一種菊粉內(nèi)切酶的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，設(shè)及一種經(jīng)基因工程技術(shù)優(yōu)化 后的菊粉內(nèi)切酶基因經(jīng)重組大腸桿菌表達(dá)后高效制備菊粉內(nèi)切酶的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 菊粉是由β-2，1-糖巧鍵連接D-巧喃果糖分子組成的線性直鏈多糖，末端常帶有一 個(gè)葡萄糖，聚合度DP通常為2~60之間，通常存在于菊宦，菊芋及雪蓮果等植物的根狀塊莖 中。菊粉酶是能夠水解e-2，i-D-果聚糖果糖巧鍵的一類水解酶類，學(xué)名β-2，1-0果聚糖水解 酶巧C 3.2.1)，又稱β-果聚糖酶，2，1-D-果聚糖水解酶。微生物菊粉酶可W催化植物中的菊 糖水解為果糖或低聚果糖。根據(jù)其對(duì)底物的作用方式不同，菊粉酶分為兩類。一類是外切果 聚糖水解酶巧C3.2.1.8)，又稱外切菊粉酶，外切菊粉酶從菊糖或低聚果糖分子的非還原末 端依次水解0-D果糖巧鍵，生成一分子果糖和少一個(gè)果糖分子的果聚糖，最終產(chǎn)物為果糖和 葡萄糖。另一類是內(nèi)切果聚糖水解酶巧C 3.2.1.7)，又稱內(nèi)切菊粉酶。內(nèi)切菊粉酶從菊糖分 子內(nèi)部隨機(jī)切斷β-2，1-巧喃果糖巧鍵，得到6。2、6。3、6。4爪少3少4爪等低聚果糖和短鏈果 聚糖。內(nèi)切菊粉酶在工業(yè)領(lǐng)域用于生產(chǎn)低聚果糖有很大的潛力。
[0003] 應(yīng)用內(nèi)切菊粉酶運(yùn)一催化特性，內(nèi)切菊粉酶能W菊粉為底物，催化菊粉水解成低 聚果糖。低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，具有重要的健康、藥用開發(fā)價(jià) 值。制備適合工業(yè)化生產(chǎn)的內(nèi)切菊粉酶是生產(chǎn)低聚果糖技術(shù)的關(guān)鍵。
[0004] 菊粉內(nèi)切酶主要分布在微生物中，目前研究較多的產(chǎn)菊粉酶的微生物包括真菌、 酵母和細(xì)菌。其中絲狀真菌有17個(gè)屬40余種，酵母菌有10個(gè)屬20余種，細(xì)菌有12個(gè)屬10余 種。研究較多的產(chǎn)菊粉酶絲狀真菌主要包括Aspe;rgillus nige;r、Penicilliumsp、raiizopus delemar、Fusarium oxysporum、Talaromyces flavusvar flavus和Chrysosporium pannorum等，其菊粉酶多為胞外酶；酵母主要有Kluyveromyces fragilis、Kluyve;romyces m曰rxi曰nus、Deb曰ryomyces c曰nt曰rellii和S曰cch曰romyces化曰邑1118等，其菊粉酉每多為胞內(nèi) 酶或與細(xì)胞壁相結(jié)合；細(xì)菌主要有Bacillus subtilis、Ath;robacter sp.、Pseudomonas sp.和Xanthomonas sp.等，其菊粉酶W胞外酶為主。研究表明，大部分微生物分泌的菊粉酶 主要為外切酶，或內(nèi)外切混合酶。鑒于直接從野生菌中提取內(nèi)切菊粉酶存在工藝復(fù)雜，提取 率低且較難將內(nèi)外切菊粉酶分開及成本昂貴等問(wèn)題，尋找廉價(jià)、高效的外源基因表達(dá)方法 是目前內(nèi)切菊粉酶的研究熱點(diǎn)。
