杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及杏鮑菇原始母種的保藏方法領(lǐng)域，特別涉及一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]為了保持食用菌菌種的優(yōu)良性狀不變，需要對(duì)其母種進(jìn)行保藏。當(dāng)前食用菌菌種保藏主要用液氮低溫保藏方法、斜面定期移植法等，液氮低溫保藏方法、的保藏成本很高，斜面定期移植法等保藏時(shí)間短，菌種穩(wěn)定性不好，易發(fā)生變異或退化等，現(xiàn)有技術(shù)中的一種草菇菌種的低溫保藏方法(20061003531.7)在草菇菌種接種的試管斜面中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-40%海藻糖溶液，可以使試管斜面在1-4°C保藏8個(gè)月，時(shí)間短。大球蓋菇菌種保藏方法(200810017694.4)采用菌絲體真空冷凍干燥法提高菌種的低溫耐凍性，再用冷凍管進(jìn)行保藏，操作復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種適合工廠化運(yùn)用的杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，能長(zhǎng)期保藏，并能保證原始母種的活性。
[0004]本發(fā)明提出一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，包括以下步驟:
[0005]A、制作PDA斜面試管，經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢測(cè)，把試管壁上的水珠和水分蒸發(fā)消失；
[0006]B、把原始母種轉(zhuǎn)接到上述經(jīng)檢測(cè)合格的PDA培養(yǎng)基上面，在恒溫箱里22±1°C，黑暗培養(yǎng)16-18天，使菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；
[0007]C、按甘油:吐溫-80:純凈水=15%-30%:0-5%:80-65%的容積比配制甘油劑，再將其分裝到耐高、低溫的塑料試管中；每個(gè)塑料試管裝甘油劑至其1/2-4/5的總?cè)萘?，進(jìn)行高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌保藏備用；
[0008]D、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌的條件下把TOA斜面試管內(nèi)的培養(yǎng)基分切成培養(yǎng)基塊，再將帶菌絲的數(shù)個(gè)培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的塑料試管里面，以甘油劑沒(méi)過(guò)菌種塊為標(biāo)準(zhǔn)，蓋上蓋子，用封口膜進(jìn)行密封；
[0009]E、將塑料試管在-18±2°C下先預(yù)冷1-2天后，再轉(zhuǎn)移到-80±5°C的冰箱里長(zhǎng)期保藏。
[0010]優(yōu)選地，所述E步驟中，塑料試管應(yīng)直立分散放置，防止試管倒掉或擠壓。
[0011 ]所述E步驟中，長(zhǎng)期保藏的年限為8年以內(nèi)。
[0012]所述A步驟中，PDA斜面試管內(nèi)的PDA培養(yǎng)基含食用級(jí)鹽0.8%_1.4%。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:PDA培養(yǎng)基中添加質(zhì)量含量為0.8%-1.4%食鹽，在菌絲生長(zhǎng)階段，由于食鹽中含有鈉、鎂、鈣等金屬離子，可以培養(yǎng)健壯的菌絲;在超低溫保藏期間，可以使菌絲更快的吸收甘油小分子，更好的起到保護(hù)作用;在菌絲恢復(fù)階段由于菌種塊的水勢(shì)差，菌種塊容易吸水菌絲萌發(fā)成活率高。將把原始母種放到恒溫箱黑暗培養(yǎng)16-18天，這是培養(yǎng)菌絲健壯營(yíng)養(yǎng)體的關(guān)鍵，在此基礎(chǔ)上才利于超低溫冷藏，因?yàn)榫z在光照下生長(zhǎng)，其非常慢，容易向生殖方向轉(zhuǎn)變，不利于培養(yǎng)健壯的營(yíng)養(yǎng)菌絲體;預(yù)冷的作用就是進(jìn)行分階段降溫，減少因急劇降溫對(duì)杏鮑菇菌絲細(xì)胞的破壞作用，最大限度的保證杏鮑菇菌絲營(yíng)養(yǎng)體的完整性。
[0014]吐溫-80是一種表面活性劑，既能在凍結(jié)和脫水過(guò)程中降低冰-水界面張力所引起菌絲細(xì)胞的凍結(jié)變性，又能在復(fù)水過(guò)程中對(duì)表面活性劑組分起到潤(rùn)濕劑和重褶皺劑的作用，為常用的非離子型表面活性。甘油具有良好滲透性的小分子化合物保護(hù)劑，能滲透至細(xì)胞內(nèi)部，以羥基和胞內(nèi)大分子形成氫鍵，部分取代由水分子形成的氫鍵，使生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和其它大分子物質(zhì)在缺水條件下仍可保持其原有結(jié)構(gòu)，維持生物體活力。但甘油濃度過(guò)高易造成樣品發(fā)粘，不易干燥。甘油所具有的羥基可與細(xì)胞表面自由基聯(lián)結(jié)，避免菌體暴露在介質(zhì)中，還可與蛋白質(zhì)形成氫鍵取代水，保證蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。甘油有很強(qiáng)持水性，可使細(xì)胞在干燥過(guò)程中水分不至于下降太快，破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而使菌體受損。但甘油濃度提高至一定程度時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用能力會(huì)達(dá)到了極限，過(guò)高濃度會(huì)使冷凍干燥過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生變質(zhì)。冷凍時(shí)加入甘油后將發(fā)生如下變化:沖淡溶液中溶質(zhì)鹽的濃度，細(xì)胞攝入鹽量減少，由保護(hù)劑替代;保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞，改變了胞內(nèi)過(guò)冷狀態(tài)，使胞內(nèi)壓力接近胞外壓力，降低了細(xì)胞脫水皺縮程度和速度;保護(hù)劑進(jìn)出細(xì)胞容易，緩解了復(fù)水時(shí)滲透性腫脹引起的損傷。甘油劑能避免菌絲體結(jié)冰產(chǎn)生冰晶損傷菌絲體細(xì)胞，使杏鮑菇原始母種能耐-80°C的超低溫，以超低溫降低杏鮑菇菌絲的酶活性，同時(shí)保持其生物活性，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保存目的。
