圖模仿田地條件的條件下差異最為明顯。
[0201] 我們還使用A/Ci曲線(xiàn)(凈C〇2同化速率A對(duì)比計(jì)算的氣孔下C〇2濃度Ci)分析了在不 同的氮肥施加下生長(zhǎng)的野生型和CCP1-20植物的光合作用參數(shù)。測(cè)量是用LI-6400XT在植物 中進(jìn)行的。在所有的氮濃度下C〇2同化速率對(duì)CCP1-20保持接近恒定，但是對(duì)處于SOppmW下 氮濃度下的野生型下降（圖13A)。在25和12ppm的氮下，CCP1-20植物分別展現(xiàn)出相比野生型 植物21%和35%更高的同化速率（圖134)。我們還對(duì)第二品系，0^1-48生成了在12口口111的氮 肥下的A/Ci曲線(xiàn)，W支持用CCP1 -20觀察到的增加的氮利用率。兩種品系（CCP1 -20和CCP1 -48)均示出類(lèi)似的A/Ci曲線(xiàn)，其中在4(K)ppm的Ci下觀察到C02同化速率相對(duì)于野生型植物增 加 30%(圖 13B)。
[0202] 在較低的氮肥施加下增加的NUE轉(zhuǎn)化為顯著的種子產(chǎn)量增加。CCP1-20的種子產(chǎn)量 (種子重量/植物）在12ppm的氮下比野生型高56% (圖14)。在標(biāo)準(zhǔn)溫室肥料條件下 I(K)PPm N)沒(méi)有觀察到野生型和CCP1-20之間種子產(chǎn)量的顯著差異（圖14)。
[0203] 西馬薩諸塞的田地試驗(yàn)中CCPl轉(zhuǎn)基因品系的生物質(zhì)和種子產(chǎn)量
[0204] 在西馬薩諸塞的田地試驗(yàn)中使用25平方英尺的區(qū)塊測(cè)試代表性的CCPl亞麻莽品 系CCPll-18、CCPl-20和CCP1-48。在5月23日開(kāi)始栽種。在7月29日開(kāi)始CCPl亞麻莽品系的收 獲并在8月11日完成。在8月4日開(kāi)始野生型對(duì)照區(qū)的收獲并在8月25日完成。
[0205] CCP1-20和CCP1-48品系一致地展現(xiàn)出較高的生物質(zhì)產(chǎn)量，包括較高的種子數(shù)/植 物，種子數(shù)/總生物質(zhì)，W及總種子和生物質(zhì)重量/英畝（圖15)。該增加符合對(duì)兩種運(yùn)些品系 在溫室和生長(zhǎng)室中的觀察。此？1-20和〇^1-48的種子重量/英畝分別增加38%和51.5%。 CCP1-18品系由于較低的出苗率(seedling establishment)在田地中顯著地表現(xiàn)不佳，并 且示出39%的種子重量/英畝的減少。
[0206] CCP1-20和CCP1-48展現(xiàn)出略微減少的種子大小（種子重量/100種子）（圖16)，表明 種子產(chǎn)量的總體增加很大程度上是由于每株植物產(chǎn)生的種子數(shù)目的增加。運(yùn)些數(shù)據(jù)也與溫 室的研究一致。
[0207] 所有的轉(zhuǎn)基因的種子的含油量與野生型對(duì)照不能區(qū)分，其中含量范圍為32-34% (重量/重量）的油（圖17)。在CCP1-20和CCP1-48中總體油產(chǎn)量(磅/英畝）分別增加43%和 76%。與其表現(xiàn)不佳一致，品系CCP1-48示出37%的油產(chǎn)量減少。
[020引如由田地試驗(yàn)的栽種和收獲安排表明的，表達(dá)CCPl構(gòu)建體的品系在對(duì)照品系前一 至兩周成熟。運(yùn)顯示該特性也可能影響亞麻莽的壽命周期和/或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物的早期衰 老。
[0209] 在相同條件下生長(zhǎng)的訊tA或BicA轉(zhuǎn)基因品系和野生型植物的光合參數(shù)
[0210] 我們還分析了表達(dá)BicA和SbtA微生物碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的純合亞麻莽BicA和SbtA T3純合品系中的光合參數(shù)。一些品系展現(xiàn)出顯著增加的C〇2同化（圖18A)。當(dāng)由Ci調(diào)節(jié)時(shí)（圖 18B) ,SbtA-S和BicA-IO在275WH01 C〇2mol空氣-1的恒定Ci下在統(tǒng)計(jì)上展現(xiàn)出相比野生型植 物15%的同化的顯著增加（圖18C)。
[0211] 實(shí)施例3.用載體轉(zhuǎn)化各種農(nóng)作物
[0212] 玉米的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0213] 本發(fā)明中提供的載體可W遵循先前所描述的流程用于玉米的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化（Frame et al.,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol.1,PP 185-199, Hum曰n曰 Press)O
[0214] 植物材料:將在溫室中生長(zhǎng)的植物用作外植體來(lái)源。在授粉后9-13天收獲穗(ear) 并用80%的乙醇表面殺菌。
[0215] 外植體分離、侵染和共培養(yǎng):將未成熟的合子胚（1.2-2.Omm)由單獨(dú)的核屯、無(wú)菌剖 開(kāi)并在根瘤±壤桿菌菌株EHAlOl培養(yǎng)基（在轉(zhuǎn)化之前在補(bǔ)充有IOOiiM的乙酷下香酬的5ml N6介質(zhì)中生長(zhǎng)用于刺激細(xì)菌Vir基因2-化）中在室溫下溫育5分鐘。將傳染的胚盾片側(cè)向上 移至共培養(yǎng)基(N6瓊脂凝固的培養(yǎng)基，含有300mg/l的半脫氨酸、5iiM的硝酸銀和IOOiiM的乙 酷下香酬)并在20°C下在黑暗中溫育3天。將胚移至含有l(wèi)OOmg/1的頭抱嚷目虧、lOOmg/1的萬(wàn) 古霉素和如M的硝酸銀的N6靜息培養(yǎng)基(resting medi皿)并在28°C下在黑暗中溫育7天。
[0216] 愈合組織選擇：將所有的胚移至第一選擇性培養(yǎng)基（補(bǔ)充有1.5mg/l的除草膚 (bialaphos)的上述靜息培養(yǎng)基)并在28°C下在黑暗中溫育2周，隨后在含有3mg/l除草膚的 選擇性培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。在相同的培養(yǎng)基上每2周通過(guò)繼代培養(yǎng)增殖并維持愈合組織的 增生塊。
