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一種同時(shí)檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的pcr方法

文檔序號:9804626閱讀:389來源:國知局
一種同時(shí)檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域,具體涉及一種非疾病診斷目的同時(shí)檢測異育銀 鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 粘孢子蟲(Myxosporeans)是一類世界分布的后生動(dòng)物寄生蟲,屬于粘體動(dòng)物門, 除少數(shù)種類寄生于兩棲類、爬行類、鳥類,甚至哺乳類外,大部分寄生于魚類,其中部分種類 能導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類重大病害的發(fā)生,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失與生態(tài)污染。異育銀鯽是我國重要 的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類,近年來,隨著新品系的成功培育及養(yǎng)殖技術(shù)的推廣,其養(yǎng)殖規(guī)模不斷 擴(kuò)大,但隨之而來的病害也日趨嚴(yán)重,病害問題已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸 因素。
[0003] 洪湖碘泡蟲、武漢單極蟲、吳李碘泡蟲、丑陋圓形碘泡蟲是危害異育銀鯽養(yǎng)殖最為 嚴(yán)重的粘孢子蟲。洪湖碘泡蟲(Myxobolus honhuensis)是異育銀鯽"喉孢子蟲病"病原體, 主要危害異育銀鯽的苗種培育,其靶組織為魚體咽部,病害爆發(fā)后在咽部形成肉眼可見的 孢囊,魚體主要癥狀為不食、游動(dòng)遲緩、咽部腫脹、鰓蓋外翻、眼球外凸、出血等,每年5-10月 為流行季節(jié),5-7月為病害高發(fā)期,感染率可達(dá)60%,最高死亡率可達(dá)100%;武漢單極蟲 (Thelohanellus wuhanensis)是異育銀鯽"膚孢子蟲病"病原體,主要危害異育銀鯽的苗種 培育,能與洪湖碘泡蟲同期感染,其靶組織為魚體體表,在體表形成肉眼可見的小孢囊,使 魚體消瘦,畸形,生長緩慢,甚至大規(guī)模死亡,對苗種培育造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失;吳李碘泡蟲 (M.wulii)是"腹孢子蟲病"病原體,主要寄生于魚體的肝胰臟,形成肉眼可見的大孢囊,患 病魚表現(xiàn)為腹部膨大,內(nèi)臟萎縮,肝胰臟組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,甚至被孢囊完全代替,最終 導(dǎo)致魚體的死亡;丑陋圓形碘泡蟲(M. turpisrotundus)主要寄生于異育銀鯽的鮑蓋、鮑弓、 口腔內(nèi)外、鰭條等多個(gè)器官組織內(nèi),形成大小不一的肉眼可見孢囊,患病魚死亡率不高,但 嚴(yán)重影響商品魚的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0004] 粘孢子蟲具有復(fù)雜的生活史,研究表明粘孢子蟲在魚體中的發(fā)育一般要經(jīng)過營養(yǎng) 體和成熟孢子(孢囊)階段。在我國,粘孢子蟲病的檢測主要以顯微鏡下可見成熟孢子、肉眼 可見孢囊為依據(jù),而一旦粘孢子蟲在魚體內(nèi)形成成熟的孢子或孢囊,沒有任何有效藥物能 夠滲入成熟孢子堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼。因此,有必要建立一種簡單快速的早期檢測方法,在粘 孢子蟲的營養(yǎng)體階段進(jìn)行藥物防治,有效地防控粘孢子蟲病的病害。
[0005] 在粘孢子蟲的檢測方面,以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)檢測方法,雖然 操作簡便,但存在檢測滯后、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低、易于漏檢等問題;以抗原與抗體反應(yīng)為基礎(chǔ) 的免疫學(xué)檢測方法,雖然具有靈敏性高、能進(jìn)行早期檢測的特點(diǎn),但由于粘孢子蟲生活史中 存在期、屬特異性抗原以及共同抗原,交叉反應(yīng)嚴(yán)重,增加了種特異性檢測的難度;以PCR技 術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測方法具有較高的特異性與靈敏性,已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于寄生蟲的 早期檢測中。
[0006] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn),于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加 入多對特異性引物,針對多個(gè)模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù),可 用于同時(shí)檢測多種病原體。該方法不僅能早期檢測,靈敏性高,特異性強(qiáng),而且同普通PCR方 法相比具有省時(shí)省力、簡單快速等優(yōu)點(diǎn)。目前,國內(nèi)外尚無同時(shí)對異育銀鯽寄生的多種粘孢 子蟲進(jìn)行早期檢測的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于異育銀鯽寄生粘孢子蟲早期檢測方法的缺乏,本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測四種 寄生于異育銀鯽的粘孢子蟲的PCR方法,該方法靈敏性高,特異性強(qiáng),操作簡單,有利于異育 銀鯽的養(yǎng)殖,能夠產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0008] 上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009] -種非疾病診斷目的同時(shí)檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法,包括以下 步驟:
[0010] (l)DNA提取:剪取異育銀鯽皮膚、鰓、咽及肝胰臟四個(gè)部位的部分組織,混合后置 于研缽中,剪碎并加入液氮充分研磨,然后提取組織樣品DNA;
