水稻溫敏核不育基因tms5的功能特異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于兩系雜交水稻育種中的分子標(biāo)記輔助選擇與種子純度檢測技術(shù)領(lǐng)域， 特別涉及一組水稻溫敏核不育基因 tms5的功能特異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物之一，全國有超過半數(shù)的地區(qū)以稻米為主食，并且隨 著人民生活水平的提高，越來越多的人開始關(guān)注稻米的食味品質(zhì)，因此產(chǎn)量高品質(zhì)好成為 選育水稻新品種的重要標(biāo)準(zhǔn)。雜交水稻的雜種優(yōu)勢在水稻產(chǎn)量和品質(zhì)方面尤為突出，雜交 水稻育種技術(shù)也倍受關(guān)注。目前雜交水稻體系包括三系雜交水稻和兩系雜交水稻，二者的 區(qū)別主要在于不育系的選擇和繁育。兩系法中的不育系具有一系兩用、配組自由、繁種制種 程序簡單等優(yōu)勢，在育種領(lǐng)域發(fā)展迅速。
[0003] 隨著兩系雜交育種方法的廣泛推廣，對水稻兩系不育系的研究也越來越深入。以 往選育兩系不育系主要根據(jù)抽穗開花期的田間表現(xiàn)，花粉鏡鑒，套袋自交等方法，步驟繁 瑣，準(zhǔn)確性低，時間長，見效慢。但是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，更多的分子手段運(yùn)用到兩系不 育系的篩選中，大大提高了選育效率。目前很多水稻光溫敏核不育基因已經(jīng)被定位，有些已 經(jīng)被克隆，對兩系雜交水稻的應(yīng)用起到很大的推動作用。本發(fā)明就是在已經(jīng)定位克隆的溫 敏雄性核不育基因 tms5的研究基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性功能標(biāo)記，并將其應(yīng)用于水稻溫敏核不 育系的選育中。中科院遺傳所利用安農(nóng)S-1X南京11雜交產(chǎn)生的重組自交系F 8代群體，對安 農(nóng)S-1的不育基因進(jìn)行了定位分析，將其溫敏不育基因定位于第2染色體，位于標(biāo)記C365和 G227之間，并將該基因命名為tms5;進(jìn)一步地，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)現(xiàn)了與tms5基因完全共分離 的EST標(biāo)記HN57,該標(biāo)記位于第2染色體的31.2cM處，并用SSR標(biāo)記和516株F2不育株將其定 位在RMAN7和RMAN54之間的181kb區(qū)域；華南農(nóng)大對安農(nóng)S-1和株1S測序發(fā)現(xiàn)在 0s02g0214300基因的第71個堿基的位置有一個C-A堿基的突變，這個突變導(dǎo)致RNA酶Z S1功能 缺失。RNA酶ZS1能夠在體外和體內(nèi)把3個泛素核糖體L40融合蛋白基因(UbL40)mRNA加工成多 個片段。高溫使得UbL40mRNA水平上升，在tms5突變體中，RNA酶Z S1功能缺失，由于UbL40mRNA 過度積累，導(dǎo)致花粉產(chǎn)量降低和雄性不育，而野生型中過量的UbL40mRNA能被ZS1裂解，育性 正常。
[0004] 本發(fā)明在此基礎(chǔ)上對tms5基因引起水稻溫敏核不育的單堿基突變(C-A)，設(shè)計(jì)了 一系列能特異擴(kuò)增野生型C和突變型A的引物，并在3'端位置引入錯配堿基，利用限制性內(nèi) 切酶對PCR產(chǎn)物酶切，可有效檢測溫敏核不育基因 tms5。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記對水稻溫敏 核不育基因 tms5的檢測具有普遍應(yīng)用價值，可以廣泛地應(yīng)用于tms5的轉(zhuǎn)育研究和兩系雜交 稻種子的純度檢測中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一組水稻溫敏核不育基因 tms5的特異性標(biāo)記引物，用于利用分子標(biāo)記 輔助選擇技術(shù)快速高效地篩選出具有溫敏核不育基因 tms5的水稻材料。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -組水稻溫敏核不育基因 tms5的功能特異性標(biāo)記，該特異性標(biāo)記引物為：