[0217] 植物再生和選擇:將耐除草膚的胚胎發(fā)生愈合組織品系移至再生培養(yǎng)基K補(bǔ)充有 60g/l薦糖、1.5mg/l除草膚和lOOmg/1頭抱嚷目虧（cefotaxime)并用3g/l Gelrite固化的MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基）并在25°C下在黑暗中溫育2至3周。將在運(yùn)期間形成的成熟胚移至再生培養(yǎng)基 IK與再生培養(yǎng)基I相同，具有3mg/l的除草膚）用于在光下發(fā)芽（25°C ,SO-I(K)地/WVs光強(qiáng) 度，16/化光周期）。再生的植物準(zhǔn)備好在10-14天內(nèi)移至±壤。
[0218] 高梁的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0219] 本發(fā)明中提供的載體可W遵循先前所描述的流程用于高梁的轉(zhuǎn)化(Zhao ,2006， Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 233-244,Humana Press)。
[0220] 植物材料:將在溫室、生長(zhǎng)室或田地條件下生長(zhǎng)的植物用作外植體來(lái)源。在授粉后 9-12天收獲未成熟的圓錐花序(panicle)并將單獨(dú)的核屯、化ernel)用50%的漂白劑表面殺 菌30分鐘隨后用無(wú)菌蒸饋水洗涂=次。
[0221] 外植體分離、侵染和共培養(yǎng):將未成熟的合子胚（1-1.5mm)由單獨(dú)的核屯、無(wú)菌剖開(kāi) 并在根瘤±壤桿菌菌株LBA4404懸浮液中（在PHI-I液體培養(yǎng)基(補(bǔ)充有的lg/1酪蛋白氨基 酸kasamino acid)、l .5mg/l的2,4-0、68.5旨/1薦糖、36旨/1葡萄糖和100測(cè)乙酷下香酬）中） 在室溫下溫育5分鐘。將侵染胚W胚軸向下移至共培養(yǎng)PHI-T培養(yǎng)基（瓊脂凝固的修改的 PHI-I 培養(yǎng)基，含有 2.0mg/l 的2,4-D、20g/l 薦糖、lOg/1 葡萄糖、0.5g/l 的 MES、0.7g/l 脯氨 酸、lOmg/1抗壞血酸和IOOiiM乙酷下香酬)并在25°C下在黑暗中溫育3天。為靜息，將胚移至 補(bǔ)充有l(wèi)OOmg/1簇節(jié)青霉素的相同的培養(yǎng)基(沒(méi)有乙酷下香酬）中并在28°C下在黑暗中溫育 4天。
[0222] 愈合組織選擇：將胚移至第一選擇性培養(yǎng)基PHI-U(補(bǔ)充有1.5mg/l的2,4-D、 IOOmg^簇節(jié)青霉素和5mg/l的PPT而沒(méi)有葡萄糖和乙酷下香酬的上述PHI-T培養(yǎng)基)并在28 °(：下在黑暗中溫育2周隨后在含有1〇111肖八的??1'的選擇性培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。在10周的選擇 過(guò)程中對(duì)于剩余的愈合組織通過(guò)在相同的培養(yǎng)基上每2周繼代培養(yǎng)來(lái)增殖和維持愈合組織 的增生塊。
[0223] 植物再生和選擇:將耐除草劑愈合組織移至再生培養(yǎng)基I (補(bǔ)充有0.5mg/l激動(dòng)素 的PHI-U培養(yǎng)基)并在28°C下在黑暗中溫育2至3周用于愈合組織生長(zhǎng)和胚發(fā)育。將培養(yǎng)物移 至再生培養(yǎng)基IK具有〇.5mg/l玉米素、700mg/l脯氨酸、60g/l薦糖和lOOmg/1簇節(jié)青霉素的 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基）用于芽(shoot)的形成(28°C，黑暗中）。2-3周之后，將芽移至生根培養(yǎng)基(補(bǔ) 充有20g/l薦糖、0.5mg/l的NAA和0.5mg/l的IBA的再生II培養(yǎng)基)并在25°C，270地/WVs的 光強(qiáng)度下W16/她的光周期生長(zhǎng)。當(dāng)再生的植物為8-lOcm高時(shí)，可W將它們移至±壤并在溫 室條件下生長(zhǎng)。
[0224] 水稻的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0225] 本發(fā)明中提供的載體可W遵循先前所描述的流程用于水稻的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化（Herve and Kayano,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 213-222,Humana Press)。
[O。6]植物材料:將來(lái)自生長(zhǎng)在溫室中的梗米（japonica rice)種類(lèi)的成熟種子用作外 植體來(lái)源。
[0227]培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化和選擇:將脫殼的種子用70%的乙醇表面殺菌1分鐘并用3%的次氯酸 鋼表面殺菌30分鐘隨后用無(wú)菌蒸饋水洗涂六次。將種子W胚側(cè)向上鋪板在誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (Gelrite凝固的，補(bǔ)充有300mg/l酪蛋白氨基2.88g/l脯氨酸、30g/l薦糖和2mg/l的2,4-D的 N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基)并在32°C下在連續(xù)光照下溫育5天。用根瘤±壤桿菌菌株LBA4404(來(lái)自再懸 浮在補(bǔ)充有IOOiiM乙酷下香酬、68.5g^薦糖和36g/l葡萄糖的N6培養(yǎng)基中的3天鋪板的培養(yǎng) 物)在室溫下侵染具有膨脹的盾片的發(fā)芽種子2分鐘，隨后移至共培養(yǎng)基(Gelrite凝固的N6 培養(yǎng)基，含有300mg/l酪蛋白氨基酸、30g/l薦糖、lOg/1葡萄糖、2mg/l的2,4-D和IOOiiM乙酷 下香酬)并在25°C下在黑暗中溫育3天。
