利用SAMcell芯片檢測物質(zhì)對細(xì)胞增殖影響的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中利用SAMce11芯片檢測物質(zhì)對細(xì)胞增殖影響的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002] 細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要生理功能之一，是生物體的重要生命特征，是生物體生 長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖已成為評價(jià)細(xì)胞活性、代謝、生理和病理狀況的重 要指標(biāo)。細(xì)胞增殖的研究方法有很多，主要包括:BrdU，EdU，CCK8等方法。其中EdU檢測方法 是最新的細(xì)胞增殖檢測方法。
[0003]EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)是一種胸腺啼啶核苷類似物，其連有的炔經(jīng)基 團(tuán)在天然化合物中很少見，能夠在DNA復(fù)制時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在合成的DNA分子 中，基于ApolΙο?熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即可直接并準(zhǔn)確地檢測出DNA復(fù)制活性，廣 泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復(fù)、病毒繁殖等方面的研究，尤其適 合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及各種藥物的細(xì)胞增殖及活力篩選實(shí)驗(yàn)。
[0004]目前，已經(jīng)開發(fā)了一種SAMcell芯片（Self-assembledCellMicroarray，自組裝 細(xì)胞芯片），該芯片在專利申請200910210565.1中公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何利用SAMcell芯片檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞增殖的 影響。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了利用SAMcell芯片檢測或輔助檢測待測 物質(zhì)對細(xì)胞增殖影響的方法。
[0007]本發(fā)明所提供的利用SAMcell芯片檢測或輔助檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞增殖影響的方 法，包括：
[0008] 1)將待測物質(zhì)與明膠溶液孵育或?qū)⑺龃郎y物質(zhì)與所述明膠溶液和轉(zhuǎn)染試劑孵 育，得到待測轉(zhuǎn)染復(fù)合物;將對照物質(zhì)與所述明膠溶液孵育或?qū)⑺鰧φ瘴镔|(zhì)與所述明膠 溶液和所述轉(zhuǎn)染試劑孵育，得到對照轉(zhuǎn)染復(fù)合物；
[0009]所述明膠溶液由明膠、纖維連接蛋白和水組成，所述明膠溶液中明膠的質(zhì)量百分 含量為0.25%-0.4%，纖維連接蛋白的質(zhì)量百分含量為0.01 % ;所述對照物質(zhì)對細(xì)胞的增 殖無影響；
[0010] 2)將所述待測轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到SAMcell芯片上，得到固定待測物質(zhì)的芯片;將所 述對照轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到SAMcell芯片上，得到固定對照物質(zhì)的芯片；
[0011] 3)將細(xì)胞接種到所述固定待測物質(zhì)的芯片和所述固定對照物質(zhì)的芯片上，在相同 條件下培養(yǎng)，分別得到固定待測物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)芯片和固定對照物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)芯片，將 所述固定待測物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)芯片和所述固定對照物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)芯片分別命名為芯片1 和芯片2;統(tǒng)計(jì)所述芯片1和所述芯片2上的細(xì)胞數(shù)目，確定所述待測物質(zhì)對所述細(xì)胞增殖的 影響：如所述芯片1上的細(xì)胞數(shù)目顯著大于所述芯片2上的細(xì)胞數(shù)目，所述待測物質(zhì)對所述 細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用或候選具有促進(jìn)作用；如所述芯片1上的細(xì)胞數(shù)目顯著小于所述 芯片2上的細(xì)胞數(shù)目，所述待測物質(zhì)對所述細(xì)胞的增殖具有抑制作用或候選具有抑制作用； 如所述芯片1上的細(xì)胞數(shù)目等于所述芯片2上的細(xì)胞數(shù)目，所述待測物質(zhì)對所述細(xì)胞的增殖 沒有影響或候選沒有影響。
[0012]上述方法中，所述待測物質(zhì)與所述對照物質(zhì)均可為siRNA、質(zhì)粒、DNA片段、蛋白質(zhì)、 多肽或小分子化合物。
