一種增強(qiáng)hUCMSCs增殖能力的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種增強(qiáng)hUCMSCs增殖能力的方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源 于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSCs具有自我復(fù)制、大量增殖、多方向分化潛能、造血支持 以及免疫調(diào)控等特性。現(xiàn)階段主要從脂肪、骨髓、臍帶、臍血組織中提取MSCs。人臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)，是存在于臍帶中的 一種MSCs，其具有取材方便，易于采集和運(yùn)輸，生物學(xué)特性穩(wěn)定，免疫原性低，無(wú)異體排斥反 應(yīng)，避免了倫理爭(zhēng)議，細(xì)胞數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)。
[0003] hUCMSCs在臨床疾病研究應(yīng)用中有著重要意義，如能通過(guò)相應(yīng)的誘導(dǎo)將hUCMSCs分 化為我們需要的細(xì)胞，移植于病變部位促進(jìn)病變的愈合。
[0004] hUCMSCs生物學(xué)特征及研究進(jìn)展：
[0005]間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞，在1966年首先 由friedenstein等從骨髓中發(fā)現(xiàn)。da.liang研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有向內(nèi)中外三個(gè)胚 層包括肌腱、韌帶、干細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等分化發(fā)育的潛能。而成人骨髓源間 充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量級(jí)增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，且供者間充質(zhì)干細(xì)胞的采集須行骨 髓穿刺，由于疾病的原因，患者?；加懈腥?、體質(zhì)較弱等因素也限制了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞的應(yīng)用。因此，尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源是目前國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，hUCMSCs具 有來(lái)源豐富、對(duì)供者無(wú)影響。易于采集和運(yùn)輸。無(wú)一體排斥反應(yīng)、避免倫理爭(zhēng)執(zhí)等諸多優(yōu)點(diǎn)， 因此，hUCMSCs有望成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代來(lái)源。
[0006] hUCMSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干 細(xì)胞。理論上，在一定條件下，hUCMSCs可以定向分化成機(jī)體內(nèi)的各種功能細(xì)胞，形成任何類 型的組織以及器官，具有"可塑性"。并且，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，hUCMSCs具有諸多優(yōu)點(diǎn) 而成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。
[0007] 小核仁RNA(smallnucleolusRNAs，snoRNAs)是一類發(fā)現(xiàn)較早且位于核仁內(nèi)的小 非編碼RNA，在核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)、信使RNA(messengerRNA，mRNA)、小核RNA (smallnuclearRNA，snRNA)的成熟及修飾中均發(fā)揮重要作用。snoRNAs的功能及其作用途 徑一直以來(lái)均是學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。目前，snoRNAs對(duì)rRNA的化學(xué)修飾作用已得到廣泛認(rèn) 可。另外，有研究表明snoRNAs與一些遺傳疾病以及腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。 隨著研究的深入，snoRNA在調(diào)控細(xì)胞增殖方面的作用越來(lái)越受到大家重視。
[0008]研究發(fā)現(xiàn)，部分snoRNA對(duì)細(xì)胞的增殖具有調(diào)控作用，（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Pacilli，A.，Ceccarelli,C.,Trere,D.,&Montanaro,L..SnoRNAU50 levelsareregulatedbycell proliferationandrRNAtranscription.IntJMolSci,2013?14(7)：14923-14935.)