[02%]對(duì)于轉(zhuǎn)化的胚胎發(fā)生組織的選擇，將用250mg/l頭抱嚷目虧洗涂的整個(gè)巧苗移至含 有300mg/l酪蛋白氨基酸、2.88g/l脯氨酸、30g/l薦糖、2mg/l的2,4-D、100mg/l頭抱嚷月虧、 IOOmg^萬(wàn)古霉素和35111旨八的酸式硫酸鹽的N6瓊脂凝固的培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)物在32°C下在 連續(xù)光照下溫育2-3周。
[0229] 植物再生和選擇:將抗性的增生愈合組織移至含有300mg/l酪蛋白氨基酸、500mg/ 1脯氨酸、30g/l薦糖、lmg/1的NAA、5mg/l的ABA、2mg/l激動(dòng)素、lOOmg/1頭抱嚷目虧、lOOmg/1萬(wàn) 古霉素和2〇111旨八的6418酸式硫酸鹽的瓊脂凝固的N6培養(yǎng)基上。在32°C下在連續(xù)光照下生長(zhǎng) 一周之后，將成活的愈合組織移至補(bǔ)充有2g/l酪蛋白氨基酸、30g/l薦糖、30g/l山梨醇、 0.02mg/l的NAA、2mg/l激動(dòng)素、lOOmg/1頭抱嚷目虧、lOOmg/1萬(wàn)古霉素和20mg/l的G418酸式硫 酸鹽的MS培養(yǎng)基（用lOg/1的瓊脂糖凝固）并在相同的條件下另外溫育一周隨后移至具有 7g^瓊脂糖的相同的培養(yǎng)基上。2周之后，將出現(xiàn)的芽移至含有30g/l薦糖的Gelrite凝固的 不含激素的MS培養(yǎng)基上并在連續(xù)光照下生長(zhǎng)1-2周W促進(jìn)芽和根發(fā)育。當(dāng)再生的植物為8-IOcm高時(shí)，可W將它們移至±壤并在溫室條件下生長(zhǎng)。在10-16周之后收獲轉(zhuǎn)基因種子。
[0230] 用上壤桿菌遵循類(lèi)似的流程轉(zhuǎn)化釉稻（indica rice varieties) (Datta and Datta,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 201-212,Humana Press)。
[0231 ]甘薦的微粒轟擊介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0232] 可W將含有轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)盒與標(biāo)記基因（例如npt)的盒子通過(guò)基因槍 (biolistics)遵循先前描述的流程共同引入甘薦之中（Taparia et al.,2012,In VUro Cell.Dev.Biol.48:15-22)。
[0233] 植物材料:將具有6-8個(gè)可見(jiàn)節(jié)的溫室生長(zhǎng)的植物用作外植體來(lái)源。收集頂部并用 70%的乙醇表面殺菌。將最外的葉在無(wú)菌條件下移除并將未成熟的葉輪(leaf whorl)橫截 面(約2mm)由頂端節(jié)之上I-IOcm的區(qū)域切除。
[0234]培養(yǎng)起始、轉(zhuǎn)化和選擇:將分離的葉部分在補(bǔ)充有20g/l薦糖、1.86mg/l對(duì)氯苯氧 基乙酸(CPA)、1.86mg/l的NAA和0.09mg/l的BA的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上在28°C，在30皿ol/m2/s的 光強(qiáng)度和16/她的光周期下培養(yǎng)7天。將胚發(fā)生培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)至新鮮的培養(yǎng)基并用于轉(zhuǎn) 化。
[02：3日]為微粒轟擊(microprojectile bombardment)，將葉盤(pán)在基因轉(zhuǎn)移之前4小時(shí)鋪板 在補(bǔ)充有0.4M山梨醇的培養(yǎng)起始培養(yǎng)基上。將含有TF的表達(dá)盒和標(biāo)記基因的質(zhì)粒DNA (200ng)遵循先前所描述的流程沉淀在1 .Smg的金微粒(0.6皿)上(Altpeter and San^u, 2010,Genetic transformation-bioIistics,Davey&Anthony eds.,pp 217-237,Wiley, Hoboken)。將DNAQOng每次注射)通過(guò)PDS-1000 基因槍微粒遞送系統(tǒng)(Biorad)使用IlOOpsi 防爆片(rupture disk)、26.SmmHg的室真空和6cm.壓力的架距離遞送至外植體。將轟擊的 外植體移至上述的培養(yǎng)起始培養(yǎng)基并溫育4天。
[0236] 為選擇，將培養(yǎng)物移至補(bǔ)充有30mg/l遺傳霉素的起始培養(yǎng)基上并溫育10天繼W相 同條件下的另一選擇周期。
[0237] 植物再生和選擇:將培養(yǎng)物移至沒(méi)有CPA的上述選擇培養(yǎng)基上并在28°C，在10化 mol/mVs的光強(qiáng)度下用16/8h的光周期生長(zhǎng)。將具有小芽（約0.5cm)的葉盤(pán)平鋪在具有 30mg/l遺傳霉素的不含激素的培養(yǎng)基上用于芽的生長(zhǎng)和根的發(fā)育。在移至±壤之前，可W 將再生植物的根部浸入可商購(gòu)的根部促進(jìn)粉中。
[0238] 通過(guò)微粒轟擊的小麥的轉(zhuǎn)化
[0239] 本發(fā)明中提供的基因構(gòu)建體可W用于通過(guò)遵循先前所描述的流程的微粒轟擊的 小麥轉(zhuǎn)化(Weeks et al.，1993,Plant I^ysiol. 102:1077-1084)。
[0240] 植物材料:來(lái)自春小麥栽培屬BobwMte的植物，生長(zhǎng)在18-20°C日間和14-16°C夜 間溫度，1化的光周期下。在播種之后10-12周(開(kāi)花之后12-16天)收集麥穗。將處于早期-中 期乳熟期（early-medium milk stage)的單獨(dú)的穎果用70%的乙醇?xì)⒕?分鐘并用20%次 氯酸鋼殺菌15分鐘隨后用無(wú)菌水洗涂=次。
[0241] 培養(yǎng)起始、轉(zhuǎn)化和選擇:將未成熟的合子胚(0.5-1.5mm)在無(wú)菌條件下剖開(kāi)，盾片 側(cè)向上置于培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有20g/l薦糖和1.5mg/l的2,4-D的化ytagel凝固的MS培養(yǎng) 基)并在27°C在光下(43皿ol/WVs)溫育3-5天。