[0005] 無(wú)花果曲霉（Aspergillus ficuum ATCC 16882)具有編碼內(nèi)切菊粉酶的基因 end〇-inu2。本發(fā)明 ^Aspergillus ficuum ATCC 16882的end〇-inu2基因?yàn)閬?lái)源序列，通過(guò) 基因工程技術(shù)對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，選用大腸桿菌作為宿主，構(gòu)建此具有內(nèi)切菊粉酶活性 的重組大腸桿菌。大腸桿菌遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、易于操作，是表達(dá)外 源蛋白的首選體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種高效制備菊粉內(nèi)切酶的方法。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[000引一種菊粉內(nèi)切酶的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
[0009] 步驟一，構(gòu)建大腸桿菌工程菌:將經(jīng)過(guò)基因工程技術(shù)優(yōu)化后的編碼菊粉內(nèi)切酶的 基因序列pelB-NSinu2,插入到大腸桿菌pET28a載體上，構(gòu)建出祀T28a-pelB-NSinu2質(zhì)粒， 導(dǎo)入大腸桿菌Escherichia coli化21中，構(gòu)建出高效分泌表達(dá)菊粉內(nèi)切酶的重組大腸桿 菌E.coli 化21 祀T28a-pelB-NSinu2;
[0010] 步驟二，利用步驟一獲得的大腸桿菌工程菌進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)菊粉內(nèi)切酶的分泌表 達(dá)；
[0011] 步驟Ξ，提取發(fā)酵上清液，對(duì)該上清液進(jìn)行純化得到菊粉內(nèi)切酶液。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟一所述的構(gòu)建大腸桿菌工程菌的具體步驟如下：
[0013] 1)提取無(wú)花果曲霉Aspe巧illus ficuum ATCC 16882總DNA;
[0014] 2)設(shè)計(jì)引物，用PCR方法克隆end〇-inu2基因；
[0015] 3)將上述克隆出來(lái)的來(lái)源于真核菌株的end〇-inu2基因片段送于南京金斯瑞公司 測(cè)序并優(yōu)化為適用于原核表達(dá)體系的基因片段inu2。
[0016] 4)對(duì)優(yōu)化后的基因片段inu2和來(lái)自祀T-20b( + )載體的pelB基因運(yùn)用同源重組方 法設(shè)計(jì)引物，用PCR方法從inu2基因序列和祀T-20b( + )載體上分別克隆缺少內(nèi)源信號(hào)膚序 列的NSinu2基因及pelBf目號(hào)膚基因序列。
[0017] 5)將PCR出來(lái)的帶有同源臂序列的pelB片段及NSinu2序列片段與線性化克隆載體 祀T-28a( + )按一定比例混合后，在Exnase ?的催化下，僅需反應(yīng)3〇min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成 定向克隆，構(gòu)建出將pelB與NSinu2融合表達(dá)的重組質(zhì)粒祀T28a-pelB-NSinu2.