[0011] (1)特異性DNA片段擴(kuò)增:分別以丑陋圓形碘泡蟲的18S rRNA、吳李碘泡蟲與洪湖 碘泡蟲的ITS1-5.8S-ITS2、武漢單極蟲的28S rRNA基因?yàn)榉肿影袠?biāo),各設(shè)計(jì)一對特異性引 物,分別命名為Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R;將四對引物置于單個(gè)PCR反 應(yīng)體系中,同時(shí)擴(kuò)增四種粘孢子蟲的特異性基因片段;
[0012] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行結(jié)果判定,其中:擴(kuò)增 出894bp條帶的是丑陋圓形碘泡蟲,590bp的是吳李碘泡蟲,447bp的是洪湖碘泡蟲,245bp的 是武漢單極蟲,
[0013]所述的四對特異性引物序列分別為:
[0014] Mtl8S F:5'-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3'
[0015] Mtl8S R:5'-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3'
[0016] MwITS F:5'-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3'
[0017] MwITS R:5'-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3'
[0018] MhITS F:5'-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3'
[0019] MhITS R:5'-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3'
[0020] Tw28S F:5'-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3'
[0021] Tw28S R:5 '-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3 '。
[0022] 優(yōu)選地,步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系為:
[0023] DNA擴(kuò)增模板2yL、10XPCR Buffer 2.5yL、25mM Mg2+3.0yL、2.5mM dNTPs4yL、5UAi L TaqDNA聚合酶0.2yL,Mtl8S F/R各0.8yL、MwITS F/R各0.4yL、MhITS F/R各0.6yL、Tw28S F/R各0.4yL,滅菌 ddH20補(bǔ)足至 25yL。
[0024] 優(yōu)選地,步驟(2)中的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min,94°C變性30s,58°C退火 30s,72°C 延伸 7〇8,35個(gè)循環(huán);72°(:延伸71^11,4°(:保存。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于:
[0026] 本發(fā)明以粘孢子蟲的183以祖、1了31-5.83-1了32及283冰熟基因?yàn)榉肿影袠?biāo),具 有較高的特異性與靈敏性,三種分子靶標(biāo)各具特點(diǎn),其中18S rRNA基因序列長度適中、信息 充足,運(yùn)用最為廣泛;28S rRNA基因片段長,包含相對較多的變量,適合用于不同階元的分 析研究;ITS屬于非編碼序列,中間被5.8S rRNA基因分開,進(jìn)化速度快,具有可變性,尤其適 用于同屬近緣物種的區(qū)別和鑒定。
[0027]本發(fā)明方法特異性強(qiáng),靈敏性高,可以檢測粘孢子蟲的早期階段;同時(shí),與普通PCR 檢測方法相比,能夠在單個(gè)PCR管中進(jìn)行一次反應(yīng)檢測丑陋圓形碘泡蟲、吳李碘泡蟲、洪湖 碘泡蟲與武漢單極蟲,省時(shí)省力,具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說明】
[0028]圖1:四對引物平衡濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中的電泳帶分別為:M:Marker DL2000; 1 -12分別代表反應(yīng)體系中四對引物的添加濃度:1:0.8、0.8、0.4、0.4μΜ2:0.8、0.4、0.6、0.4μ L;3:0.8、0.4、0.4、0.6yL;4:0.6、0.8、0.4、0.4yL ;5:0.4、0.8、0.6、0.4yL;6:0.4、0.8、0.4、 0.6yL;7:0.6、0.4、0.8、0.4yL;8:0.4、0.6、0.8、0.4yL ;9:0.4、0.4、0.8、0.6yL;10:0.6、0.4、 0.4、0.841^11:0.4、0.6、0.4、0.841^12:0.4、0.4、0.6、0.84以各引物工作濃度均為1(^]\1 ;每 組從左至右分別為:Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R);l-12均以四種粘孢子 蟲混合DNA為模板。
[0029]圖2 : Mg2 +、dNTP、TaqDNA聚合酶平衡濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中的電泳帶分別為:Μ: Marker DL2000; 1:2.0、2.0、0.2yL;2:3.0、2·0、0·3μΜ3:4·0、2·0、0·4μΜ4:2·0、3·0、0·3μ L;5:3.0、3.0、0.4uL;6:4·0、3·0、0·2uL;7:2·0、4·0、0·4uL;8:3·0、4·0、0·2uL;9:4·0、4·0、 0·3μLΧ 每組從左至右分別是 Mg2+(25mM)、dNTPs(2.5mM)、TaqDNA 聚合酶(5UAiL));l-9 均以四 種粘孢子蟲混合DNA為模板。
[0030] 圖3:不同反應(yīng)退火溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中的電泳帶分別為:M:Marker DL2000;l-6 分別代表反應(yīng)退火溫度為55、56、57、58、59、60 °C ; 7:空白對照。
[0031]圖4:四重PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。a:丑陋圓形碘泡蟲;b:吳李碘泡蟲;c:洪湖碘泡蟲; d:武漢單極蟲。圖中的電泳帶分別為:M: Marker DL2000 ;l:a,b,c,d;2:a,b,c;3:a,b,d;4: 13,(:,(1;5:&,13;6:&,(3;7:&,(1;8:13,(3;9:13,(1;10:(3,(1混合0祖;11:&;12:13;13:(3;14:(
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