[0242] 為微粒轟擊，將源自胚的愈合組織在基因轉(zhuǎn)移之前4小時(shí)平鋪在補(bǔ)充有0.4M山梨 醇的培養(yǎng)起始培養(yǎng)基上。將含有TF的表達(dá)盒和標(biāo)記基因 bar的質(zhì)粒DNA沉淀在0.6皿的金微 粒上并如對(duì)甘薦所描述的遞送至外植體。
[0243] 將轟擊的外植體移至愈合組織選擇培養(yǎng)基(含有l(wèi)-2mg/l除草膚的上述培養(yǎng)起始 培養(yǎng)基)并每2周繼代培養(yǎng)。
[0244] 植物再生和選擇：在1-2個(gè)選擇周期之后，將培養(yǎng)物移至補(bǔ)充有0.5mg/l麥草畏 (dicamba)和2mg/l除草膚的MS再生培養(yǎng)基上。為根部形成，將得到的耐除草膚的芽移至不 含激素的半濃度MS培養(yǎng)基。將具有發(fā)育良好的根部的植物移至±壤并在移至溫室之前在21 °C下用16h的光周期(300皿ol/WVs)適應(yīng)較低的濕度約2周。
[0245] 歐洲油菜的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0246] 植物材料:將成熟種子在10%的商用漂白劑中隨著溫和搖動(dòng)表面殺菌30分鐘并用 無(wú)菌蒸饋水洗涂=次。
[0247] 培養(yǎng)起始和轉(zhuǎn)化:將種子平鋪在萌芽培養(yǎng)基(補(bǔ)充有30g/l薦糖的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基） 上并在24°C下用1化的光周期W60-8化E/mVs的光密度溫育4-5天。為轉(zhuǎn)化，將基部具有~ 2mm的葉柄的子葉自得到的巧苗切除，浸沒(méi)于根瘤±壤桿菌菌株EHAlOl懸浮液(在28°C下 4化生長(zhǎng)自5ml的補(bǔ)充有適當(dāng)?shù)目股氐淖畹团囵B(yǎng)基中的單個(gè)菌落）中Is并立即植入共培養(yǎng) 基巧有30g/l薦糖和20皿芐基腺嚷嶺的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中~2mm的深度。將接種的子葉在相 同的生長(zhǎng)條件下溫育4她。
[024引植物再生和選擇:在共同培養(yǎng)之后，將子葉移至包含補(bǔ)充有30g/l薦糖和芐基 腺嚷嶺、300mg^特美汀(timentin)和20111旨八硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基的再生培養(yǎng)基上。在 2-3周之后，將再生的芽切下并維持在含有30g/l薦糖、300111肖八特美汀和20mg^硫酸卡那霉 素的MS培養(yǎng)基上用于芽的伸長(zhǎng)。將伸長(zhǎng)的芽移至含有補(bǔ)充有30g/l薦糖、2mg/l嗎I噪下酸 (IBA)和500mg/L簇節(jié)青霉素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基上。在根部形成之后，將植物移 至±壤并在生長(zhǎng)室或溫室條件下生長(zhǎng)至種子成熟。
[0249] 大豆的±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0250] 將在本發(fā)明中確定的柳枝泰轉(zhuǎn)錄因子基因的大豆直系同源物（圖4)裝配至二重運(yùn) 載體中（表9)并遵循先前所描述的流程用于±壤桿菌介導(dǎo)的大豆的轉(zhuǎn)化化O et al. ,2006， Agrobacterium Protocols Wang K.，ed.,Vol.1,PP 397-405,Humana Press)。
[0251] 植物材料:將來(lái)自生長(zhǎng)在溫室或田地條件下的大豆植物的未成熟種子用作外植體 來(lái)源。收獲幼小的豆芙并用70%的2-丙醇表面殺菌30秒和25%次氯酸鋼(Clorox)表面殺菌 20分鐘隨后用無(wú)菌蒸饋水洗涂=次。
[0252] 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化和選擇:在無(wú)菌條件下，將未成熟種子自豆芙移出并將子葉與種皮分 離隨后在補(bǔ)充有30g/l薦糖、4〇111旨八的2,4-〇和40mg/l乙酷下香酬的共培養(yǎng)基(MS鹽和B5維 生素）中的根瘤上壤桿菌培養(yǎng)物(在28°C下由單個(gè)菌落生長(zhǎng)過(guò)夜）中溫育60分鐘。將侵染的 外植體遠(yuǎn)軸側(cè)向上鋪板在瓊脂凝固的共培養(yǎng)基上并在25°C下在黑暗中溫育4天。
[0253] 對(duì)于轉(zhuǎn)化組織的選擇，將用500mg/l頭抱嚷目虧洗涂的子葉遠(yuǎn)軸側(cè)向上置于用于體 細(xì)胞胚形成的誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上(含有30g/l薦糖、40mg/l的2,4-D、500mg/l頭抱嚷目虧和IOmg/ 1潮霉素的GelrUe凝固的MS培養(yǎng)基)并在25°C下W23h的光周期（10-20地/mVs)溫育2周。 在25mg/l潮霉素的存在下在相同的條件下生長(zhǎng)另外的兩周之后，將耐抗生素的體細(xì)胞胚移 至補(bǔ)充有60g/l麥芽糖、500mg/l頭抱嚷目虧和1〇111旨八潮霉素的用于胚成熟的MS培養(yǎng)基上并W 2周的繼代培養(yǎng)區(qū)間在相同的條件下生長(zhǎng)8周。
[0254] 植物再生和選擇:將得到的子葉階段的胚在25°C下在23h的光周期（60-80地/m2/ S)下干膽(desiccate)5-7天隨后在含有30g/l薦糖和500mg/l頭抱嚷目虧的MS再生培養(yǎng)基上 培養(yǎng)4-6周用于芽和根的發(fā)育。當(dāng)植物為5-lOcm高時(shí)，將它們移至±壤并在環(huán)境適應(yīng)7天之 后在溫室中生長(zhǎng)。
[0255] 實(shí)施方式1.一種轉(zhuǎn)基因植物，包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物具 有比不包含所述異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相同種類(lèi)的植物至少5%、至少10%、至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C〇2同化速率。