[0013] 上述方法中，所述待測物質(zhì)可為siRNA，所述待測物質(zhì)與所述明膠溶液的比例可為 (1 -5 )yg: 7.5μ1 (如2yg: 7.5μ1)。所述對照物質(zhì)可為序列1和序列2所示的siRNA。
[0014] 上述方法中，所述待測物質(zhì)可為蛋白質(zhì)，所述待測物質(zhì)與所述明膠溶液的比例可 為（1 X 10-3-1 )ng:10μ1(如1 X 10-2ng:10μ1)。所述對照物質(zhì)可為BSA。
[0015] 上述方法中，所述待測物質(zhì)可為小分子化合物，所述待測物質(zhì)與所述明膠溶液的 比例為（1X10-3-1)yg: 1〇μ1 (如5 X10-2yg:10μ1)。所述對照物質(zhì)可為DMS0。
[0016] 上述方法中，步驟1)中所述孵育均可在室溫下進(jìn)行；
[0017] 和/或，所述轉(zhuǎn)染試劑可為Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。
[0018] 上述方法中，步驟1)中所述孵育的時(shí)間可為3-10分鐘(如5分鐘）。
[0019]上述方法中，步驟2)中，所述將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到SAMcell芯片上可包括將所 述轉(zhuǎn)染復(fù)合物點(diǎn)在用于固定所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物的區(qū)域（即沒有被聚-N-異丙基丙烯酰胺膜 (PNI膜)薄膜的區(qū)域）；所述將所述對照轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到SAMcell芯片上可包括將所述對 照轉(zhuǎn)染復(fù)合物點(diǎn)在用于固定所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物的區(qū)域（即沒有被聚-N-異丙基丙烯酰胺膜 (PNI膜)薄膜的區(qū)域）。
[0020] 上述方法中，所述方法還可包括將所述固定待測物質(zhì)的芯片進(jìn)行干燥和將所述固 定對照物質(zhì)的芯片進(jìn)行干燥。所述干燥均可在室溫下進(jìn)行，所述干燥的時(shí)間均可大于12小 時(shí)。
[0021] 上述方法中，所述細(xì)胞可為動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。所述動(dòng)物細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì) 胞(如Huh7細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞或!fepG2細(xì)胞）。
[0022] 上述方法還可包括將所述固定待測物質(zhì)的芯片在室溫下放置去除聚-N-異丙基丙 烯酰胺膜(PNI膜)薄膜和/或?qū)⑺龉潭▽φ瘴镔|(zhì)的芯片在室溫下放置去除聚-N-異丙基丙 烯酰胺膜(PNI膜)薄膜。所述放置時(shí)間均可為5分鐘。
[0023] 所述方法還可包括用PBS對所述固定待測物質(zhì)的芯片和/或所述固定對照物質(zhì)的 芯片進(jìn)行清洗。
[0024] 本發(fā)明中，步驟3)中所述培養(yǎng)在所述細(xì)胞的適宜生長條件下進(jìn)行，所述培養(yǎng)的時(shí) 間可為24-72小時(shí)，如48小時(shí)。
[0025]本發(fā)明中，處于增殖時(shí)期的細(xì)胞數(shù)目可用Edu進(jìn)行檢測。
[0026]實(shí)驗(yàn)證明，表明，利用SAMcell芯片檢測或輔助檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞增殖影響的方 法可以檢測VCR對細(xì)胞增殖的抑制和促進(jìn)作用：如CDK6的siRNA對細(xì)胞增殖的抑制作用， IGF-1蛋白對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及VCR對細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0027]本發(fā)明的方法有機(jī)結(jié)合了細(xì)胞芯片技術(shù)、定點(diǎn)轉(zhuǎn)染技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)，可以方 便地、有效地、準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞增殖并應(yīng)用于大規(guī)模篩選研究。
【附圖說明】
[0028]圖1為利用SAMcell芯片技術(shù)檢測⑶K6siRNA對細(xì)胞增殖的影響。其中A為熒光顯微 鏡下照片，Hoechst為細(xì)胞核染料Hoechst33342對細(xì)胞核染色的結(jié)果，用來指示細(xì)胞總數(shù)； B為定量結(jié)果。
[0029]圖2為利用SAMcell芯片技術(shù)檢測IGF-1蛋白對細(xì)胞增殖的影響。其中A為熒光顯微 鏡下照片，Hoechst為細(xì)胞核染料Hoechst33342對細(xì)胞核染色的結(jié)果，用來指示細(xì)胞總數(shù)； B為定量結(jié)果。
