一種新型的活細(xì)胞中microRNA分子的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及分析化學(xué)、納米材料等領(lǐng)域，具體涉及一種新型的活細(xì)胞中microRNA 分子的檢測方法，具體包括活細(xì)胞內(nèi)microRNA分子催化金納米粒子與量子點之間的去組裝 反應(yīng)，改變GNP與QD之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，對QD的熒光信號進行放大，從而實現(xiàn)對 活細(xì)胞中靶標(biāo)microRNA分子高特異性和高靈敏度的檢測方法，并以此實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞和正 常細(xì)胞的準(zhǔn)確區(qū)分。
【背景技術(shù)】
[0002] 量子點（quantum dots，英文簡稱QDs)是一種尺度小于或者近似激子波爾粒徑的 半導(dǎo)體納米晶體。相比于傳統(tǒng)的有機分子染料，其具有獨特且優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，比如激發(fā)譜 寬且連續(xù)分布，發(fā)射波長可調(diào)，熒光量子產(chǎn)率高，熒光壽命長，抗光漂白性強等，因而在生物 標(biāo)記成像、光電子器件，光伏太陽能材料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。QDs獨特的熒光性質(zhì) 使得其能夠作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的理想供體；同時由于高效的表面等離子共振效應(yīng) 和對可見波段光譜的強烈吸收性能，金納米粒子(英文簡稱GNP)能夠作為熒光共振能量轉(zhuǎn) 移效應(yīng)的理想受體。
[0003] DNA分子是遺傳信息的載體，其由于Watson-Crick堿基互補配對原則而具有可編 程性；以toe-hold(中文名叫立足點，它是DNA鏈取代反應(yīng)中需要的條件)介導(dǎo)的DNA鏈取代 反應(yīng)，可以實現(xiàn)DNA雙鏈與單鏈之間有序的取代反應(yīng)。以含有PS段（即磷硫鍵，P-S)和P0段 (即磷氧鍵，P-0 )的DNA作為模板分子來合成量子點的方法，不僅能夠簡單而直接地對QD表 面進行DNA共價偶聯(lián)修飾，還能夠通過調(diào)節(jié)PS段的長度以及量子點的粒徑大小來精確控制 量子點表面的DNA分子的數(shù)量；同時外部的P0段仍處于自由伸展?fàn)顟B(tài)，保持著DNA的可編程 性。同樣，由于巰基(-SH)與Au原子之間強烈的共價鍵結(jié)合能力，修飾了-SH的DNA分子能夠 輕易地被修飾到GNP的表面，所修飾的DNA分子同樣保持著可編程性。因此，上述方法所獲得 的DNA修飾的QD和GNP，可以通過DNA分子實現(xiàn)程序化地可控地自組裝并形成具有高效熒光 共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的GNP-QD納米組裝體。
[0004] MicroRNA是一類關(guān)鍵的非編碼性微小RNA分子，其對于細(xì)胞中基因表達有著重要 的調(diào)控作用。MicroRNA的非正常表達往往跟多種疾病，特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的 關(guān)聯(lián)。因此對microRNA的特異性和高靈敏度的檢測將具有十分重要的意義?，F(xiàn)有的 microRNA分子的檢測方法，主要集中于體外檢測，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(即PCR)和分子信標(biāo) (即Molecular Beacon)的方法。體外檢測首先要求將microRNA分子從細(xì)胞中提取出來。然 而提取過程不僅耗時耗力，也往往會對原有的microRNA分子產(chǎn)生污染，如提取過程的效率 問題往往導(dǎo)致獲得的microRNA分子的濃度少于細(xì)胞中的實際值;或者因為核酸酶的影響， 使得microRNA分子在提取過程中被部分降解等。因此發(fā)展一種在活細(xì)胞中直接的、特異性 和高靈敏度的microRNA分子的檢測方法將會具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種新型的活細(xì)胞中microRNA分子的檢測方法，解決了目前 microRNA分子的檢測方法提取過程效率低、靈敏度不夠高的問題。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種新型的活細(xì)胞中microRNA分子 的檢測方法，包括以下步驟： 第一步，通過DNA3將修飾有DNA1的GNP和修飾有DNA2的QD通過DNA堿基互補配對規(guī)則進 行程序化地組裝，獲得GNP-QD納米組裝體，所述DNA1和DNA2均能夠與DNA3進行堿基互補配 對，所述DNA1含有至少一個巰基，所述DNA2含有磷硫鍵;在組裝體中，由于QD與GNP之間的高 效熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，QD本身的熒光性能被暫時淬滅；其中，所述GNP的粒徑范圍為5 nm~100 nm;所述QD的發(fā)射波長范圍從450 nm~750 nm; 第二步，用脂質(zhì)體將所述GNP-QD納米組裝體和DNA4-起轉(zhuǎn)染到活細(xì)胞中共培養(yǎng)，DNA4 能夠與DNA3進行堿基互補配對;之后，在活細(xì)胞中表達的靶標(biāo)microRNA分子的催化作用下， 所述GNP-QD納米組裝體發(fā)生催化去組裝，使GNP與QD相分離，此時由于QD與GNP之間的熒光 共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)消失，QD本身的熒光信號獲得恢復(fù)，細(xì)胞能夠發(fā)出熒光；所述靶標(biāo) mi croRNA分子為活細(xì)胞中任意高表達的mi croRNA分子； 第三步，通過細(xì)胞的熒光成像，實現(xiàn)對靶標(biāo)microRNA分子的特異性和高靈敏的定性檢 測。
