專利名稱：：具有增強的逃出內體能力的重組bcg菌株的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了分枝桿菌菌株，其具有使引發(fā)免疫應答加強的能力。例如，體內實驗已證明了其引發(fā)主要組織相容性-I型-限制性CD8+T細胞免疫應答。尤其是，本發(fā)明提供了分枝桿菌菌株，其表達產氣莢膜梭菌細胞溶素O(PfoA)蛋白，該蛋白使分枝桿菌從內體中逃出，本發(fā)明還提供了含有分枝桿菌菌株的疫苗制備物。
背景技術：
：結核分枝桿菌(A(yco^c,en'wm^6ercw/ow's)感染全球1/3的人口，導致每年有800萬人患病，160-220萬人喪生，其中大多數(shù)人生活在發(fā)展中國家。肺結核(TB)是全球范圍的流行病，并且因為與HIV的傳播相交叉影響范圍正逐漸上升，致死率也更嚴重。TB是AIDS患者的頭號殺手。卡介苗(BCG)是牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)的一種減毒株，并且是目前廣泛使用的TB疫苗，開發(fā)于80年前，而且當對其進行測定時對肺結核具有變化很大的療效，包括最近在印度開展的大范圍的試驗沒有顯示出功效(Finee,a/.,Vaccine,16(20):1923-1928;1998;Anonymous,IndianJMedRes.，Aug;110:56-69;1999)。盡管如此，世界衛(wèi)生組織目前向在TB高發(fā)國的所有剛出生或初次接觸衛(wèi)生服務的兒童(除了那些具有HIV病/AIDS癥狀的兒童)推薦BCG。這項政策是基于BCG可保護兒童免受孩童形式的嚴重TB危害的證據(jù)(Lanchrietetal.,IntJEpidemiol,24(5):1042-1049;1995;Rodriguesetal.,JEpidemiolCommunityHealth45(1):78-80;1991)。BCG對比幼兒大的兒童的免于TB的保護作用確實有爭議的主題，因為有限的數(shù)據(jù)給出混雜的結論。然而，在廣泛實施嬰兒BCG免疫的發(fā)展中國家，小兒和成年人TB的高發(fā)病率表明，目前施用的BCG在人們處于患TB疾病危險中的那些年沒有明顯的功效。因此，BCG被認為是一種干預和控制TB的不完善的公共衛(wèi)生手段。大約有70%的暴露于TB生物體但具有正常免疫系統(tǒng)的人，不會被感染，那些確實被感染的人，只有大約5%在頭兩年內會發(fā)病。多數(shù)受到感染的人可抑制感染，這與針對結核分枝桿菌發(fā)展強有力的細胞免疫應答有關。當免疫力降低時，另有5%在后來發(fā)病。HIV/AIDS患者初次患病以及后發(fā)病更常見，再次強調了免疫力在預防和控制感染中的作用。因為大多數(shù)人能控制肺結核，因此就有理由期待通過誘導適當種類的長期免疫力，應該能夠開發(fā)在暴露后阻止初次感染、阻止疾病早期發(fā)展、阻止從潛伏期發(fā)病以及阻止疾病治療后復發(fā)的有效疫苗。最終，系統(tǒng)疫苗使用與化學干預相結合將最終清除作為人病原體的結核分枝桿菌。鑒于兒童BCG疫苗接種被認為在預防急性肺結核中發(fā)揮關鍵作用，在沒有壓倒性證據(jù)證明新的肺結核疫苗是一種優(yōu)越的產品的情況下，很難在試驗中取代BCG來評價候選TB疫苗的。問題在于結核分枝桿菌是一種人特異性病原體，動物模型僅僅模擬宿主-病原體相互作用的一部分。因此，新的結核疫苗具有改進效力的明確證據(jù)只能獲自受到制約的人類現(xiàn)場試驗。這種現(xiàn)實引導許多研究者斷定對結核疫苗改進的關鍵步驟將是提高BCG的免疫原性。這種策略的一個實例是來改進BCG誘導或激活用來加強免疫應答的T細胞的能力。主要組織相容性復合體I型-限制性CD8+T細胞在對結核分枝桿菌進行免疫的重要作用得到P2-微球蛋白(/52m)缺陷型小鼠不能控制試驗性結核分枝桿菌感染的證明(Flynn"a/.,PNASUSA:89(24):12013-12017;1992)。組織相容性I型-限制性CD8+T細胞的重要作用得到/32-微球蛋白(/32m)缺陷型小鼠不能控制試驗性結核分枝桿菌的感染(Flynne"/.,犯pm，1992)令人信服的證明。因為這些突變的小鼠缺乏組織相容性I型，功能性CD8+T細胞不能發(fā)育。