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一種人類金屬硫蛋白-3融合蛋白表達載體的制作方法_2

文檔序號:9780737閱讀:來源:國知局
1 X PBS洗涂一次,再懸浮于0.5mL 1 X PBS,超聲破碎菌體,離屯、去沉淀。
[0044] (3)取適量SOiiL上清與上樣緩沖液混合,95°C加熱變性10分鐘,離屯、收集至管底, 至于冰上。
[0045] (4)取10化上樣15%聚丙締酷胺電泳,考馬斯亮藍染色、脫色,觀察蛋白質(zhì)條帶和 hFABP6蛋白的表達情況。
[0046] (5)重組hFABP6,包括N-HisTag、柔性接頭、多克隆區(qū),共158aa,分子量17.2kDa。 hFABP6占菌體總蛋白的20 %,可溶性表達。
[0047] 實施例2
[004引1、MT3的全基因合成:
[00例合成的方法為通用的兩步PCR法(PCR,多聚酶鏈式反應(yīng)),獲得MT3編碼DNA:1)重疊 延伸PCR(0verlapPCR)W引物互為模板合成全長DNA序列,所用引物4條(SEQIDN0:23~ 26);2)并W此產(chǎn)物為模板,PCR擴增全長DNA,所用引物2條(SEQ ID N0.27,28)。
[0050] (1)搭頭延伸PCR參數(shù):94°C/30秒,56°C/30秒,72°C/30秒,15個循環(huán),補齊延伸72 °C/2分鐘。
[0051 ] (2)全長合成PCR參數(shù):94°C/30秒,58°C/30秒,72°C/45秒,30個循環(huán),補齊延伸72 °C/5分鐘。
[0化2] 2、hFABP6-MT3融合蛋白表達載體構(gòu)建:
[0053] (1)將人工合成所獲得的MT3DNA序列,分別經(jīng)過Κρη 1/化〇 I雙酶切處理、電泳、切 膠純化;
[0化4] (2)同時將祀T28-hFABP6載體用Κρη I/Xho I雙酶切處理、純化;
[00對 (3)用T4DNA連接酶將經(jīng)過(1)和(2)處理的DNA片段分別連接,形成連接產(chǎn)物: pET28-hFABP6-MT3(沈Q ID N0.29)。
[0056] (4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株化2UDE3),挑取單菌落,PCR法鑒定陽性 克隆,送交DNA序列分析,保留序列正確的祀T28-hFABP6-MT3/BL21(DE3)克隆,保存菌種。 [0化7]實施例3
[0化引(一)對照載體祀T28-MT3的構(gòu)建
[0化9] (1)MT3 的 PCR
[0060] MT3的PCR引物,上游引物:
[0061 ] 5'-TTTTGGTACCATGGATCCTGAAACTTGTCCTTGTCCTTCCGG-3'(SEQ ID NO. 27),下游引 物:5'-TTTTCTCGAGTTACTGACAGCAGGAACATTTTTCCGCTTCCGCTTCAGCG-3'(沈Q ID N0.28)。
[0062] PCR 參數(shù)是:94°C/30 秒,56°C/30 秒,72°C/30 秒,30 個循環(huán)。
[0063] (2 )MT3PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶酶切
[0064] PCR產(chǎn)物用化ol/XhoI雙酶切,電泳切膠純化。
[0(?日]3.用化ol/XhoI雙酶切處理祀T28載體,電泳切膠純化。
[0066] 4.T4DNA連接酶連接線性化祀T28載體與插入片段MT3。
[0067] 5.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞化2UDE3),挑取單菌落擴增鑒定重組子, 測序分析獲得正確的祀T28-MT3克隆。
[0068] 6.取上述正確克隆,LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)增菌。
[00例 7.取過夜培養(yǎng)物1:10接種于新鮮LB培養(yǎng)基,4小時后,或0D = 0.6,加 IPTG至0.1 mM, 繼續(xù)誘導(dǎo)12小時。
[0070] 8.取1血培養(yǎng)物,離屯、收集菌體,PBS洗涂1次,加0.5mL PBS重懸浮,超聲破碎,分別 保留上清和沉淀,沉淀物用0.5mL PBS再懸浮,分別取上清20化,社蛋白電泳緩沖液20化,95 °C加熱10分鐘,冰上放置2分鐘,離屯、12000RPM,5分鐘,收集上清,留作聚丙締酷胺凝膠電 泳。
[0071] 9.分別取10化樣品上樣聚丙締酷胺凝膠,電泳至染料前端到達凝膠的下1/3,收 膠,考馬斯亮藍染色、脫色。
[0072] 10.觀察有無6.9W)a的表達條帶及條帶濃度(占總蛋白的比例)。