[0008] dtms51/PvuI的上游引物序列為5 ' -CATCGTGCTTCGTGCCAAAACGG-3'，所述核苷酸序 列為SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGATC-3'，所 述核苷酸序列為SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0009] 肚111852/88丨11的上游引物序列為5'-0〇^1^6了6(：1'1^^6〇^六六六(：-3'，所述核苷酸 序列為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGTAC-3'， 所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0010] dtms53/Hpy99I的上游引物序列為5 ' -CGGCCCGGCCCATCGTGCTTCGT-3 '，所述核苷酸 序列為SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCCGTC-3'， 所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0011] 本發(fā)明所述的水稻溫敏核不育基因 tms5的功能特異性分子標(biāo)記，可用于利用分子 標(biāo)記輔助選擇技術(shù)快速高效地篩選出具有溫敏核不育基因 tms5的水稻材料。3個位于水稻 溫敏不育基因 tms5上的 dCAPs標(biāo)記：dtms51/PvuI、dtms52/BsiWI 和 dtms53/Hpy99I。
[0012] 根據(jù)研究報道的溫敏核不育基因 tms5的序列分析結(jié)果，tms5是功能缺失的基因， 其功能缺失是開放閱讀框的第71個堿基由C 一 A的突變導(dǎo)致，即水稻品種tms5開放閱讀框第 71個堿基為C時，環(huán)境高溫和低溫條件下可育，tms5開放閱讀框第71個堿基為A時，高溫不 育，低溫可育。利用這個SNP突變，本發(fā)明設(shè)計(jì)了 3個位于tms5基因內(nèi)的dCAPS標(biāo)記。這3個 dCAPS標(biāo)記用于判定水稻材料是否為溫敏型不育材料，從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇溫敏核不育 系，并鑒定兩系雜交水稻的種子純度。
[0013] -種采用所述的特異性標(biāo)記引物檢測水稻溫敏核不育基因 tms5的方法，該方法包 括如下步驟：
[0014]提取待測水稻標(biāo)本基因組DNA作為模板，利用3對引物中任意一對特異性標(biāo)記引物 對水稻樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再對PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后電泳，PCR產(chǎn)物源于正常 可育的TMS5基因可以被酶切，而擴(kuò)增產(chǎn)物源于高溫不育的tms5基因不能被酶切，所以 tms51/PvuI擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳譜帶為可育材料142bp，攜有tms5基因的溫敏核不育系譜 帶為165bp; dtms52/BsiWI擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳譜帶為可育材料147bp，攜有tms5基因的溫 敏核不育系167bp; dtms53/Hpy99I擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳譜帶為可育材料150bp，攜有tms5基 因的溫敏核不育系169bp;雜交稻水稻材料則會擴(kuò)增出不育和可育的兩條譜帶。
[0015] 所述的特異性標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增采用如下體系：pH 8.8的Tr i s-HC13 3.5mM， (順4)2SO48 · OmM，MgCl21 · 5mM，TWEEN-200 · 05 %，dNTPs 0 · 2mM，上、下游引物各3 · 3ng/yl，Taq DNA聚合酶2.0單位，模版DNA50ng。
[0016] 作為優(yōu)選，PCR反應(yīng)條件具體參數(shù)為：94°C2分鐘；94°C45秒、63°C45秒、72°C 1分鐘， 30個循環(huán);72°C8分鐘。