[0256] 實(shí)施方式2. -種轉(zhuǎn)基因植物，包含異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物具 有比不包含所述異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相同種類(lèi)的植物至少5%、至少10%、至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更低的降低的蒸騰速率。
[0257] 實(shí)施方式3. -種轉(zhuǎn)基因植物，用包含與編碼異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的多核巧酸可操 作地連接的可植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的重組DNA構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)化。
[0258] 實(shí)施方式4.根據(jù)實(shí)施方式1-3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，不存在異源的碳 酸酢酶。
[0259] 實(shí)施方式5.根據(jù)實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體局部化于葉綠體被膜。
[0260] 實(shí)施方式6.根據(jù)實(shí)施方式1-5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌。
[0261] 實(shí)施方式7.根據(jù)實(shí)施方式6所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是BicA 多膚或訊tA多膚。
[0262] 實(shí)施方式8.根據(jù)實(shí)施方式7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述BicA多膚包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。
[0263] 實(shí)施方式9.根據(jù)實(shí)施方式7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述SbtA多膚包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與SEQ ID N0:2 95%同源的氨基酸序列。
[0264] 實(shí)施方式10.根據(jù)實(shí)施方式1-9中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，編碼所述碳酸 氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的多核巧酸進(jìn)一步包含與碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列可操作地連接的編碼葉綠 體被膜祀向膚的序列。
[0265] 實(shí)施方式11.根據(jù)實(shí)施方式10所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述葉綠體被膜祀向膚的 序列包含沈Q ID NO: 10的氨基酸1至110。
[0266] 實(shí)施方式12.根據(jù)實(shí)施方式11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自 藻類(lèi)。
[0267] 實(shí)施方式13.根據(jù)實(shí)施方式12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述藻類(lèi)是衣藻屬。
[0268] 實(shí)施方式14.根據(jù)實(shí)施方式13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是 CCPl多膚、CCP2多膚或LCIA多膚。
[0269] 實(shí)施方式15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述CCPl多膚包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。
[0270] 實(shí)施方式16.根據(jù)實(shí)施方式14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述LCIA多膚包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。
[0271] 實(shí)施方式17.根據(jù)實(shí)施方式1-16中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其是選自由W下所 組成的組的油類(lèi)作物植物:玻璃宦、蕓苔、歐洲油菜、憲菁、亞麻莽屬、大麻、紅花、挪子、海甘 藍(lán)、專(zhuān)距花屬、非洲油棟桐、美洲油棟桐、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見(jiàn) 草、油橄攬、水稻、篇麻、芝麻、小麥屬、玉米屬、胡桃和扁桃。
[0272] 實(shí)施方式18.根據(jù)實(shí)施方式1-17中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物是亞 麻莽。
[0273] 實(shí)施方式19.根據(jù)實(shí)施方式1-18中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，包含至少兩種異源 碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[0274] 實(shí)施方式20.-種重組體多核巧酸，包含與可植物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地 連接的編碼異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列，其中，所述編碼碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序列 可選地進(jìn)一步可操作地連接至編碼葉綠體被膜祀向膚的核酸序列。