[0009] 目前尚無(wú)有關(guān)snoRA7A維持并增強(qiáng)hUCMSCs增殖能力的研究及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供sn0RA7A的新用途，本發(fā)明的另一目的在于提供利用 snoRA7A來(lái)維持和/或增強(qiáng)hUCMSCs增殖能力的應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，申請(qǐng)人構(gòu)建了含目的基因sn〇RA7A的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體將其轉(zhuǎn) 染hUCMSCs，以獲得snoRA7A高表達(dá)，稱之為snoRA7A°e-hUCMSCs。通過(guò)CCK8測(cè)量各組細(xì)胞的增 殖速度。本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下：首先是根據(jù)sn〇RA7A的基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)引物，以 hUCMSCs總DNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，制備snoRA7AcDNA，再構(gòu)建PLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染hUCMSCs。
[0012]本發(fā)明的第一方面，提供sn〇RA7A的新用途。
[0013]本發(fā)明提供了snoRA7A在體外培養(yǎng)條件下維持和/或增強(qiáng)hUCMSCs增殖能力的應(yīng) 用，也即snoRA7A在制備hUCMSCs體外培養(yǎng)試劑中的應(yīng)用。
[0014]所述的sn〇RA7A，其具體序列為：
[0015]
[0016]所述的試劑，用于維持和/或增強(qiáng)hUCMSCs增殖活性，并有助于其干性的維持。
[0017] 本發(fā)明所述的維持和/或增強(qiáng)hUCMSCs增殖活性，是指hUCMSCs在體外培養(yǎng)條件下， 隨著傳代次數(shù)增加，可減緩細(xì)胞增殖能力的降低，細(xì)胞倍增時(shí)間以及細(xì)胞活性不會(huì)降低，BP hUCMSCs增殖能力不會(huì)降低。
[0018] 本發(fā)明所述的hUCMSCs通過(guò)機(jī)械法結(jié)合酶消化法的方式獲得原代細(xì)胞或傳代細(xì) 胞。
[0019] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種利用sn0RA7A來(lái)維持和/或增強(qiáng)hUCMSCs體外培養(yǎng) 條件下增殖能力的方法，該方法包括以下步驟：
[0020] A、構(gòu)建snoRA7A的重組質(zhì)粒；
[0021]B、將步驟A獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hUCMSCs，獲得snoRA7A高表達(dá)的hUCMSCs。
[0022]所述的步驟A構(gòu)建的重組質(zhì)粒為:pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表達(dá)載體。所述的重 組人pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染hUCMSCs，獲得snoRA7A高表達(dá)的hUCMSCs， 稱之為snoRA7A°e-hUCMSCs〇
[0023]所述的步驟A具體為：首先根據(jù)sn〇RA7A的基因序列（如SEQIDN0:1)，以及所選載 體PLKD-CMV-G&PR-U6，分別選取Agel、BamHI為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)上下游引物，以hUCMSCs總DNA 為模板，通過(guò)RT-PCR獲取含酶切位點(diǎn)序列的目的片段。分別酶切目的片段和載體，再通過(guò)其 兩端所含酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的PLKD載體上;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì) 胞，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落先進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，比對(duì)正確的克隆 即為構(gòu)建成功的pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A真核表達(dá)載體。
[0024] 步驟A中獲取目的片段所用引物序列為：
[0025] snoRA7A Agel F:
[0026] 5，CATTCCCAGCTTGCTCCGTA3，（SEQIDN0:2)
[0027] snoRA7ABamHIR:
[0028] 5，GGGATCCCGCACTGTCG 3，（SEQ ID N0:3)
[0029]其中真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法為常規(guī)方法，可參見(jiàn)工具書(著[美]J.莎姆布魯克， 黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社）。
[0030]所述的步驟B中轉(zhuǎn)染步驟如下：
[0031 ]按fugen-6(微升）：質(zhì)粒(微克）= 4:3的比例對(duì)生長(zhǎng)至60%~70%融合的細(xì)胞進(jìn)行 轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后更換新的培養(yǎng)基，獲得snoRATAM-hUCMSCs。
[0032]在本發(fā)明一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施例中，轉(zhuǎn)染步驟具體為：