與結核分枝桿菌感染相比，/32m-缺陷型小鼠能夠控制BCG疫苗菌株一定的感染齊U量(Flynn"a/.，■SMpra,1992;LadelC.H.，etal.，EurJImmunol,25:377-384;1995)。而且，/32m缺陷型小鼠的BCG疫苗接種僅僅延長了結核分枝桿菌感染后的存活其，而BCG免疫的C57BL/6抗結核分枝桿菌(Flynne《a/.,，m,1992)。CD8+T細胞對結核分枝桿菌和BCG不同的依從性的解釋如下結核分枝桿菌抗原能比來自BCG的抗原更好地接近細胞質，引起組織相容性I型抗原更顯著的呈遞(HessandKaufmann,FEMSMicrobiol.Immunol7:95-103;1993)。因此，更有效的CD8+T細胞應答由結核分枝桿菌產生。近年來，這種觀點近年來得到如下證據(jù)的證明同時由結核分枝桿菌和BCG感染抗原呈遞細胞(APC)，結核分枝桿菌而非BCG提高了組織相容性I型對不相干抗原，即卵白蛋白的呈遞(Mazzaccaro"a/"ProcNatlAcadSciUSA,Oct15:93(21):11786-91;1996)。因此，結核分枝桿菌抗原接近寄主細胞的能力要優(yōu)于來自BCG的抗原，導致組織相容性I型呈遞的增強(Hessetal.，supra，1993)以及對結核分枝桿菌CD8+T細胞應答的增強。此外，結核分枝桿菌刺激小鼠和人體的抗原特異性組織相容性II型限制性CD4+T輔助細胞，以及組織相容性I型限制性CD8+細胞毒性T細胞(Kaufmann,AnnuRevImmunol11:129-163;1993)。通過延伸，上述事實表明，結核分枝桿菌感染的細胞對組織相容性I型限制性CD8+細胞毒性T細胞的識別敏感。假定暴露于結核病原體的具有免疫活性的人有70%的人沒有被感染，那么在大多數(shù)情況下，由結核分枝桿菌感染誘導的免疫對控制這種生物體是高度有效的。因此，相信現(xiàn)有的結核疫苗菌株BCG的功效將通過增加BCG誘導組織相容性I型-限制性CD8+細胞毒性T細胞應答的能力而得以改善(Kaufmann,FundamentalImmunology,1997)。通常，由保留吞噬體結合的病原體表達的抗原主要由組織相容性11型分子呈遞到004+T細胞，但008+T細胞對其的識別能力較差，CD8+T細胞通常識別由組織相容性I型分子呈遞的抗原(Kaufmann,w/pm,1997)。相反，胞內細菌，諸如逃避吞噬體并在寄主細胞的胞質里復制的單核細胞增生李斯特菌(丄/Wen'amo"oc^oge"^)(例如，ATCC#13932)，在進入組織相容性I型抗原呈遞途徑和引發(fā)CD8+T細胞應答上是有效的(Berchewa/.,JImmunol,138:2266-2276;1987)。單核細胞增生李斯特菌的這種逃避內體的功能近年來通過引入編碼李斯特溶素(Llo)的序列被轉進減毒沙門氏菌中，該菌通常存在于吞噬體內；研究表明，所產生的這種菌株可逃逸內體并在誘導008+T細胞應答上更有效(Bieleckie《aZ.，Nature(London)，354:175-176;1990;GentscheveZal"InfectI腿un63(10):4202-4205;1995;Hess&g/.:HostResponsetoIntracellularPathogens,75-90;1997)。近年來，這禾中方法被應用于BCG;因此分泌李斯特溶素的rBCG菌株被用來提高BCG誘導組織相容性I型-限制性免疫應答的能力(HessWa/.,PNASUSA，95(9):5299-5304;1998)。盡管早期論據(jù)顯示rBCG-Llo+菌株更適合于引發(fā)CD8+T細胞，這種菌株被證明不能逃逸內體。因此，這種方法的局限在于內體逃逸所需的李斯特溶素的溶血功能僅在pH5.5時完全有活性，在pH7.0時幾乎無活性。因為分枝桿菌將內體的pH值保持在7.0左右，那么可以合理推斷在已有報道的rBCG-Llo菌株里的李斯特溶素是功能紊亂的，因為表達它們的環(huán)境對于溶血活性量值來說不是最適的(Geoffroyetal.,InfectI腿un55(7):1641-1646;1987)。因此，這種方法的免疫促進效果將不會被實現(xiàn)，除非開發(fā)出能夠讓李斯特溶素在BCG處理的內體中發(fā)揮作用的策略。