[0015]本方法能夠?qū)υ寄阜N進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)8年的超低溫長(zhǎng)期保藏，且存活率高，復(fù)活率在90%以上，活菌的種性和功能穩(wěn)定，其遺傳穩(wěn)定性、次生代謝產(chǎn)物、生存活性均無(wú)改變;冷藏后菌種經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)管活化后，其菌種的生長(zhǎng)速度、健壯程度、光亮程度等都與剛開(kāi)始的原始菌種一致;菌種不會(huì)受到污染和退化，在原種、栽培種、生產(chǎn)瓶的生產(chǎn)過(guò)程中，超低溫長(zhǎng)期保存的試管種，其感染率和生長(zhǎng)速度都與原始母種一致;不需要轉(zhuǎn)管，操作簡(jiǎn)單;菌種遺傳穩(wěn)定好，在菇型上長(zhǎng)期保藏的菌種與保藏前的原始母菌一樣，產(chǎn)量和品質(zhì)也無(wú)差別，本發(fā)明能夠長(zhǎng)期保持原始母菌的基因型和形態(tài)型，為工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定提供了保證。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例一
[0017]本實(shí)施例提出一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，包括以下步驟:
[0018]A、制作PDA斜面試管，經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢測(cè)，把試管壁上的水珠和水分蒸發(fā)完；
[0019]B、把原始母種轉(zhuǎn)接到上述經(jīng)檢測(cè)合格的PDA培養(yǎng)基上面，在恒溫箱里22±1°C，黑暗培養(yǎng)16天，使菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；
[0020]C、按甘油:吐溫-80:純凈水= 20%:5%:75%的容積比配制甘油劑，再將其分裝到耐低高溫的塑料試管中；每個(gè)塑料試管裝甘油劑至其1/2-4/5的總?cè)萘?，進(jìn)行高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌保藏備用；
[0021]D、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌的條件下把PDA斜面試管內(nèi)的培養(yǎng)基分切成3mmX3mm的培養(yǎng)基塊，再將帶菌絲的3-6個(gè)培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的5ml的塑料試管里面，以甘油劑沒(méi)過(guò)菌種塊為標(biāo)準(zhǔn)，蓋上蓋子，用封口膜進(jìn)行密封；
[0022]E、將塑料試管在_18±2°C下先預(yù)冷1-2天后，再轉(zhuǎn)移到_80°C的冰箱里長(zhǎng)期保藏，塑料試管應(yīng)直立放置，防止試管倒掉或擠壓，長(zhǎng)期保藏的年限為8年以內(nèi)。
[0023]所述A步驟中，PDA斜面試管內(nèi)的TOA培養(yǎng)基含食用級(jí)鹽0.9%，這里是質(zhì)量分?jǐn)?shù)，SP鹽的質(zhì)量占PDA培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.9%。
[0024]實(shí)施例二
[0025]本實(shí)施例提出一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，包括以下步驟:
[0026]A、制作PDA斜面試管，經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢測(cè)，把試管壁上的水珠和水分蒸發(fā)完；
[0027]B、把原始母種轉(zhuǎn)接到上述經(jīng)檢測(cè)合格的PDA培養(yǎng)基上面，在恒溫箱里22±1°C，黑暗培養(yǎng)17天，使菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；
[0028]C、按甘油:吐溫-80:純凈水= 25%:4%:71 %的容積比配制甘油劑，再將其分裝到耐低高溫的塑料試管中；每個(gè)塑料試管裝甘油劑至其1/2-4/5的總?cè)萘?，進(jìn)行高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌保藏備用；
[0029]D、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌的條件下把PDA斜面試管內(nèi)的培養(yǎng)基分切成3mmX3mm的培養(yǎng)基塊，再將帶菌絲的3-6個(gè)培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的5ml的塑料試管里面，以甘油劑沒(méi)過(guò)菌種塊為標(biāo)準(zhǔn)，蓋上蓋子，用封口膜進(jìn)行密封；
[0030]E、將塑料試管在_18±2°C下先預(yù)冷1-2天后，再轉(zhuǎn)移到_78°C的冰箱里長(zhǎng)期保藏，塑料試管應(yīng)直立放置，防止試管倒掉或擠壓，長(zhǎng)期保藏的年限為8年以內(nèi)。
[0031]所述A步驟中，PDA斜面試管內(nèi)的TOA培養(yǎng)基含食用級(jí)鹽1.2%，這里是質(zhì)量分?jǐn)?shù)，SP鹽的質(zhì)量占PDA培養(yǎng)基總質(zhì)量的1.2%。
