一種含有枯草菌素的生物飼料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有枯草菌素的生物飼料及其制備方法，制備方法包括：配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.1～0.2％、葡萄糖0.4～0.6％、尿素0.1～0.2％、磷酸氫二鉀0.2～0.4％、磷酸二氫鉀0.1～0.2％、硫酸鎂0.04～0.06％、酵母膏0.01～0.03％，pH值調(diào)為7.0～7.2；均為質(zhì)量百分含量；將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在100～120℃下滅菌10～20分鐘，冷卻至30～40℃后，先添加化合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為30～50μg/g，再按4～6％的接種量接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)18～24小時，控制pH值為7.0～7.2；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。添加本發(fā)明活性枯草菌素的飼料提高了圍產(chǎn)前期奶牛血清IgM、IgA和IgG含量，進而可以提高圍產(chǎn)前期奶牛抵抗疾病的能力。
【專利說明】
一種含有枯草菌素的生物飼料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物飼料領(lǐng)域，涉及抗菌肽，具體涉及一種含有枯草菌素的生物飼料 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 枯草芽孢桿菌基我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，已被越來 越多的研制成微生物制劑。其制劑是無毒、無殘留、無污染的"綠色"添加劑，具有廣闊的發(fā) 展前景，現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用，顯示出了巨大的社會效益和生態(tài)效益?？莶?芽孢桿菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產(chǎn)生抗菌素，在動物腸道內(nèi)具有較 強生物奪氧能力，這些特性對促進動物營養(yǎng)的消化吸收、提高動物的飼料轉(zhuǎn)化率和防病，促 進生長起到重要作用。目前在工業(yè)化生產(chǎn)中，仍然存在發(fā)酵周期長、芽孢形成率低、成本高 等問題。筆者對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了研究，以期提高枯草芽孢桿菌 的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。
[0003] 抗菌肽是一類由動植物和微生物機體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的、具有殺菌活性并與機體先天 性免疫緊密相關(guān)的特定功能的小分子多肽。經(jīng)過近四十年的研究，已有1500種肽被證實具 有高效的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性，并在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在國外，醫(yī) 藥上有多黏菌素和短桿菌肽S、達托霉素和恩夫韋地四種藥品進入市場，另有十幾個藥品進 入臨床試驗階段。作為食品防腐劑的乳鏈菌肽已經(jīng)在50多個國家被廣泛應(yīng)用;將抗菌肽基 因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，是培育作物抗病新品種的有效途徑。
[0004] 枯草菌素是從枯草芽孢桿菌中分離到的一種抗菌肽?？莶菥乜梢杂糜谏镲暳?的添加劑，可以提高牲畜的抗病菌能力，提高免疫力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種高活性的枯草菌素，以用于生物飼料的添加劑， 顯著改善牲畜的抗病菌能力，提高免疫力；
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種含有上述高活性枯草菌素的生物飼料。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0008] -種活性枯草菌素，通過如下步驟制備而成：
[0009] 步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.1~0.2 %、葡萄糖0.4~0.6 %、尿素 0.1~ 0·2%、磷酸氫二鉀0·2~0·4%、磷酸二氫鉀0· 1~0·2%、硫酸鎂0·04~0·06%、酵母膏0·01 ~0.03%，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分含量；
[0010] 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在100~120 °C下滅菌10~20分鐘，冷卻至30~40 °C后， 先添加化合物此丨6仰〇1^1111，使其在培養(yǎng)液中的濃度為30~5(^8/^，再按4~6%的接種 量接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)18~24小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0011] 步驟S3，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0012] 進一步地，所述的活性枯草菌素通過如下步驟制備而成：
[0013] 步驟SI，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.15%、磷酸氫二鉀 0.3 %、磷酸二氫鉀0.15 %、硫酸鎂0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百 分含量；
[0014] 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在110°C下滅菌15分鐘，冷卻至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為40yg/g，再按5%的接種量接入枯草芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)21小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0015] 步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0016] 進一步地，所述的活性枯草菌素通過如下步驟制備而成：
[0017]步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.1 %、葡萄糖0.4 %、尿素0.1 %、磷酸氫二鉀 0.2%、磷酸二氫鉀0.1 %、硫酸鎂0.04%、酵母膏0.01 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分 含量；
