一種鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法,屬于水產(chǎn)生物技術領 域。
【背景技術】
[0002] 泥嫩(Misgurnus anguillicaudatus)和大鱗副泥嫩(Paramisgurnus dabryanus) 分別隸屬于鯉形目鰍科中的泥鰍屬和大鱗副泥鰍屬。這兩種鰍在我國分布廣泛,除我國西 部高原外,自南至北均有分布。因有著較高的食用和藥用價值,它們越來越受到消費者的喜 愛。近年來,隨著市場需求量的不斷增加,這兩種鰍類的野生資源量下降嚴重,導致了它們 的市場價格節(jié)節(jié)攀升,其市場經(jīng)濟價值不可小覷。目前,國內(nèi)已經(jīng)掀起了一股泥鰍和大鱗副 泥鰍的養(yǎng)殖熱潮,大規(guī)模的生產(chǎn)使得優(yōu)良的泥鰍和大鱗副泥鰍苗種的需求量迅速增加。然 而,目前水產(chǎn)市場上泥鰍種質(zhì)資源混雜,純種與雜種難以分辨。如果使用育性較低的雜種作 為親本,從繁育的角度來說,會直接造成繁育場巨大的經(jīng)濟損失。同時,鑒別出泥鰍和大鱗 副泥鰍的純種和雜種,是開展這兩種泥鰍選育和雜交育種工作的重要前提,這直接關乎到 育種工作的成功與否。
[0003] 微衛(wèi)星標記,又稱簡單序列重復(Simple sequence repeats,SSRs),是目前為止 應用最為廣泛的分子標記之一。其應用主要分為三個方向:遺傳多樣性研究、品種鑒定和親 緣關系鑒定、以及遺傳連鎖圖譜構建和QTL定位。線粒體DNA標記作為一種新型的分子工具, 擁有母系遺傳的特點并且缺乏修復重組能力。泥鰍在我國存在多種染色體核型,以二倍體 和四倍體為主。因此,在進行泥鰍的繁育工作時,倍性鑒定一直是一個重要的內(nèi)容,目前,人 們多利用血液進行泥鰍倍性檢測,這對泥鰍的規(guī)格有一定的要求且對泥鰍也有一定的傷 害,如果能通過鰭條對泥鰍倍性進行判定,就能很好地解決上述的問題。
[0004] 近年來,國內(nèi)泥鰍種質(zhì)資源混雜,市場上出現(xiàn)了大量的泥鰍和大鱗副泥鰍雜種。目 前,雖有通過外部形態(tài)、分子標記等對泥鰍和大鱗副泥鰍進行鑒別的方法,卻至今沒有泥鰍 與大鱗副泥鰍純種和雜種的鑒別方法。為繁殖和培育出優(yōu)良的泥鰍苗種,本發(fā)明旨在提供 一種鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明針對目前泥鰍種質(zhì)資源混雜、泥鰍與大鱗副泥鰍雜種大量出現(xiàn)的現(xiàn)狀,提 供了一種能夠鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法。
[0006] 本發(fā)明包括:篩選出4個泥鰍特有的微衛(wèi)星SSR標記(2價8、2附9、4階和4價7)、2個 大鱗副泥鰍特有的微衛(wèi)星SSR標記(PD30和TO50)和1個已知可區(qū)分泥鰍和大鱗副泥鰍的線 粒體標記(MP),設計以上7個標記的引物,并用該引物對待測樣品的基因組DNA進行PCR擴 增,獲得PCR擴增產(chǎn)物并進行凝膠電泳分析。同時,本發(fā)明還用鰭條進行待測樣品的倍性檢 測,對倍性結果和凝膠電泳結果進行綜合分析,從而鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種。
[0007] 更加詳細的方法如下:
[0008] (1)取待測樣本,剪取部分尾鰭組織,將尾鰭組織分成兩份,一份黃豆大小的尾鰭 組織用于倍性檢測;另一部分的尾鰭組織存放在裝滿95%乙醇的1.5ml的離心管中,采用醋 酸銨/異戊醇法提取基因組DNA,然后用紫外分光光度計檢測DNA濃度,并將樣品的質(zhì)量濃度 稀釋至100ngAiL,-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0009] (2)以步驟(1)中的黃豆大小的尾鰭組織為樣本,利用倍性分析儀進行倍性檢測;
[0010] (3)以步驟(1)中的DNA為模版,以7個標記的引物進行PCR擴增,獲得PCR擴增產(chǎn)物, 然后進行凝膠電泳分析;
