一種解脲芽孢桿菌及其生產(chǎn)高溫過氧化氫酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一株解脲芽孢桿菌及其生產(chǎn)高溫過氧化氫酶的方法。屬于生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫是一種強氧化劑，廣泛應(yīng)用與工業(yè)、食品和醫(yī)療領(lǐng)域的漂白和消毒，但是其殘留物對生產(chǎn)工藝和身體健康有很大影響。過氧化氫酶可以特異性的將過氧化氫分解為無毒的水和氧氣，是一種高效環(huán)保的過氧化氫去除方法。過氧化氫酶廣泛存在于動植物和好氧微生物中，最初過氧化氫酶是從豬、牛等動物肝臟中提取純化的，但該方法受限于原料、成本和季節(jié)等因素，且工藝復(fù)雜，易污染，酶的穩(wěn)定性也較差。相比而言微生物發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶則有產(chǎn)量大、活性高、酶學(xué)性質(zhì)豐富、成本低廉等諸多優(yōu)點。因工業(yè)上過氧化氫酶的作用環(huán)境多為高溫，堿性等惡劣條件，因此篩選耐高溫過氧化氫酶菌株對紡織印染等工業(yè)具有重要意義目前國外已有相關(guān)微生物發(fā)酵過氧化氫酶商品，國內(nèi)有一些文獻及專利報道過氧化氫酶產(chǎn)酶菌株，但對耐熱過氧化氫酶的研究及報道較少，其中多數(shù)菌株產(chǎn)酶能力在每毫升發(fā)酵液幾百至幾千個酶活力單位，僅江南大學(xué)陳堅教授和浙江大學(xué)謝雪鳳文獻中報道菌株酶產(chǎn)量達到3000 U/mL和2500 U/mL左右。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)高溫過氧化氫酶的菌株，通過液體發(fā)酵得到高酶活的過氧化氫酶酶液，該酶液可以高效分解過氧化氫?；谝陨习l(fā)現(xiàn)提出了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一株新型高溫過氧化氫酶高產(chǎn)菌株，和以酵母粉為氮源，牛肉膏為碳源發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的工藝。所產(chǎn)過氧化氫酶制劑活性高，生產(chǎn)成本低廉，熱穩(wěn)定性好，適于紡織、造紙等生產(chǎn)工藝中殘留過氧化氫的去除。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案:
所述解脈芽抱桿菌(1^6讓&(3；111118 1:1161'1]108口11&61'；[(3118)1^1'-2，該菌種已于2015年12月9日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2015733。
[0005]1、菌株的篩選及鑒定
(1)篩選:挑取從堆肥中分離純化的細菌純培養(yǎng)于前述液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，取100微升發(fā)酵液加入100微升過氧化氫，有大量氣泡產(chǎn)生的菌株為產(chǎn)酶菌株。
[0006](2)鑒定:對該菌株16S rRNA進行PCR擴增與測序，NCBI數(shù)據(jù)庫比對顯示該菌為解脲芽孢桿菌。
[0007](3)菌株特征:菌落呈扁平的圓形，周圍乳白色，中間透明，邊緣光滑，易于挑起。光鏡下菌體為桿狀。
[0008](4)過氧化氫酶活性測性方法:發(fā)酵液超聲破碎直至澄清，用pH 7.0的roS緩沖液稀釋適當倍數(shù)后備用。過氧化氫酶酶活測定方法為:2.9 ml反應(yīng)液(pH 7.0,0.2 M PBS,20mM H2O2)迅速加入0.1 ml酶液中，在240 nm波長下測定吸光度的變化，每隔5s計數(shù)一次。H2O2的摩爾消光系數(shù)為43.6。過氧化氫酶酶活的定義為酶分鐘消耗1微摩爾H2O2所用的酶量為1 U。
[0009]2、應(yīng)用菌株KAT-2發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶。工藝如下:
(1)種子液制備:
種子培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環(huán)單菌落置于50 ml種子液培養(yǎng)基中，55 °C培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。
[0010](2)發(fā)酵產(chǎn)酶:
產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉5-30 g/L，牛肉膏10-35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0011]發(fā)酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為40?55°C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時間為12-28 h，發(fā)酵液超聲破碎即為過氧化氫酶酶液。應(yīng)用上述方法發(fā)酵獲得的酶液活力達到41426 U/mlo
[0012]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首先提供了一株高產(chǎn)過氧化氫酶菌株，液體搖瓶培養(yǎng)酶活達41426 U/ml以上。該菌生長速度快，發(fā)酵時間短;培養(yǎng)基成分簡單，以酵母粉為氮源，牛肉膏為碳源的培養(yǎng)基可以極大促進該菌株產(chǎn)酶，發(fā)酵過程無需過氧化氫或乙醇等誘導(dǎo)，工藝簡單，成本低廉，該酶溫度穩(wěn)定性好，其最適反應(yīng)溫度為55 °C，在60 °C條件下保溫90min仍能保持60%以上的活性。應(yīng)用該菌株及配套工藝制備的過氧化氫酶可以應(yīng)用于食品加工和造紙紡織等工業(yè)，因此本發(fā)明提供的菌種及工藝具有廣泛的應(yīng)用前景和明顯的經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0013]應(yīng)用菌株KAT-2發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶。工藝如下:
(1)種子液制備:
種子培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環(huán)單菌落置于50 ml種子液培養(yǎng)基中，55 °C培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。
[0014](2)發(fā)酵產(chǎn)酶:
產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉5-30 g/L，牛肉膏10-35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0015]發(fā)酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為40?55°C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時間為12?28 h，發(fā)酵液超聲破碎即為過氧化氫酶酶液。
[0016]實施例1:產(chǎn)酶菌株KAT-2的篩選及鑒定
挑取一環(huán)各菌株純培養(yǎng)分別轉(zhuǎn)接于含有50 ml前述液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，分別取一定量發(fā)酵液加入等體積過氧化氫觀察產(chǎn)氣泡情況。有氣泡產(chǎn)生者為過氧化氫酶產(chǎn)酶菌株，選擇產(chǎn)氣泡最劇烈的菌株KAT-2作為過氧化氫酶生產(chǎn)用菌。將菌株KAT-2的發(fā)酵液冰浴超聲破碎直至澄清，破碎條件為300 W，破碎2 s停頓3 s，將破碎液用roS緩沖液稀釋20倍測量酶活。過氧化氫酶活力測定方法為:2.9 ml反應(yīng)液(02 M PBS pH 7.0,20 mM H2O2)迅速加入0.lml酶液中，在240nm波長下測定吸光度的變化，每隔5s計數(shù)一次。H202的摩爾消光系數(shù)為43.6。過氧化氫酶酶活的定義為酶分鐘消耗1微摩爾H202所用的酶量為1U。測得此時過氧化氫酶活性為1239 U/ml。取3 ml菌液用細菌基因組提取試劑盒提取該菌基因組，用細菌16S rDNA通用引物(27F和1492R)PCR擴增該菌的16S rDNA，擴增程序為94 °C變性1min，55 °C退火1 min，72 °C延伸2 min，擴增循環(huán)數(shù)為35個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物送生物公司測序，序列如SEQ ID N0.1所示，在NCBI進行序列比對后確認該菌為解脲芽孢桿菌。