[0007] 上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下： 1、上述方案中，較佳的方案是所述QD的成分選自CdTe、CdSe、CdS二元量子點中的任意 一種，或選自2]1取56、0(1取56、2111115、211(](156合金量子點中的任意一種，或選自0(156/2115、 ZnSe/ZnS、CdTe/ZnS核殼型量子點中的任意一種，在或者選自單質(zhì)量子點Si、P、C中的任意 一種。
[0008] 2、上述方案中，所述DNA1和DNA2都是單鏈DNA，并且均能與DNA3進行堿基互補配 對，以此，DNA3將修飾有DNA1的GNP和修飾有DNA2的QD組裝起來。
[0009] 3、上述方案中，由于活細(xì)胞中microRNA分子數(shù)量很少，而進入到活細(xì)胞中的GNP-QD納米組裝體數(shù)量較多，因此mi croRNA只能進行有限次的反應(yīng)，mi croRNA只能與GNP-QD納 米組裝體按照摩爾比為1:1進行反應(yīng)，加入了DNA4就可以使microRNA進行循環(huán)放大反應(yīng)，也 就是說重復(fù)利用單個microRNA分子將多個QD與GNP進行解離，使預(yù)先被猝滅的QD熒光信號 恢復(fù)并被多級放大。
[0010] 4、上述方案中，所述脂質(zhì)體的作用是主要是用來轉(zhuǎn)染DNA4-1。脂質(zhì)體是一個比較 成熟的商品化試劑，用來向活細(xì)胞中轉(zhuǎn)染外界物質(zhì)，常常用作基因轉(zhuǎn)染。在上述方案中，主 要借助它來轉(zhuǎn)染DNA4,因為單獨的DNA4是不能進入到細(xì)胞的。當(dāng)然脂質(zhì)體也可以將GNP-QD 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，所以GNP-QD的轉(zhuǎn)染不僅能依靠自身具有的轉(zhuǎn)染特性，還能借助脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染作 用，結(jié)果是GNP-QD的轉(zhuǎn)染效率會大大增加。
[0011 ] 5、上述方案中，當(dāng)GNP-QD組裝體進入到不表達革巴標(biāo)mi croRNA分子的正常細(xì)胞中 時，GNP-QD的去組裝反應(yīng)不會被誘發(fā)，QD不會從組裝體上游離出來，其熒光不會恢復(fù)，細(xì)胞 也不會發(fā)出熒光。
[0012]本發(fā)明設(shè)計原理以及有益效果是： 本發(fā)明在上述已有的技術(shù)基礎(chǔ)上，提出了一種基于納米組裝體的催化放大去組裝和QD 熒光成像方法，實現(xiàn)在活細(xì)胞中直接的、特異性和高靈敏度的mi croRNA分子檢測的方法。首 先將修飾有DNA的GNP和QD通過DNA堿基互補配對規(guī)則進行程序化地組裝，獲得GNP-QD納米 組裝體。在組裝體中，由于QD與GNP之間的高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，QD本身的熒光被暫 時淬滅。當(dāng)GNP-QD組裝體進入到腫瘤細(xì)胞后，在其表達的祀標(biāo)microRNA分子的作用下，通過 miRNA與DNA分子之間的程序化反應(yīng)對GNP-QD組裝體進行催化去組裝，使組裝體中的QD游離 出來并恢復(fù)其熒光信號，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)microRNA分子的檢測?？傊?，通過細(xì)胞的熒光成 像，能夠?qū)崿F(xiàn)對靶標(biāo)microRNA分子的特異性和高靈敏檢測，并可以用做區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正 常細(xì)胞的依據(jù)。這種活細(xì)胞中microRNA檢測的方法依據(jù)的核心原理是GNP與QD之間因為DNA 介導(dǎo)的程序化組裝和催化去組裝，使得相互之間的距離發(fā)生變化從而導(dǎo)致的熒光共振能量 轉(zhuǎn)移效應(yīng)的發(fā)生和消失。
【附圖說明】
[0013] 附圖1為本發(fā)明實施例一的由DNA1和DNA2-1分別修飾的粒徑為13 nm的GNP和發(fā)射 波長為630 nm CdTe量子點，通過DNA3-1組裝成GNP-QD組裝體的電鏡圖； 附圖2為本發(fā)明實施例一的在存在DNA4-1的前提下，GNP-QD組裝體在細(xì)胞外與靶標(biāo) microRNA-21分子作用6小時后，在365nm紫外燈下獲得的熒光照片;microRNA-21與DNA3-1 的摩爾比例從左至右依次是0，1·0,0·1，0·02,0·01，0·004,0·002,0·001，0·0005 ; 附圖3為本發(fā)明實施例一的在不存在DNA4-1的前提下，圖1中GNP-QD組裝體在細(xì)胞外與 靶標(biāo)microRNA-21分子作用6小時后，在365nm紫外燈下獲得的熒光照片;microRNA-21與 DNA3-1 的摩爾比例從左至右依次是1，0·1，0·02,0·01，0·004,0·002,0·001; 附圖4為附圖2和附圖3中不同摩爾比例的mi croRNA-21與DNA3-1，所對應(yīng)的熒光光譜強 度變化曲線； 附圖5為細(xì)胞外，將提取的不同細(xì)胞的microRNA與附圖1中GNP-QD組裝體分別進行作 用，在DNA4-