[0011 ]所述7個標記的名稱及其引物序列為:
[0012]
[0013] (4)對步驟(2)中獲得的倍性結果和步驟(3)中獲得的凝膠電泳結果進行綜合分 析,二倍體的樣本中,僅4個泥鰍特有的SSR標記和線粒體標記有擴增產(chǎn)物的樣本是二倍體 泥鰍罕X二倍體泥鰍Λ僅2個大鱗副泥鰍特有的SSR標記和線粒體標記有擴增產(chǎn)物的樣本 是大鱗副泥鰍罕X大鱗副泥鰍Λ在泥鰍和大鱗副泥鰍特有SSR標記都有擴增產(chǎn)物的情況 下,線粒體標記的擴增產(chǎn)物為大小285bp條帶的樣本是二倍體泥鰍罕X大鱗副泥鰍Λ而線 粒體標記的擴增產(chǎn)物為大小214bp條帶的樣本是大鱗副泥鰍罕X二倍體泥鰍Λ三倍體的樣 本中,在泥鰍和大鱗副泥鰍特有SSR標記都有擴增產(chǎn)物的情況下,線粒體標記的擴增產(chǎn)物為 大小285bp條帶的樣本是四倍體泥鰍罕X大鱗副泥鰍Λ而線粒體標記的擴增產(chǎn)物為大小 214bp條帶的樣本是大鱗副泥鰍罕X四倍體泥鰍Λ四倍體的樣本是四倍體泥鰍罕X四倍體 泥鰍Λ僅4個泥鰍特有的SSR標記和線粒體標記有擴增產(chǎn)物。
[0014]所述步驟(2)的倍性檢測方法為:加200yL細胞核提取液在黃豆大小的尾鰭組織樣 本上,刀片切割數(shù)次,然后加800yL細胞染色液,避光染色lmin,接著用30μηι濾網(wǎng)過濾,然后 用PBS定容至800yL上倍性分析儀檢測倍性。
[0015]步驟(3)中所述的PCR擴增的總體積為10yL,其中含lOOng/yL的模板DNA 0.5yL, 1 · OyL的 lOxBuffer,0 · 2yL的 10mmol/L dNTPs,0 · lyL的0 · 5IU/yL的Taq DNA聚合酶,lOnmol/ L正向及反向SSR引物各0.25yL,余量為雙蒸水。
[0016]步驟(3)中所述的PCR擴增的程序為:PCR循環(huán)參數(shù)為:94°C5min;然后30個循環(huán),每 個循環(huán)包括94°C lmin,退火溫度下30s,72°C lmin;最后72°C5min延伸;然后4°C保存。
[0017] 步驟(3)中所述的凝膠電泳分析采用1.0 % -2.0 %的MetaPhor瓊脂糖凝膠上電泳。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的優(yōu)點:
[0019] 本發(fā)明所闡述的方法是基于4個泥鰍特有的微衛(wèi)星SSR標記(2N18、2N19、4N7和 4N17)、2個大鱗副泥鰍特有的微衛(wèi)星SSR標記(PD30和PD50)、1個已知可區(qū)分泥鰍和大鱗副 泥鰍的線粒體標記(MP)、以及1種用鰭條進行泥鰍倍性檢測的方法所建立的。利用本方法, 可高效且快速地對泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種進行鑒別,為解決目前泥鰍市場種質(zhì)資源 混亂局面提供了一種準確快捷的鑒別方法。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例一中隨機選擇的一條二倍體泥鰍純種的倍性檢測圖。
[0021 ]圖2為實施例一的泥鰍特有的SSR標記4N7的PCR產(chǎn)物電泳檢測部分結果,其中Μ為 DNA Mark I,DD1-DD5為二倍體泥鰍純種樣品,ΤΤ1-ΤΤ5為四倍體泥鰍純種樣品,ΡΡ1-ΡΡ5為 大鱗副泥鰍純種樣品,TP1-TP5為雜種TP樣品,PT1-PT5為雜種PT樣品。
[0022]圖3為實施例一中大鱗副泥鰍特有的SSR標記TO30的PCR產(chǎn)物電泳檢測部分結果, 其中Μ為DNA Mark I,DD1-DD5為二倍體泥鰍純種樣品,TT1-TT5為四倍體泥鰍純種樣品, PP1-PP5為大鱗副泥鰍純種樣品。
[0023]圖4為實施例一中線粒體標記MP的PCR產(chǎn)物電泳檢測部分結果,其中Μ為DNA Mark I,PD1-PD5為雜種ro樣品,DP1-DP5為雜種DP樣品。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。
[0025] 實施例一:
[0026] 本實例所用的泥鰍與大鱗副泥鰍成魚購買自湖北省武漢市白沙洲水