[0017] 作為優(yōu)選，特異性標(biāo)記引物的PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)條件為:反應(yīng)體系為10μ1的PCR 產(chǎn)物，3.0單位的內(nèi)切酶，1.5μ1的10 X Buffer，加 ddH20至15μ1，反應(yīng)條件:Pvul和Hpy99I限 制性內(nèi)切酶37°C，3小時;Bs iWI為55°C，3小時。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明屬于兩系雜交水稻育種中的分子標(biāo)記輔助選擇與種 子純度檢測技術(shù)領(lǐng)域，開發(fā)了水稻溫敏核不育基因 tms5的一系列功能特異性的衍生酶切擴(kuò) 增多態(tài)性序列（derived cleaved amplified polymorphic sequences,dCAPS)分子標(biāo)記。
[0019] 本發(fā)明根據(jù)引起水稻溫敏核不育基因 tms5功能變化的單堿基突變(C-A)，設(shè)計(jì)了 一系列能特異擴(kuò)增野生型C和突變型A的引物，并在3'端位置引入錯配堿基，利用限制性內(nèi) 切酶對PCR產(chǎn)物酶切，將野生型和突變型準(zhǔn)確的區(qū)分開。這些分子標(biāo)記的開發(fā)有助于運(yùn)用分 子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)準(zhǔn)確有效地篩選到具有tms5基因的水稻溫敏核不育系，節(jié)省育種時 間，加快育種進(jìn)程，降低育種成本，整個檢測過程操作簡單且準(zhǔn)確性高。
【附圖說明】
[0020] 圖1 dtms51 /Pvu I對35個水稻品種的凝膠電泳圖，其中，Μ:分子量標(biāo)記;01 -04:未 攜帶tms5基因的恢復(fù)系內(nèi)香恢2156、成恢727、岳恢9113和中恢161;05-35:攜帶純合加85基 因溫敏核不育系瑞97S、128S、雨03S、株15、6285、335、雨065、18925、深085、冊385、中廣5、 C815S、科08S、MS、龍S、廣占63S-4、BPH68S、Y04S、潭農(nóng)S、占 S、旭98S、089S、134S、152S、163S、 廣湘 24S、井大 1S、福龍 3、23013、7643、望3;
[0021 ] 圖2 dtms51/PvuI在深08S/宜香B的F2群體中篩選溫敏雄性核不育單株的凝膠電 泳和花粉粒染色圖，其中：圖2A dtms51/PvuI在深08S/宜香B的F2群體中篩選溫敏雄性核不 育單株的凝膠電泳，Μ:分子量標(biāo)記;01-24:未攜帶tms5基因和攜帶雜合tms5基因的24個可 育單株;25-46:攜帶純合tms5基因的23個不育單株;S:母本深08S; Y:父本宜香B;圖2B，可育 單株的1 % I2-KI溶液花粉粒染色圖；圖2C，不育單株的1 % I2-KI溶液花粉粒染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā) 明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0023] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等 均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常 規(guī)方法。
[0024] 實(shí)施例1、水稻溫敏核不育基因 tms5的特異性dCAPS分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)與篩選
[0025] 根據(jù)研究報道的溫敏核不育基因 tms5的序列分析結(jié)果，tms5是功能缺失的基因， 其功能缺失是開放閱讀框的第71個堿基由C 一 A的突變導(dǎo)致，即水稻品種tms5開放閱讀框第 71個堿基為C時，環(huán)境高溫和低溫條件下皆可育，tms5開放閱讀框第71個堿基為A時，高溫不 育，低溫可育。利用這個SNP突變，本發(fā)明設(shè)計(jì)篩選了 3個位于tms5基因內(nèi)的dCAPS標(biāo)記，具體 為：
[0026] dtms51/PvuI的上游引物序列為5 ' -CATCGTGCTTCGTGCCAAAACGG-3'，所述核苷酸序 列為SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；下游引物序列5'-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGATC-3'，所 述核苷酸序列為SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0027] 肚111852/88丨11的上游引物序列為5'-0〇^1^6了6(：1'