[0073] (二)pET28-hFABP6-MT3 的表達測試
[0074] (1)將祀了28-}1。48?6-1了3/81^21(063)的正確克隆過夜培養(yǎng)增菌;
[00巧](2)取過夜培養(yǎng)物1: 10接種于新鮮LB培養(yǎng)基,4小時后,或00 = 0.6,加1?了6至 O.lmM,繼續(xù)誘導(dǎo)12小時。
[0076] (3)取ImL培養(yǎng)物,離屯、收集菌體,PBS洗涂1次,加0.5mL PBS重懸浮,超聲破碎,分 別保留上清和沉淀,沉淀物用0.5mL PBS再懸浮,分別取上清20化,2x蛋白電泳緩沖液20化, 95°C加熱10分鐘,冰上放置2分鐘,離屯、12000RPM,5分鐘,收集上清,留作聚丙締酷胺凝膠電 泳。
[0077] (4)分別取10化樣品上樣聚丙締酷胺凝膠,電泳至染料前端到達凝膠的下1/3,收 膠,考馬斯亮藍染色、脫色。
[0078] (5)觀察有無約23. IkDa的表達條帶及條帶濃度,結(jié)果見下表。
[0079] 表1.MT3在兩種不同表達載體中的表達狀況
[0080]
【主權(quán)項】
1. 一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的人類金屬硫蛋白融合 蛋白表達載體是將人類金屬硫蛋白-3的編碼序列作為目標蛋白編碼序列插入伴侶樣蛋白 的融合蛋白表達載體的多克隆區(qū)所得;所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達載體上游含有人 類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列,人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白編碼序列下游包含一段柔 性接頭區(qū)和用于插入目標蛋白編碼序列的多克隆區(qū)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的人類 游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6與人類天然游離脂肪酸結(jié)合蛋白的同源性等于或大于85%;所述的 人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的人類 游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的柔性 接頭區(qū)和多克隆區(qū)編碼序列如SEQ ID NO.3所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的人類 金屬硫蛋白-3其氨基酸序列與人類天然金屬硫蛋白的氨基酸序列的同源性等于或大于 75%。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:人類金屬硫 蛋白-3氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:人類金屬硫 蛋白-3編碼序列如SEQ ID NO.20所示。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的表達 載體中人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列的上游還包含編碼用于分離純化融合蛋白 的標簽的序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體,其特征在于:所述的表達 載體中人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列的上游還包含編碼組氨酸標簽的序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人類金屬硫蛋白-3融合蛋白表達載體。所述表達載體克隆區(qū)的上游包含人類脂肪酸結(jié)合蛋白(hFABP6),下游為金屬硫蛋白MT3。本發(fā)明還揭示了應(yīng)用所述表達載體的方法,包括表達菌株的構(gòu)建、擴增、誘導(dǎo)表達、融合蛋白純化的基本方法。本發(fā)明所揭示的hFABP6-MT3融合蛋白表達載體具有如下特點:①高效表達MT3蛋白;②可溶性表達。
【IPC分類】C12N15/70
【公開號】CN105543262
【申請?zhí)枴緾N201510976740
【發(fā)明人】李萬波, 陜婧婧, 盧嬋
【申請人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月22日
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