[0275] 實(shí)施方式21.根據(jù)實(shí)施方式20所述的重組體多核巧酸，其中，所述葉綠體被膜祀向 膚是擬南芥Tic20(atTic20)前體的轉(zhuǎn)運(yùn)膚。
[0276] 實(shí)施方式22.根據(jù)實(shí)施方式21所述的重組體多核巧酸，其中，所述核酸序列包含 沈Q ID NO:9的殘基 1-330。
[0277] 實(shí)施方式23.根據(jù)實(shí)施方式20-22中任一項(xiàng)所述的重組體多核巧酸，其中，所述碳 酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌。
[0278] 實(shí)施方式24.根據(jù)實(shí)施方式20-23中任一項(xiàng)所述的重組體多核巧酸，其中，所述碳 酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是BicA多膚或訊tA多膚。
[0279] 實(shí)施方式25.根據(jù)實(shí)施方式24所述的重組體多核巧酸，其中，所述BicA多膚包含 SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。
[0280] 實(shí)施方式26.根據(jù)實(shí)施方式24所述的重組體多核巧酸，其中，所述SbtA多膚包含 SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與SEQ ID N0:2 95%同源的氨基酸序列。
[0281 ]實(shí)施方式27.根據(jù)實(shí)施方式20所述的重組體多核巧酸，其中，所述碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體 來(lái)自藻類(lèi)。
[0282] 實(shí)施方式28.根據(jù)實(shí)施方式27所述的重組體多核巧酸，其中，所述藻類(lèi)是衣藻屬。
[0283] 實(shí)施方式29.根據(jù)實(shí)施方式20、27或28中任一項(xiàng)所述的重組體多核巧酸，其中，所 述碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是CCPl多膚、CCP2多膚或LCIA多膚。
[0284] 實(shí)施方式30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的重組體多核巧酸，其中，所述CCPl多膚包含 SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。
[0285] 實(shí)施方式31.根據(jù)實(shí)施方式29所述的重組體多核巧酸，其中，所述LCIA多膚包含 SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。
[0286] 實(shí)施方式32.根據(jù)實(shí)施方式20-31中任一項(xiàng)所述的重組體多核巧酸，進(jìn)一步包含編 碼選自FLAG、6X化S、谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、HA、cMyc或AcV5的表位標(biāo)記的核酸。
[0287] 實(shí)施方式33.-種植物可表達(dá)的表達(dá)載體，包含根據(jù)實(shí)施方式20-32中任一項(xiàng)所述 的重組體多核巧酸。
[0288] 實(shí)施方式34.根據(jù)實(shí)施方式33所述的植物可表達(dá)的表達(dá)載體，包含祀arleyGate載 體。
[0289] 實(shí)施方式35.-種生產(chǎn)具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法包括用 根據(jù)實(shí)施方式20-32中任一項(xiàng)所述的重組體多核巧酸或根據(jù)實(shí)施方式33-34中任一項(xiàng)所述 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；由所述植物細(xì)胞生長(zhǎng)植物直至所述植物產(chǎn)生種子；W及由其中 相比未表達(dá)所述異源碳酸氨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相應(yīng)的植物相比光合作用增強(qiáng)的植物選擇種子。
[0290] 實(shí)施方式36.根據(jù)實(shí)施方式35所述的方法，其中，所述植物是選自由W下所組成的 組的油類(lèi)作物植物:玻璃宦、蕓苔、歐洲油菜、憲菁、亞麻莽屬、大麻、紅花、挪子、海甘藍(lán)、專(zhuān) 距花屬、非洲油棟桐、美洲油棟桐、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見(jiàn)草、油 橄攬、水稻、篇麻、芝麻、小麥屬、玉米屬、胡桃和扁桃。
[0291] 實(shí)施方式37.根據(jù)實(shí)施方式36所述的方法，其中，所述植物是亞麻莽。
[0292] 實(shí)施方式38.根據(jù)實(shí)施方式35-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將光合作用的增強(qiáng) 測(cè)量為相對(duì)于野生型C〇2同化速率的增加或蒸騰速率的降低。
[0293] 實(shí)施方式39.根據(jù)實(shí)施方式35-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中，光合作用增強(qiáng)至少 5%。
[0294] 實(shí)施方式40.-種嵌合蛋白，包含擬南芥atTic20轉(zhuǎn)運(yùn)膚和與葉綠體被膜異源的膜 蛋白。
[02M]除非上下文另外明確表示，如在本文中所使用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"、和"該" 包括復(fù)數(shù)指示物。
