1^^6〇^444(：-3'，所述核苷酸 序列為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGTAC-3'， 所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0028] dtms53/Hpy99I 的上游引物序列為5 ' -CGGCCCGGCCCATCGTGCTTCGT-3 '，所述核苷酸 序列為SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCCGTC-3'， 所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0029] 應用下述步驟檢測35個水稻品種中的tms5基因。
[0030] 1.DNA 提取
[0031] (1)將35個水稻品種的種子分別置于預先標號的培養(yǎng)皿，30°C發(fā)芽7天。
[0032] (2)剪取水稻幼苗葉片2~3cm，剪成0.5cm長的碎片，放入2. OmL離心管中。
[0033] (3)加入450μ1 DNA提取液和一顆鋼珠，應用組織研磨儀進行研磨。
[0034] (4)加入450μ1氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。
[0035] (5) 11，OOOrpm離心2分鐘至清晰分相。吸取上清液400μ1，轉入新的1.5ml離心管 中，棄槍頭。
[0036] (6)加入800μ1預冷的無水乙醇，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。_20°C放置30分鐘。
[0037] (7)11，000rpm離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，棄上清液。
[0038] (8)用70%乙醇洗滌沉淀2遍，將1.5ml離心管倒置于紙上，自然干燥。
[0039] (9)加入100μ 1的1 /10 X TE緩沖液溶解沉淀。
[0040] (10)取 2μ1 進行 PCR 擴增。
[0041 ] 2.PCR 擴增
[0042]采用1〇μ1 反應體系，Tris-HCl (pH 8 · 8)33 · 5mM，（NH4)2S〇48 · 0mM，MgCl2l · 5mM， TWEEN-200.05%，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/yl，Taq DNA聚合酶2.0單位，模版DNA SOngWCR反應條件具體參數(shù)為:94°C2分鐘;94°C45秒、63°C45秒、72°C1分鐘，30個循環(huán);72 °C8分鐘。。
[0043] 3.PCR產(chǎn)物的酶切反應
[0044] 在10μ1的PCR產(chǎn)物中加入3.0單位的限制性內(nèi)切酶，1.5μ1的10\8此€61并加 ddH20至15μ1。反應條件:Pvul和Hpy99I限制性內(nèi)切酶37°C，3小時;BsiWI為55°C，3小時。 [0045] 4.酶切產(chǎn)物電泳及顯色
[0046] 在酶切產(chǎn)物中加入10*NEBuffer，每樣品取8μ1上樣于3%瓊脂糖凝膠;接通電極， 在100V恒定電壓下電泳4小時，關閉電源;取下凝膠，GelRed核酸染色液顯色。
[0047] dtms51/PvuI對35個水稻品種的凝膠電泳圖如圖1所示:其中，01-04為未攜帶tms5 基因的水稻恢復系，為可育材料，tmS51/PvuI擴增產(chǎn)物可以被酶切，酶切后電泳譜帶為 142bp，05-35為攜帶純合tms5基因的兩系溫敏核不育系，tms51/PvuI擴增產(chǎn)物不能被酶切， 攜有tms5基因的溫敏核不育系譜帶為165bp，因此dtms51/PvuI特異性功能標記能從水稻品 種中篩選出攜帶tms5基因的溫敏核不育系。
[0048]實施例2、特異性dCAPS分子標記在水稻溫敏核不育系選育中的應用驗證 [0049] 2015年將深08S/宜香B的F2群體種植在中國水稻研究所實驗基地，植株幼苗期取 少量葉片提取DNA。
[0050] 1.DNA 提取
[0051 ] (1)剪取水稻幼苗葉片2~3cm，剪成0 · 5cm長的碎片，放入2 · OmL離心管中。
[0052] (2)加入450μ1 DNA提取液和一顆鋼珠，應用組織研磨儀進行研磨。
[0053] (3)加入450μ1氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。
[0054] (4) 11，OOOrpm離心2分鐘至清晰分相。吸取上清液400μ1，轉入新的1.5ml離心管 中，棄槍頭。
[0055] (5)加入800μ1預冷的無水乙醇，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。-20°C放置30分鐘。
[0056] (6)11，000rpm離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，棄上清液。
[0057] (7)用70%乙醇洗滌沉淀2遍，將1.5ml離心管倒置于紙上，自然干燥。
[0058] (8)加入100μ 1的1 /10 X TE緩沖液溶解沉淀。
[0059] (9)取 2μ1 進行 PCR 擴增。
[0060] 2.PCR 擴增
[0061 ]采用1〇μ1 反應體系，Tris-HCl (pH 8 · 8)33 · 5mM，（NH4)2S〇48 · 0mM，MgCl2l · 5mM， TWEEN-200.05%，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/yl，Taq DNA聚合酶2.0單位，模版DNA SOngWCR反應條件具體參數(shù)為:94°C2分鐘;94°C45秒、63°C45秒、72°C1分鐘，30個循環(huán);72 °C8分鐘。。
[0062] 3.PCR產(chǎn)物的酶切反應