[0017]實施例2:菌株發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶
從斜面上挑取一環(huán)KAT-2純培養(yǎng)于盛有50 ml種子液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，55°C搖床上培養(yǎng)12 h，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。以2%的接種量轉(zhuǎn)接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶的裝液量為50 ml產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為55 °C，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)15 h。取出發(fā)酵液冰浴超聲破碎直至澄清，破碎條件為300 W，破碎2 s停頓3 s。所獲澄清液體即為過氧化氫酶液，此時酶液活性達23147U/ml。
[0018]種子培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0。
[0019]實施例3 種子液制備:
種子培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環(huán)單菌落置于50 ml種子液培養(yǎng)基中，55 °C培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。
[0020]發(fā)酵產(chǎn)酶:
產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉15 g/L，牛肉膏25g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0021]發(fā)酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為50°C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時間為15 h。
[0022]該實施例酶產(chǎn)量達24571 U/ml。
[0023]實施例4:牛肉膏為氮源發(fā)酵產(chǎn)酶種子液制備:
種子培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環(huán)單菌落置于50 ml種子液培養(yǎng)基中，55 °C培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。
[0024]發(fā)酵產(chǎn)酶:
產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉15 g/L，牛肉膏30 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0。
[0025]發(fā)酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為40°C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時間為15 h。
[0026]牛肉膏為30 g/L時產(chǎn)酶量達23865 U/ml。
[0027]實施例5:氯化鈣為無機鹽發(fā)酵產(chǎn)酶種子液制備:
種子培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環(huán)單菌落置于50 ml種子液培養(yǎng)基中，55 °C培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。
[0028]發(fā)酵產(chǎn)酶:
產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉15 g/L，牛肉膏30 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0029]發(fā)酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為40°C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時間為15 h。
[0030]該實施例產(chǎn)酶量達27780 U/ml。
[0031 ] 實施例6
以15 g/L酵母粉，30g/L牛肉膏，1 g/L NaCl，pH為7.0的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶。以實施例2中的發(fā)酵條件和方法，當搖瓶發(fā)酵時間為16h時酶活達26752 U/ml，發(fā)酵28 h后酶活達到41426 U/mlo
[0032]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1.一株產(chǎn)過氧化氫酶的解脲芽孢桿菌，其特征在于:所述菌為解脲芽孢桿菌(Ureibacillus thermosphaericus)KAT_2，該菌種已于2015年12月9日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M 2015733。2.用權(quán)利要求1所述解脲芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的方法，其特征在于:用上述菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)種子液培養(yǎng)和以酵母粉為氮源、牛肉膏為碳源發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的解脲芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的方法，其特征在于:具體工藝為: (1)種子液培養(yǎng): 種子液培養(yǎng)基:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0; 種子液制備:從固體瓊脂平板挑取一環(huán)單菌落置于50 ml種子液培養(yǎng)基中，55 °C培養(yǎng).12 h，轉(zhuǎn)速為 180 r/min； (2)發(fā)酵產(chǎn)酶: 產(chǎn)酶培養(yǎng)基:酵母粉5?30g/L，牛肉膏10~35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0; 發(fā)酵產(chǎn)酶:將種子液以2%接種量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為40?55 °C，轉(zhuǎn)速為.180 r/min，發(fā)酵時間為12?30 h，最終獲得過氧化氫酶液。
【專利摘要】一株解脲芽孢桿菌及及其生產(chǎn)高溫過氧化氫酶的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一株解脲芽孢桿菌，保藏編號為CCTCC？NO：M？2015733。該菌以酵母粉為氮源，牛肉膏為碳源促進產(chǎn)酶，經(jīng)液體發(fā)酵可得到高產(chǎn)量的過氧化氫酶，酶活高達41426？U/ml。本發(fā)明過氧化氫酶制劑制備簡單、酶活性高，造價低廉，且溫度穩(wěn)定性好，在紡織、造紙等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。CCTCC NO：M 201573320151209
【IPC分類】C12N9/08, C12R1/01, C12N1/20
【公開號】CN105483061
【申請?zhí)枴緾N201610034815
【發(fā)明人】林新堅, 陳濟琛, 田燕丹, 賈憲波, 鄭力
【申請人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月20日