[0030] 圖3為利用SAMcell芯片技術(shù)檢測VCR對細(xì)胞增殖的影響。其中A為熒光顯微鏡下照 片，Hoechst為細(xì)胞核染料Hoechst33342表示對細(xì)胞核染色的結(jié)果，用來指示細(xì)胞總數(shù);B 為定量結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0032]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034]下述實(shí)施例中所用的SAMcell芯片（自組裝細(xì)胞芯片）包括基底，在基底上設(shè)有用 于固定所述轉(zhuǎn)染siRNA的區(qū)域;在基底上除用于固定所述轉(zhuǎn)染siRNA的區(qū)域外的其他區(qū)域覆 蓋抑制細(xì)胞生長的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜(PNI膜）；具體構(gòu)建方法如下：
[0035]用去垢劑和超純水清洗實(shí)驗(yàn)室常用的玻片（25毫米*25毫米)表面。在其表面滴一 層聚合物薄膜，使用65微升6%(W/V)的Poly(N-isopropylacrylamide)乙醇溶液，干燥后， 在室溫保存12小時(shí)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求制備硅片掩模，利用微加工技術(shù)可在其上刻出微孔，得 到SAMcell芯片（自組裝細(xì)胞芯片），SAMcell芯片的制備方法在專利申請200910210565.1中 公開。
[0036] 實(shí)施例1、利用SAMcell芯片技術(shù)轉(zhuǎn)染siRNA檢測細(xì)胞增殖
[0037]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的步驟如下(將隨機(jī)siRNA作為陰性對照，隨機(jī)siRNA序列為:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3'（序列1);
[0038] 5 ' -ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 '（序列2)):
[0039] 1、在96孔板的每個(gè)孔中加入3μ1含鹿糖的Opti-MEM和2 · 5μ1Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen;貨號11668-019)，充分混勻，室溫孵育5分鐘；再向上述處理后的每 個(gè)孔中加入2yg的siRNA(該siRNA的靶基因?yàn)镃DK6,將其命名為CDK6siRNA，其序列為：5'_ GUUUGUAACAGAUAUCGAUtt-3'（序列3);
[0040] 5' -AUCGAUAUCUGUUACAAACtt-3 '（序列4)。），充分混勻，室溫孵育20分鐘；最后向上 述處理后的每個(gè)孔中加入7.5μ1的明膠溶液(該溶液由明膠(Sigma公司、貨號G-9391)、纖維 連接蛋白（Sigma公司、貨號F0895)和水組成，其中明膠在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.25 %， 纖維連接蛋白在溶液中的質(zhì)量百分含量為〇. 〇 1 % )，充分混勻，室溫孵育5分鐘。得到混合液 即為反向轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物。
[0041 ] 2、利用點(diǎn)樣儀將反向轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物分別交錯(cuò)地點(diǎn)在SAMcel1芯片的沒有被聚 合物薄膜的部分區(qū)域，干燥過夜(室溫，大于12h)，得到固定siRNA復(fù)合物的芯片。
[0042] 3、將Huh7細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心， 3131C0001000700182)消化并吹打均勻，然后接種于固定siRNA復(fù)合物的芯片上，37°C溫度 培養(yǎng)48h，得到轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物的細(xì)胞芯片。
[0043] 4、將轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物的細(xì)胞芯片在室溫(25°C)放置5分鐘，聚合物薄膜脫落，然 后使用PBS水溶液(pH7.4)清洗3次，得到待檢測的細(xì)胞芯片。
[0044] 5、細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)：
[0045] 5.1、在步驟4的每張待檢測的細(xì)胞芯片加入lml包含EdU(終濃度50μΜ)的細(xì)胞培養(yǎng) 基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，得到固定siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)芯片。
[0046] 5.2、加入lmlPBS清洗2-3次，每張芯片加入lml細(xì)胞固定液(含4%多聚甲醛的roS 溶液），室溫孵育30分鐘后，棄細(xì)胞固定液。
[0047] 5.3、加入lml甘氨酸溶液（2mg/mL)，搖床孵育5分鐘后，棄甘氨酸溶液；加入lml PBS，搖床清洗5分鐘，棄PBS。
[0048] 5.4、加入lml滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS)，搖床孵育 10分鐘；加入lmlPBS， 搖床清洗5分鐘，棄PBS。
[0049] 5.5、加入500μ1的1XApo11〇染色反應(yīng)液，避光、室溫、搖床孵育30分鐘后，棄染色 反應(yīng)液。
[0050] 5.6、加入11111滲透劑(0.5%1^切1^-100的？83)，搖床清洗2-3次，每次10分鐘，棄 滲透劑。
[0051 ] 5.7、加入500yL甲醇清洗1次，每次5分鐘;PBS清洗