[0032]實(shí)施例三
[0033]本實(shí)施例提出一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，包括以下步驟:
[0034]A、制作PDA斜面試管，經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢測(cè)，把試管壁上的水珠和水分蒸發(fā)完；
[0035]B、把原始母種轉(zhuǎn)接到上述經(jīng)檢測(cè)合格的PDA培養(yǎng)基上面，在恒溫箱里22±1°C，黑暗培養(yǎng)18天，使菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；
[0036]C、按甘油:吐溫-80:純凈水= 30%:2%:68%的容積比配制甘油劑，再將其分裝到耐低高溫的塑料試管中；每個(gè)塑料試管裝甘油劑至其1/2-4/5的總?cè)萘?，進(jìn)行高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌保藏備用；
[0037]D、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌的條件下把PDA斜面試管內(nèi)的培養(yǎng)基分切成3mmX3mm的培養(yǎng)基塊，再將帶菌絲的3-6個(gè)培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的5ml的塑料試管里面，以甘油劑沒(méi)過(guò)菌種塊為標(biāo)準(zhǔn)，蓋上蓋子，用封口膜進(jìn)行密封；
[0038]E、將塑料試管在_18±2°C下先預(yù)冷1-2天后，再轉(zhuǎn)移到85°C的冰箱里長(zhǎng)期保藏，塑料試管應(yīng)直立放置，防止試管倒掉或擠壓，長(zhǎng)期保藏的年限為8年以內(nèi)。
[0039]所述A步驟中，PDA斜面試管內(nèi)的TOA培養(yǎng)基含食用級(jí)鹽1.4%，這里是質(zhì)量分?jǐn)?shù)，SP鹽的質(zhì)量占PDA培養(yǎng)基總質(zhì)量的1.4%。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，其特征在于，包括以下步驟: A、制作PDA斜面試管，做好后經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢測(cè)，把試管壁上的水珠和水分蒸發(fā)消失； B、把原始母種轉(zhuǎn)接到上述經(jīng)檢測(cè)合格的PDA培養(yǎng)基上面，在恒溫箱里22±1°C，黑暗培養(yǎng)16-18天，使菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基； C、按甘油:吐溫-80:純凈水=15 %-30 %: 0-5 %: 65-80 %的容積比配制甘油劑，再將其分裝到耐高、低溫的塑料試管中；每個(gè)塑料試管裝甘油劑至其1/2-4/5的總?cè)萘浚M(jìn)行高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌保藏備用； D、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌的條件下把PDA斜面試管內(nèi)的培養(yǎng)基分切成培養(yǎng)基塊，再將帶菌絲的數(shù)個(gè)培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的塑料試管里面，以甘油劑沒(méi)過(guò)菌種塊為標(biāo)準(zhǔn)，蓋上蓋子，用封口膜進(jìn)行密封； E、將塑料試管在-18± 2°C下先預(yù)冷1-2天后，再轉(zhuǎn)移到-80 ± 5°C的冰箱里長(zhǎng)期保藏。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，其特征在于，所述E步驟中，塑料試管應(yīng)直立分散放置，防止試管倒掉或擠壓。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，其特征在于，所述E步驟中，長(zhǎng)期保藏的年限為8年以內(nèi)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，其特征在于，所述A步驟中，PDA斜面試管內(nèi)的PDA培養(yǎng)基含食用級(jí)鹽0.8%-1.4%。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種杏鮑菇原始母種的超低溫保藏方法，A、制作PDA斜面試管，試管壁上的水珠和水分蒸發(fā)消失；B、把原始母種轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基，在恒溫箱里22±1℃，黑暗培養(yǎng)16-18天，使菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；C、按甘油：吐溫-80：純凈水＝15％-30％：0-5％：80-65％的容積比配制甘油劑，分裝到耐高、低溫的塑料試管中至其1/2-4/5的總?cè)萘?進(jìn)行高壓滅菌后冷卻；D、將帶菌絲的數(shù)個(gè)培養(yǎng)基塊，轉(zhuǎn)移到試管里，甘油劑沒(méi)過(guò)菌種塊，密封；E、將塑料試管在-18±2℃下先預(yù)冷1-2天，再轉(zhuǎn)移到-80±5℃的冰箱里長(zhǎng)期保藏。本發(fā)明能長(zhǎng)達(dá)8年對(duì)杏鮑菇原始母種超低溫保藏，并能保證其菌種活力和遺傳的穩(wěn)定性，不易變異，成本低。
【IPC分類】C12N1/04, C12R1/645
【公開(kāi)號(hào)】CN105505778
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610081333
【發(fā)明人】沈凡超, 陽(yáng)國(guó)秀, 易恢滿, 夏志蘭, 姬建軍
【申請(qǐng)人】湖南省宇秀生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年2月4日