[0296] 數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。貫穿本說(shuō)明書(shū)中給出的每個(gè)最大的數(shù)字限制旨 在包括每個(gè)較低的數(shù)字限制，如同該較低的數(shù)字限制明確地寫(xiě)入本文中。貫穿本說(shuō)明書(shū)中 給出的每個(gè)最小的數(shù)字限制將包括每個(gè)較高的數(shù)字限制，如同該較高的數(shù)字限制明確地寫(xiě) 入本文中。貫穿本說(shuō)明書(shū)中給出的每個(gè)數(shù)值范圍將包括每個(gè)較窄的數(shù)字限制(落在較寬的 數(shù)字范圍），如同該較窄的數(shù)字限制明確地寫(xiě)入本文中。與數(shù)量相關(guān)聯(lián)使用的修飾語(yǔ)"約"包 括所述值，并具有上下文所表示的含義(例如，包括與特定數(shù)量的測(cè)量有關(guān)的誤差程度）。
[0297] 本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，包括發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳模式。 當(dāng)閱讀前述描述時(shí)，那些優(yōu)選實(shí)施方式的變化對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W變得顯而易見(jiàn)。 發(fā)明人期望技術(shù)人員視情況采用運(yùn)種變化，并且發(fā)明人希望W與本文中具體地描述的不同 地實(shí)施本發(fā)明。因此，如由適用的法律允許的，本發(fā)明包括如在附加于此的權(quán)利要求中陳述 的主題的所有變化和等同物。此外，在所有可能的變化中W上描述的要素的任何組合是由 本發(fā)明所包括，除非在本文中另有指出或另外與上下文明顯矛盾。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種轉(zhuǎn)基因植物，包含異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物具有比不包含所 述異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相同物種的植物至少5 %、至少10%、至少15%、至少20 %、至少 25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C02同化速率。2. -種轉(zhuǎn)基因植物，包含異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物具有比不包含所 述異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相同物種的植物至少5 %、至少10%、至少15%、至少20 %、至少 25%、至少30%、至少35%或至少40%更低的降低的蒸騰速率。3. -種轉(zhuǎn)基因植物，用包含與編碼異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的多核苷酸可操作地連接的植 物能夠表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的重組DNA構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)化。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，不存在異源的碳酸酐酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體局部化于 葉綠體被膜。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自藍(lán)藻 細(xì)囷。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是BicA多肽或SbtA多 肽。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述BicA多肽包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述SbtA多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸 序列或與SEQ ID NO:2 95%同源的氨基酸序列。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，編碼所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的 多核苷酸進(jìn)一步包含與碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼序列可操作地連接的編碼葉綠體被膜靶向肽 的序列。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述葉綠體被膜靶向肽的序列包含SEQ ID NO: 10的氨基酸1至110。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自藻類(lèi)。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述藻類(lèi)是衣藻屬物種。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是CCP1多肽、CCP2 多肽或LCIA多肽。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述CCP1多肽包含SEQ ID N0:6的氨基 酸序列或與SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述LCIA多肽包含SEQ ID N0:8的氨基 酸序列或與SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其是選自由以下所組成的組的油 類(lèi)作物植物:玻璃苣、蕓苔、歐洲油菜、蕪菁、亞麻薺屬物種、大麻、紅花、椰子、海甘藍(lán)、萼距 花屬物種、非洲油棕櫚、美洲油棕櫚、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見(jiàn)草、 油橄欖、水稻、篦麻、芝麻、小麥屬物種、玉米屬、胡桃和扁桃。18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物是亞麻薺。