因此，現(xiàn)有技術遠不能提供具有增強的內體逃逸能力的rBCG，而rBCG能增強例如主要組織相容性I型-限制性CD8+細胞毒性T細胞應答的誘導作用。發(fā)明概要本發(fā)明的一個示例性方面提供了重組體BCG(rBCG)菌株，該菌株具有引發(fā)主要組織相容性(MHC)I型-限制性CD8+T細胞免疫應答的增強能力。這些新型的rBCG菌株經遺傳工程化來表達功能性的溶內體蛋白，該蛋白在pH值接近中性(例如，pH值約為6-8或約6.5-7.5)時具有生物活性。因此在含有具有典型的pH接近中性的內體的分枝桿菌中，這種溶內體蛋白是有活性的。由rBCG產生的溶內體蛋白的活性可導致內體破裂，從而允許rBCG從內體中逃出并進入細胞質中。因此，該rBCG暴露于細胞質中，并且引發(fā)強烈的T細胞應答，尤其是強烈的組織相容性1型-限制性008+細胞毒性T細胞應答。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過遺傳工程導入rBCG的溶內體蛋白是來源于產氣莢膜梭菌(C7oWnW/wm/7e;/W"ge"j)的產氣莢膜梭菌細胞溶素O(PfoA)。因此，本發(fā)明提供了經遺傳工程化來表達和分泌功能性的溶內體蛋白的分枝桿菌，該蛋白在中性pH下具有活性。在一些實施方案中，這種功能性的溶內'體孔形成蛋白是PfoA或由SEQIDNO:3編碼的Pf0A突變體(在本文稱作PfoAcH37Q)。由分枝桿菌表達的功能性溶內體蛋白允許rBCG從內體逃出。這種經遺傳工程化的分枝桿菌可胰是減毒的分枝桿菌，比如BCG。本發(fā)明還提供了經遺傳工程化來表達和分泌PfoA的分枝桿菌；和經遺傳工程化來表達和分泌由SEQIDNO:3編碼的Pf0Ac^7Q的分枝桿菌。本發(fā)明進一步提供了能使分枝桿菌衍生物逃出內體的方法。該方法包括使分枝桿菌遺傳工程化的步驟來包含、表達和分泌諸如PfoA或由SEQIDNO:3編碼的PfoAcH37Q的功能性溶內體蛋白。在一些實施方案中，分枝桿菌是減毒的分枝桿菌，比如BCG。本發(fā)明還提供了疫苗制劑，包括經遺傳工程化來表達和分泌在中性pH下具有活性的功能性溶內體蛋白的分枝桿菌。例如，該功能性溶內體蛋白可能是PfoA或由SEQIDNO:3編碼的PfoAGI37Q。由分枝桿菌表達功能性溶內體酶允許重組體分枝桿菌逃出內體。在一些實施方案中，分枝桿菌是減毒的分枝桿菌，比如BCG。附圖的簡要說明圖1.該圖是自殺載體pAF102。每個DNA片段的含義如下L-側翼和R-側翼分別是"^C基因的左側翼和右側翼；；7/oJ是編碼突變體形式的在137G(Q)位具有單個氨基酸改變的產氣莢膜梭菌細胞溶素O基因(Genebank登錄號BA000016);LPPAg85B是編碼抗原85B(即，Rvl886c)前導肽的DNA序列；PAg85A是抗原85A基因的(g卩，Rv3804c)的啟動子序列；是氨基糖苷磷酸轉移酶基因(Genebank登錄號X06402)，其對質粒附予了卡那霉素抗性；OriE是pUC復制起始點(Genebank登錄號AY234331);5/e是為質粒附予Zeosin抗性的基因(Genebank登錄號L36850);Sac5是編碼果聚糖蔗糖轉移酶的基因(Genebank登錄號Y489048)，該基因使細菌對蔗糖敏感；Phsp6()是熱休克蛋白基因(即，Rv0440)的啟動子序列；MCS是指定的限制性酶的多克隆位點。注意在兩個尸ac/位點之間的基因盒在必要時可用其它內體溶素酶基因代替。圖2A和B.A，產氣莢膜梭菌的尸/o^基因序列(SEQIDNO:1);B，產氣莢膜梭菌的PfoA蛋白序列(SEQIDNO:2)。圖3.優(yōu)選突變體的基因序列，PfoAG137Q(SEQIDNO:3)。圖4.等位基因交換的主要步驟流程圖。圖5.限制性酶消化等位基因交換質粒pAF102。泳道l:lkbplusDNA序列梯；泳道2:限制性酶EcoRI消化后的質粒pAF102;泳道3:未被消化的質粒pAF102對照；泳道4:限制性酶EcoRI消化后的不帶有PFO插入盒的載體質粒pAF100;泳道5:未被消化的不帶有PFO插入盒的載體質粒pAF100對照。從這張圖可看出，正如所期望的那樣，質粒pAF100可通過限制性酶EcoRI線性化產生一條大小為4.4kb的帶。