[0018] 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在100°C下滅菌20分鐘，冷卻至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為30yg/g，再按4%的接種量接入枯草芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)24小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0019] 步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0020] 進一步地，所述的活性枯草菌素通過如下步驟制備而成：
[0021 ]步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.2 %、葡萄糖0.6 %、尿素0.2 %、磷酸氫二鉀 0.4%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.06%、酵母膏0.03%，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分 含量；
[0022]步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在120°C下滅菌10分鐘，冷卻至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為50yg/g，再按6%的接種量接入枯草芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)18小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0023]步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0024]上述活性枯草菌素作為生物飼料添加劑的用途。
[0025]進一步地，上述活性枯草菌素在生物飼料中的添加量為80~120g/100kg。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0027] 本發(fā)明提供的活性枯草菌素生物活性高，添加到飼料中后，可以顯著改善圍產(chǎn)前 期奶牛的免疫功能。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0029] 本發(fā)明中，未做特別強調(diào)的試驗方法和試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試驗方法和試劑。化 合物Heteroclitin J的制備方法參見文獻:Compounds from Kadsura heteroclita and related anti-HIV activity,Phytochemistry,69(2008)1266-1272〇
[0030] 實施例1:活性枯草菌素的制備
[0031] 步驟SI，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.15%、磷酸氫二鉀 0.3 %、磷酸二氫鉀0.15 %、硫酸鎂0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百 分含量；
[0032]步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在110°C下滅菌15分鐘，冷卻至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為40yg/g，再按5%的接種量接入枯草芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)21小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0033]步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0034]實施例2:活性枯草菌素的制備
[0035]步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.1 %、葡萄糖0.4 %、尿素0.1 %、磷酸氫二鉀 0.2%、磷酸二氫鉀0.1 %、硫酸鎂0.04%、酵母膏0.01 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分 含量；
[0036]步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在100°C下滅菌20分鐘，冷卻至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為30yg/g，再按4%的接種量接入枯草芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)24小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0037]步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0038]實施例3:活性枯草菌素的制備
[0039]步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.2 %、葡萄糖0.6 %、尿素0.2 %、磷酸氫二鉀 0.4%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.06%、酵母膏0.03%，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分 含量；
[0040] 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在120°C下滅菌10分鐘，冷卻至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為50yg/g，再按6%的接種量接入枯草芽孢桿 菌發(fā)酵培養(yǎng)18小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0041] 步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0042] 實施例4:實施例1的對比，不添加化合物Heteroclitin J
[0043]步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.15%、磷酸氫二鉀 0.3 %、磷酸二氫鉀0.15 %、硫酸鎂0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百 分含量；
[0044] 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在110°C下滅菌15分鐘，冷卻至30~40°C后，按5%的接 種量接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)21小時，控制pH值為7.0~7.2;
[0045] 步驟S3,發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。
[0046] 實施例5:效果實施例，對圍產(chǎn)前期奶牛免疫功能的影響
[0047] 一、材料與方法
[0048] 1、材料:按照實施例1~4的方法制備活性枯草菌素1~4。
[0049] 2、方法
[0050] 2.1試驗動物及分組