19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，包含至少兩種異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn) 體。20. -種重組體多核苷酸，包含 與植物能夠表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接的編碼異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸序 列，其中，編碼所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的所述核酸序列可選地進(jìn)一步可操作地連接至編碼葉 綠體被膜靶向肽的核酸序列。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的重組體多核苷酸，其中，所述葉綠體被膜靶向肽是擬南芥 Tic20(atTic20)前體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組體多核苷酸，其中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:9的 殘基1-330。23. 根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體 來(lái)自藍(lán)藻細(xì)菌。24. 根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體 是BicA多肽或SbtA多肽。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組體多核苷酸，其中，所述BicA多肽包含SEQ ID N0:4的 氨基酸序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組體多核苷酸，其中，所述SbtA多肽包含SEQ ID NO:2的 氨基酸序列或與SEQ ID NO:2 95%同源的氨基酸序列。27. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自藻類(lèi)。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組體多核苷酸，其中，所述藻類(lèi)是衣藻屬物種。29. 根據(jù)權(quán)利要求20、27或28中任一項(xiàng)所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)體是CCP1多肽、CCP2多肽或LCIA多肽。30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的重組體多核苷酸，其中，所述CCP1多肽包含SEQ ID NO:6的 氨基酸序列或與SEQ ID NO:6 95%同源的氨基酸序列。31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的重組體多核苷酸，其中，所述LCIA多肽包含SEQ ID NO:8的 氨基酸序列或與SEQ ID NO:8 95%同源的氨基酸序列。32. 根據(jù)權(quán)利要求20-31中任一項(xiàng)所述的重組體多核苷酸，進(jìn)一步包含編碼選自FLAG、6 XHis、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、HA、cMyc或AcV5的表位標(biāo)記的核酸。33. -種植物能夠表達(dá)的表達(dá)載體，包含根據(jù)權(quán)利要求20-32中任一項(xiàng)所述的重組體多 核苷酸。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的植物能夠表達(dá)的表達(dá)載體，包含pEarleyGate載體。35. -種生產(chǎn)具有增強(qiáng)的光合作用的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法包括 用權(quán)利要求20-32中任一項(xiàng)所述的重組體多核苷酸或權(quán)利要求33-34中任一項(xiàng)所述的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； 由所述植物細(xì)胞生長(zhǎng)植物直至所述植物產(chǎn)生種子；以及 選擇與不表達(dá)所述異源碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相應(yīng)植物相比光合作用增強(qiáng)的植物的種子。36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述植物是選自由以下所組成的組的油類(lèi)作物 植物:玻璃苣、蕓苔、歐洲油菜、蕪菁、亞麻薺屬物種、大麻、紅花、椰子、海甘藍(lán)、萼距花屬物 種、非洲油棕櫚、美洲油棕櫚、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見(jiàn)草、油橄欖、 水稻、篦麻、芝麻、小麥屬物種、玉米屬、胡桃和扁桃。37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述植物是亞麻薺屬。38. 根據(jù)權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將光合作用的增強(qiáng)測(cè)量為相對(duì)于 野生型，C02同化速率的增加或蒸騰速率的降低。39. 根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中，光合作用增強(qiáng)至少5%。40. -種嵌合蛋白，包含擬南芥atTic20轉(zhuǎn)運(yùn)肽和與葉綠體被膜異源的膜蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK105873940SQ201480071736
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年12月24日
【發(fā)明人】丹尼·J·施內(nèi)爾, 邁恩·O·卡納克吉, 比賓·保羅斯, 米歇爾·達(dá)科斯塔
【申請(qǐng)人】馬薩諸塞大學(xué)