[0063] 在10μ1的PCR產(chǎn)物中加入3.0單位的限制性內(nèi)切酶，1.5μ1的10\8此€61并加 ddH20至15μ1。反應條件:Pvul和Hpy99I限制性內(nèi)切酶37°C，3小時;BsiWI為55°C，3小時。 [0064] 4.酶切產(chǎn)物電泳及顯色
[0065] 在酶切產(chǎn)物中加入10*NEBuffer，每樣品取8μ1上樣于3%瓊脂糖凝膠；接通電極， 在100V恒定電壓下電泳4小時，關閉電源;取下凝膠，GelRed核酸染色液顯色。
[0066] dtms51/PvuI對35個水稻品種的凝膠電泳圖如圖1所示:其中，01-24為未攜帶tms5 基因和攜帶雜合tms5基因的24個可育單株，為可育材料，tms51/PvuI擴增產(chǎn)物可以被酶切， 酶切后電泳譜帶為142bp，可育單株表現(xiàn)為花粉可育（圖2A、圖2B); 25-46為攜帶純合tms5基 因的23個不育單株表現(xiàn)為花粉敗育（圖2A、圖2C)，tms51/PvuI擴增產(chǎn)物不能被酶切，譜帶為 165bp，因此dtms51/PvuI特異性功能標記可以育種群體中有效識別攜帶tms5基因的溫敏核 不育系，可以在分子標記輔助選擇育種中廣泛應用。
[0067]以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權項】
1. 一組水稻溫敏核不育基因tms5的功能特異性分子標記，其特征在于該功能特異性分 子標記選自以下3組引物之一： dtms51/PvuI的上游引物序列為5 ' -CATCGTGCTTCGTGCCAAAACGG-3 '，所述核苷酸序列為SEQIDN0:1所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGATC-3'，所述核 苷酸序列為SEQIDN0:2所示的核苷酸序列； 肚111852/88丨11的上游引物序列為5'-〇：041^6了6(：1'1^6了6〇^444(：-3'，所述核苷酸序列為SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGTAC-3'，所述 核苷酸序列為SEQIDN0:4所示的核苷酸序列； dtms53/Hpy99I的上游引物序列為5 ' -CGGCCCGGCCCATCGTGCTTCGT-3 '，所述核苷酸序列 為SEQIDN0:5所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCCGTC-3'，所述 核苷酸序列為SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。2. -種采用權利要求1所述的特異性標記引物檢測水稻溫敏核不育基因tms5的方法， 其特征在于該方法包括如下步驟： 提取待測水稻標本基因組DNA作為模板，利用3對引物中任意一對特異性標記引物對水 稻樣品DNA進行擴增，再對PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進行酶切后電泳，PCR產(chǎn)物源于正常可育 的TMS5基因可以被酶切，而擴增產(chǎn)物源于高溫不育的tms5基因不能被酶切，所以tms51/ Pvul擴增產(chǎn)物酶切后電泳譜帶為可育材料142bp，攜有tms5基因的溫敏核不育系譜帶為 165bp;dtmS52/BsiWI擴增產(chǎn)物酶切后電泳譜帶為可育材料147bp，攜有tms5基因的溫敏核 不育系167bp;dtms53/Hpy99I擴增產(chǎn)物酶切后電泳譜帶為可育材料150bp，攜有tms5基因的 溫敏核不育系169bp;雜交稻水稻材料則會擴增出不育和可育的兩條譜帶。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:所述的特異性標記引物的PCR擴增采用如 下體系：pH8.8 的Tris-HCl33.5mM，（NH4)2S〇4 8.0mM，MgCl2 1.5mM，TWEEN-200.05%， dNTPs0.2mM，上、下游引物各3.3ng/yl，TaqDNA聚合酶2.0單位，模版0嫩50即。4. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:PCR反應條件具體參數(shù)為:94°C2分鐘;94°C 45秒、63°C45秒、72°C1分鐘，30個循環(huán);72°C8分鐘。5. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:特異性標記引物的PCR產(chǎn)物的酶切反應條 件為:反應體系為1〇μ1的PCR產(chǎn)物，3.0單位的內(nèi)切酶，1.5μ1的10XBuffer，加ddH20至15μ1， 反應條件:Pvul和Hpy99I限制性內(nèi)切酶37°C，3小時;BsiWI為55°C，3小時。
【專利摘要】本發(fā)明屬于兩系雜交水稻育種中的分子標記輔助選擇與種子純度檢測技術領域，特別涉及一組水稻溫敏核不育基因tms5的功能特異性分子標記及其應用。一組水稻溫敏核不育基因tms5的功能特異性標記，該特異性標記引物選自：核苷酸序列為SEQ？ID？NO:1、SEQ？ID？NO:2、SEQ？ID？NO:3所示的核苷酸序列。本發(fā)明根據(jù)引起水稻溫敏核不育基因tms5功能變化的單堿基突變(C-A)，設計了一系列能特異擴增野生型C和突變型A的引物，并在3’端位置引入錯配堿基，利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物酶切，將野生型和突變型準確的區(qū)分開。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105483225
【申請?zhí)枴緾N201510967126
【發(fā)明人】應杰政, 張雪, 圣忠華, 張忠旭, 莊杰云
【申請人】中國水稻研究所, 遼寧省水稻研究所
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月18日