[0051]選取30頭處于干奶期（產(chǎn)前4周）、體況評分相近（3.25~3.75)、胎次相近（3~4 胎）、預(yù)產(chǎn)期相近的中國荷斯坦奶牛。隨機分成5組，每組6頭。對照組采用基礎(chǔ)飼糧飼喂。試 驗組1~4分別在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別添加100g/100kg的實施例1~4制備的活性枯草菌 素1~4。
[0052] 2.2飼養(yǎng)方法
[0053]奶牛集中飼養(yǎng)于同一棟棚舍式拴系牛舍中，試驗期為3周，預(yù)飼期1周，從預(yù)產(chǎn)前4 周(產(chǎn)前28d)開始，持續(xù)到分娩當(dāng)天。試驗期間采用常規(guī)飼養(yǎng)及免疫，自由采食、自由飲水。 [0054] 2.3樣品的收集與處理
[0055]分別在產(chǎn)前14、7d和分娩當(dāng)天，尾靜脈采集血液20ml，其中取5ml用一次性真空采 血管(EDTA)收集，用于測定全血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞含量;5ml用一次性真空采血管(肝素)收 集，用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗；另取l〇ml用一次性真空采血管(無抗凝劑)收集，3000rpm離心 15min，分離制得血清，-20°C冷凍保存。測定血清中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA) 和免疫球蛋白G(IgG)的含量。
[0056] 2.4檢測指標(biāo)和方法
[0057]飼料中干物質(zhì)（DM)、粗蛋白（CP)、中性洗滌纖維（NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣 (Ca)、磷(P)的含量測定采用《飼料分析與質(zhì)量檢測技術(shù)》方法。血清中免疫球蛋白IgM、IgA 和IgG采用免疫透射比濁法檢測。
[0058] 3、數(shù)據(jù)處理
[0059]試驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進行方差分析，差異顯著性進行Duncans多重比較，表 中數(shù)值表示為Mean 土 SD。
[0060] 二、結(jié)果
[0061] 活性枯草菌素對圍產(chǎn)前期奶牛免疫功能的影響見表1。
[0062]由表1可知，試驗組1~3分別在分娩前14、7、0天的血清IgM、IgA和IgG均高于對照 組，與對照組相比差異顯著(P<〇.〇5);試驗組4在分娩前14、7、0天的血清IgM、IgA和IgG與 對照組無顯著性差異(P>〇.05)，提高不明顯。
[0063] 表1對圍產(chǎn)前期奶牛免疫功能的影響
[0064]
[0065] 結(jié)果表明，添加本發(fā)明活性枯草菌素的飼料提高了圍產(chǎn)前期奶牛血清IgM、IgA和 IgG含量，進而可以提高圍產(chǎn)前期奶牛抵抗疾病的能力。
[0066] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種活性枯草菌素，其特征在于，通過如下步驟制備而成： 步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.1~0.2%、葡萄糖0.4~0.6 %、尿素0.1~0.2 %、磷 酸氫二鉀0.2~0.4%、磷酸二氫鉀0.1~0.2 %、硫酸鎂0.04~0.06 %、酵母膏0.01~ 0.03%，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分含量； 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在100~120 °C下滅菌10~20分鐘，冷卻至30~40 °C后，先添 加化合物Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為30~50yg/g，再按4~6%的接種量接 入枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)18~24小時，控制pH值為7.0~7.2; 步驟S3，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性枯草菌素，其特征在于，通過如下步驟制備而成： 步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.15 %、葡萄糖0.5 %、尿素0.15 %、磷酸氫二鉀 0.3 %、磷酸二氫鉀0.15 %、硫酸鎂0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百 分含量； 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在110°C下滅菌15分鐘，冷卻至30~40 °C后，先添加化合物 Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為40yg/g，再按5%的接種量接入枯草芽孢桿菌發(fā) 酵培養(yǎng)21小時，控制pH值為7.0~7.2; 步驟S3，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性枯草菌素，其特征在于，通過如下步驟制備而成： 步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.1 %、葡萄糖0.4%、尿素0.1 %、磷酸氫二鉀0.2%、 磷酸二氫鉀〇. 1 %、硫酸鎂〇. 04%、酵母膏0.01 %，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分含量； 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在100 °C下滅菌20分鐘，冷卻至30~40 °C后，先添加化合物 Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為30yg/g，再按4%的接種量接入枯草芽孢桿菌發(fā) 酵培養(yǎng)24小時，控制pH值為7.0~7.2; 步驟S3，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性枯草菌素，其特征在于，通過如下步驟制備而成： 步驟S1，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，含淀粉0.2 %、葡萄糖0.6 %、尿素0.2 %、磷酸氫二鉀0.4 %、 磷酸二氫鉀〇. 2%、硫酸鎂0.06%、酵母膏0.03%，pH值調(diào)為7.0~7.2;均為質(zhì)量百分含量； 步驟S2,將上述發(fā)酵培養(yǎng)液在120°C下滅菌10分鐘，冷卻至30~40 °C后，先添加化合物 Heteroclitin J，使其在培養(yǎng)液中的濃度為50yg/g，再按6%的接種量接入枯草芽孢桿菌發(fā) 酵培養(yǎng)18小時，控制pH值為7.0~7.2; 步驟S3，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)液冷凍干燥得到活性枯草菌素。5. 權(quán)利要求1~4任一所述活性枯草菌素作為生物飼料添加劑的用途。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于:添加量為80~120g/100kg。
【文檔編號】C12P21/00GK105838762SQ201610298651
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】肖方方, 方華, 季春源, 孫中超, 季偉, 崔林
【申請人】江蘇鹽城源耀生物科技有限公司