[0018] 6)然后將重組載體祀T28a( + )-pelB-NSinu2轉(zhuǎn)入大腸桿菌，進(jìn)行重組克隆篩選，獲 得大腸桿菌工程菌Escherichia coli BL21 祀T28a-pelB-NSinu2。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟二所述發(fā)酵的具體步驟如下：
[0020] 1)挑取重組菌單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，W含有空載體的細(xì)菌樣品和重組菌 做對(duì)照；
[0021] 2)次日，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組按體積比1%接種量接種至新鮮50血發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 °C，200r/min振蕩培養(yǎng)；
[0022] 3)待菌液生長(zhǎng)至ODsqq到0.7左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L，30°C 誘導(dǎo)10小時(shí)。
[0023] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分：蛋白腺12g/L，酵母粉24g/L，K2HP〇472mmol/L， MgSOUOmmol/L，硫胺素0.034g/L，硫酸卡那霉素0.03g/L，微量元素2mL/L，該微量元素成分 為CaCl2 ·細(xì)2〇 0.74g/L，aiS〇4 · 7此0 0.18g/L，MnS〇4 · H20 20g/L，化2 ·抓TA 20.1g/L， 化5〇4〇.1邑/1，(：〇(：12〇.104邑/1，尸65〇4?7出0 2邑/1。
[0024] 進(jìn)一步地，所述的步驟Ξ提取發(fā)酵上清液的方法為4°C下，轉(zhuǎn)速8000r/min，離屯、菌 液15min。
[0025] 本發(fā)明的另一目的是提供上述菊粉內(nèi)切酶的制備方法的應(yīng)用。
[00%] 本發(fā)明之所W對(duì)來(lái)源于Aspergillus ficuum ATCC 16882的編碼菊粉內(nèi)切酶的 end〇-inu2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化是因?yàn)樵吮磉_(dá)體系不能夠識(shí)別部分真核基因的密碼子從 而導(dǎo)致部分密碼子翻譯成錯(cuò)誤氨基酸，為提高翻譯準(zhǔn)確率對(duì)編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化w適 用于大腸表達(dá)體系。此外本發(fā)明對(duì)編碼菊粉內(nèi)切酶基因的內(nèi)源信號(hào)膚進(jìn)行了切除是因?yàn)轭A(yù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明來(lái)源于真核的內(nèi)源信號(hào)膚序列在原核體系中不僅失去了其分泌功能而且降 低了目標(biāo)蛋白的活性表達(dá)，使得翻譯表達(dá)出的菊粉內(nèi)切酶蛋白多為包涵體影響酶活力。為 此本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌表達(dá)體系中適配于菊粉內(nèi)切酶的信號(hào)膚序列，其融合表達(dá) 效果不僅能夠提高目標(biāo)蛋白的活性表達(dá)而且能實(shí)現(xiàn)大腸桿菌分泌表達(dá)，免除細(xì)胞破壁等后 期處理過(guò)程。
[0027] 而在大腸桿菌中選擇使用pET-28a( + )表達(dá)載體，運(yùn)是因?yàn)閜ET系統(tǒng)是有史W來(lái)在 大腸桿菌化.coli)中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到祀T系統(tǒng)載 體上，受隧菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制；表達(dá)有宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7聚 合酶機(jī)制十分有效并具有選擇性;充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白； 誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通?？蒞占到細(xì)胞總蛋白的50% W上。此外祀T-28a( + ) 在C端設(shè)計(jì)了6個(gè)組氨酸的純化位點(diǎn)，組氨酸能夠提供配位電子與某些金屬離子(如Ni2+)馨 合，6個(gè)連續(xù)的組氨酸可W使蛋白有效吸附于含Ni 2+的層析填料上，因而可W利用金屬馨合 來(lái)純化融合蛋白，從而極大地簡(jiǎn)化了重組蛋白的后續(xù)純化工作，非常適合大規(guī)模制備。
[0028] 本發(fā)明所述利用密碼子優(yōu)化基因克隆表達(dá)制備出高效分泌的菊粉內(nèi)切酶在水解 菊粉用于生產(chǎn)低聚果糖中的應(yīng)用。
[0029] 將本發(fā)明所述的高效分泌菊粉內(nèi)切酶的帶有密碼子優(yōu)化基因重組大腸桿菌工程 菌Escherichia coli BL21祀T28a-pelB-NSinu2進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，僅需誘導(dǎo)8h發(fā)酵液上清中 即可達(dá)到最高酶活力75.22U/mg(蛋白），經(jīng)儀柱純化后的酶液即可直接用于水解菊粉生產(chǎn) 低聚果糖，轉(zhuǎn)化效率高，此種菊粉內(nèi)切酶的制備方法由于發(fā)酵時(shí)間短，酶活高，且無(wú)需破碎 細(xì)胞后期處理方便等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)低聚果糖的應(yīng)用中具有巨大的發(fā)展前景。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：所述含有優(yōu)化后的基因序列pelB-NSinu2的工程菌株 Escherichi