[0033] 取97ul DMEM到lml 0D管中，加入3yg過(guò)表達(dá)質(zhì)粒到DMEM中，用加樣槍混勻或拿手 指輕輕彈動(dòng)，之后室溫放置5分鐘。同時(shí)4μ1 fugene6到預(yù)混的DMEM中，輕輕混勾，靜置15分 鐘。15分鐘后用100ul槍吸出反應(yīng)液，均勻的滴入6孔板中，輕輕拍打。放入培養(yǎng)箱。24小時(shí)后 觀察細(xì)胞狀態(tài)，棄去細(xì)胞上清，更換為新鮮培養(yǎng)基，獲得snoRATAm-hUCMSCs。
[0034] 本發(fā)明的第三方面，提供了上述方法獲得的snoRA7A°e-hUCMSCs，S卩snoRA7A高表達(dá) 的hUCMSCs。
[0035] 繼續(xù)培養(yǎng)，觀察snoRA7A°e-hUCMSCs的生長(zhǎng)狀態(tài)，以及是否維持成纖維樣生長(zhǎng)狀態(tài)， 細(xì)胞增殖所需時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，均可發(fā)現(xiàn)snoRA7A°e-hUCMSCs同對(duì)照組（用載體pLKD-CON轉(zhuǎn)染的毛乳頭細(xì)胞:CON-hUCMSCs)相比可更好的維持成纖維樣，細(xì)胞增殖快。
[0036]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0037] 本發(fā)明成功構(gòu)建了snoRA7A高表達(dá)的hUCMSCs，較hUCMSCs具有更高的增殖能力，且 多能性更好;可在體外培養(yǎng)條件下，獲取大量功能狀態(tài)較好的細(xì)胞，解決了hUCMSCs在體外 培養(yǎng)過(guò)程中隨著傳代次數(shù)增加，增殖能力等生物活性降低的問(wèn)題;本發(fā)明為hUCMSCs體外培 養(yǎng)傳代過(guò)程中細(xì)胞增殖能力的維持以及增強(qiáng)提供了新思路，為hUCMSCs的臨床應(yīng)用提供了 更廣闊的前景。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為分離培養(yǎng)的hUCMSCs;其中A為snoRA7A高表達(dá)的第3代hUCMSCs，B為snoRA7A 高表達(dá)的第5代hUCMSCs，C為snoRA7A高表達(dá)的第7代hUCMSCs，D為snoRA7A高表達(dá)的第9代hUCMSCs，E為空載體轉(zhuǎn)染的第3代hUCMSCs，F(xiàn)為空載體轉(zhuǎn)染的第5代hUCMSCs，G為空載體轉(zhuǎn)染 的第7代111^1^〇8，!1為空載體轉(zhuǎn)染的第9代?？梢?jiàn)811〇1^74° (3-111^1^〇8成纖維樣生長(zhǎng)狀態(tài)維持 較空白組好，且培養(yǎng)相同時(shí)間后細(xì)胞密度較空白組高。
[0039] 圖2為實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)結(jié)果，表明在第3代hUCMSCs中，snoRA7A表達(dá)量增加在 snoRA7A°e-hUCMSCs中較CON-hUCMSCs顯著增加。提示轉(zhuǎn)染效率高。
[0040] 圖3是過(guò)表達(dá)snoRA7A及其對(duì)照組的第3代hUCMSCs經(jīng)傳代后細(xì)胞總體活性的變化， 染色越深0D值越高，表示活細(xì)胞數(shù)越多。由于各組細(xì)胞起始數(shù)相同，因此，0D值可用于指示 細(xì)胞增殖能力。由圖3可知，過(guò)表達(dá)snoRA7A后細(xì)胞0D值較對(duì)照組高，且呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，表 明過(guò)表達(dá)snoRA7A后hUCMSCs增殖活性增強(qiáng)。
[0041] 圖4是過(guò)表達(dá)snoRA7A及其對(duì)照組的第3代hUCMSCs經(jīng)傳代后細(xì)胞倍增時(shí)間的變化。 由圖看以看出，過(guò)表達(dá)snoRA7A后hUCMSCs細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短，細(xì)胞增殖加快。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0043] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》（New York:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0044] 實(shí)施例 1 :構(gòu)建真核表達(dá)載體pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A，感染hUCMSCs (HUCMSCS)。
[0045] l、hUCMSCs分離培養(yǎng)
[0046] 人臍帶來(lái)自長(zhǎng)海醫(yī)院婦產(chǎn)科。原代培養(yǎng)得到hUCMSCs。因隨傳代次數(shù)增加，hUCMSCs 的形態(tài)及增殖速率會(huì)發(fā)生變化，為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，我們所有的體外實(shí)驗(yàn)均選 擇第2代hUCMSCs為研究對(duì)象。
[0047] 2、制備人基因組DNA
[0048] 用Promega的Wizard?基因組DNA純化試劑盒，方法如下：
[0049] [ 1 ]·收集hUCMSCs至一干凈的 1 ·5ml0D管中；
[0050] [2].加入600微升核裂解液，用移液槍反復(fù)吹打以裂解組織，直到可見(jiàn)的組織塊消 失，65°C靜置 20min;
[0051 ] [3].加入3微升RNA酶，顛倒2-5次，37°C30min，然后冷卻至室溫。
[0052] [4].加入200微升蛋白沉淀液并使用渦旋振蕩器高速劇烈振蕩20sec，轉(zhuǎn)移至冰上 冷卻5min;
[0053] [5].室溫12000rpm離心4min，形成白色致密的蛋白沉淀；
[0054] [6].小心移取上清(含DNA)至