has-miR-29b-3p的檢測的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及快速檢測指標技術領域，特別涉及一種檢測 microRNA has-miR-29b_3p的試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002] 血流感染是感染性疾病最嚴重的臨床表現形式之一，患者發(fā)生血流感染，會導致 住院時間的延長以及住院費用的增加，且病死率高。血流感染的診斷傳統通過血培養(yǎng)來鑒 定，但具有需要的血樣量多和出報告的時間長等缺點。
[0003] 人體的巨噬細胞具有通過識別、吞噬并最終清除細菌的作用，在宿主抵御病原菌 感染的過程中發(fā)揮巨大作用。has-miR-29b-3p是巨噬細胞在受到細菌感染時會高表達的一 種mi croRNA，并且在血培養(yǎng)陽性患者血清中可檢測到其較對照組升高。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供檢測has-miR-29b-3p的試劑盒，建立一種檢測has_miR-29b-3p的方法。該方法有快速、準確、方法簡單、成本低的優(yōu)點，有利用臨床使用和推廣。
[0005] 為了解決現有技術中的這些問題，本發(fā)明提供的技術方案如下：
[0006] -種檢測has-miR-29b_3p的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于特異性擴 增has-miR-29b-3p的特異性引物對，所述引物為具有SEQ ID No:l的連續(xù)核苷酸序列和具 有SEQ ID No:2的連續(xù)核苷酸序列；
[0007] 所述試劑盒中還包括RNA逆轉錄引物，其序列為SEQ ID No:3。
[0008] SEQ ID No:l:5'GGGTAGCACCATTTGAAA 3'
[0009] SEQ ID No:2:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'
[0010] SEQ ID No :3如下所示：
[0011] 5 ' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAACACTG3 '
[0012] 優(yōu)選的技術方案是：所述試劑盒還包括與引物序列構成PCR反應體系的Pfu緩沖 液、dNTPs、MgS04、Pfu DNA聚合酶、模板DNA、焚光染料;所述PCR反應體系的終濃度組成為：
[0013]
[0014]優(yōu)選的技術方案是：所述熒光染料可選自DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、 LCGreen?PLUS染料、ResoLight染料、SYT0 9染料、SYBR green染料;所述dNTP混合液包 括lOmM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。
[0015]本發(fā)明的第二方面是提供一種前述的試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0016] ⑴血清總RNA的提?。喊ㄈ⊙獦与x心后，取上清，加入TRIzol LS Reagent試劑 和冰醋酸，劇烈振蕩混勻進行勻漿;孵育后加入氯仿抽提，取水相加入異丙醇沉淀RNA，離心 沉淀RNA，去除上清液后加入乙醇清洗沉淀RNA，最后空氣干燥，加入無 RNA酶的水溶解RNA備 用；
[0017] (2)逆轉錄:在SEQ ID No:3的反轉錄酶的作用下及RNA酶抑制劑存在的條件下反 應，反應條件16￡€3〇11^11，42 1€4〇1^11，851€51^11，最后在冰上待用或-20°(：保存；
[0018] (3)熒光定量PCR(RT-PCR):使用SEQ ID N〇:l的引物和SEQ ID N〇:2的引物進行熒 光定量PCR反應，
[0019] (4)建立標準曲線，按絕對定量方法對結果進行分析。
[0020] 在本發(fā)明中，術語"試劑盒"是指用于PCR反應的混合物，它包括反應所需的緩沖液 (buf f er)、dNTP混合液、引物、熒光染料、MgCl2、Pfu DNA聚合酶。
[0021] 在本發(fā)明中，術語"引物"是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈相互補的 引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及一種聚合試劑（即DNA聚合酶或逆轉 錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進行上述合成。優(yōu)選的引物是單股寡 脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設計用途，但在一般在15~25個核苷酸 之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復合物。引物 不必反應模板的準確序列，但必須充分互補，已與模板雜交并引發(fā)DNA合成。
[0022] 本發(fā)明的采用實時熒光定量PCR檢測患者血清標本中has-miR-29b-3p表達水平， 從而快速篩查血流細菌感染患者。
[0023] 本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0024] 本發(fā)明首次揭示了 has-miR-29b_3p在血流細菌感染患者血清中升高，可作為快速 篩查血流細菌感染情況的指標。本發(fā)明所需血液樣本量少，檢測周期短(僅數小時）。既可減 輕患者痛楚，也有利于醫(yī)生早期干預血流細菌感染。
【附圖說明】
[0025] 圖1為細菌感染后，實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞has-miR-29b_3p表達結果圖。
[0026] 圖2實時熒光定量PCR檢測健康成年人和患者血清has-miR-29b-3p表達結果圖。
【具體實施方式】
[0027] 以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體應用要求的條 件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0028]材料和儀器
[0029] TRIzol LS Reagent試劑、冰醋酸、RNA酶抑制劑均購自Takara公司；
[0030] 實時熒光定量RT-PCR儀-PE公司（美國）。
[0031 ] 實施例1
[0032] 1血清總RNA提取
[0033] 1.1 勻漿
[0034] 血漿樣品于4°C 12，000 X g離心10分鐘，去除可能存在的雜質，取250ul血漿液體， 轉至1.5ml的離心管中，750μ1的TRIzol LS Reagent試劑和20μ1冰醋酸，手動劇烈振蕩管體 至混勻。
[0035] 1.2兩相分離
[0036]勻漿后樣品于15到30°C孵育5分鐘，以便核酸蛋白復合體完全解離。每750μ1的 TRIzol LS Reagent試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15 秒后，15到30°C孵育2到3分鐘。4°C下12,000Xg離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的 紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使 勻漿時加入的TRIzol LS Reagent的60%。
[0037] 1.3 RNA沉淀
[0038] 將水相轉移到新離心管中，并加入500μ1異丙醇，混勻以沉淀其中的RNA?；靹蚝?5 到30°C孵育10分鐘后，于4°C 12,000\8離心1