如所預料，質粒pAF102通過限制性酶EcoRI產生兩條帶，大小分別為2.3kb和6揚。圖6.對Aw^C:^/oJ基因型選擇性克隆的PCR分析。PCR如材料和方法中的描述。PCR產物通過1.2。/。的瓊脂糖凝膠電泳來分析。DNA序列梯使用的是Invitrogen公司的lkbplusDNA標準。泳道1-6:分別為克隆號從105-1到105-6的PCR;泳道7和泳道8:克隆號分別為142-7和142-10的PCR;泳道9:BCG丹麥1331菌株的PCR。圖7.AFV102的生長和對卡那霉素的敏感性。將來自于AFV102、BCG丹麥1331和PfoA構建體局部二倍體(Pfo105MI)的細菌接種到7H9生長培養(yǎng)基中，每個菌株的生長可通過測量其在不同時間點，600nm處的光密度來比較。對于卡那霉素敏感性的測定，將抗生素加入到培養(yǎng)基中，終濃度為50/ig/ml，其生長的測量同上。圖例中的縮寫Ctrl:未加任何細菌菌種的對照培養(yǎng)基；+Kan或-Kan:培養(yǎng)基中有或沒有卡那霉素。.圖8.AFV102在J774A.1中的細胞毒性測定。細胞用AFV102或BCG丹麥1331感染。在感染后的指定時間點，細胞存活率如材料和方法中描述的那樣，通過與未感染對照的比較來測量。圖9.AFV102在巨噬細胞中存活能力的測定。J774A.1單層細胞用AFV102或BCG丹麥1331感染，在感染后的指定時間點，胞內細菌如同材料和方法所描述的那樣計數(shù)。圖10.檢驗AFV102分泌帶有pH非依賴性溶血活性的Pfo蛋白的能力。AFV102培養(yǎng)物如同以前所描述的那樣來制備，并且上清對紅細胞的溶解能力在pH7.0和5.5下進行測定。溶血活性的測定如同材料和方法中的描述。'圖11A-D.實施例3.的結果示意圖。A，細菌(涂黑的橢圓)侵染胞內(六邊形)巨噬細胞(灰色橢圓)，從而刺激早期內體的形成；B，BCG中斷內體的成熟而且在早期內體內受到保護；C，表達PfoA的AFV102細菌在侵染后的早期內體中被初步發(fā)現(xiàn)；然而，它們開始分泌PfoA并逃出內體；D，可看見表達PfoA的AFV102細菌從內體中出來并游離在細胞中。圖12.該圖為抗原過表達載體pAF105。每段DNA的定義如下Prv川o是抗原Rv3130c的啟動子序列；PAg85B是抗原Rvl886c的啟動子序列。表達盒里的基因是Rv0288、Rvl886c和Rv3804c;a;/z是氨基糖苷磷酸轉移酶基因(Genebank登錄號X06402)，其附予了卡那霉素抗性；OriE是pUC復制的起始點(Genebank登錄號AY234331);/ewZ)是編碼3-異丙基蘋果酸脫氫酶的基因(即，Rv2987c);OriM是分枝桿菌中的復制起始點(Genebank登錄號M23557)。本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細說明本發(fā)明提供了能否逃出內體并進入感染的寄主細胞胞質的rBCG。結果，在該細胞中引發(fā)對rBCG的較高CD8+T細胞應答。RBCG經基因工程化來含有一種功能性內體溶素，可由rBCG表達和分泌，并且介導rBCG逃出內體。溶內體素在本申請中指的是能夠裂解內體膜足以使細菌細胞從內體進入細胞質的蛋白。溶內體在本申請中指的是具有所述裂解活性的蛋白。溶內體蛋白在pH值接近中性的環(huán)境下是有活性的，比如在分枝桿菌侵染的細胞的內體內，因此可介導細菌逃出進入細胞質中。在本發(fā)明的一個實施方案中，導入本發(fā)明rBCG菌株的功能性溶內體蛋白是源自產氣莢膜梭菌的PfoA，或其功能性的突變體。PfoA是由產氣莢膜梭菌分泌的細胞溶素，可由p/oJ基因編碼(Genebank登錄號CPE0163)。該基因和蛋白序列分別如附圖2A和B所示。在梭菌(C/oWWAwm)中以及當由枯草芽孢桿菌(5.SW"fc)表達時，PfoA介導細菌逃出巨噬細胞(Portnoy"a/.，InfectImmun.Jul;60(7):2710-7;1992)。與Llo不同，PfoA在pH5.0和pH7.0下均有活性，因此可在細胞質中保持活性，從而損傷感染的寄主細胞(PortnoyWa/.,w;m，1992)。因此，當PfoA在單核細胞增生李斯特菌中代替Llo表達時，能夠使細菌逃出巨噬細胞(YonesandPortnoy,InfectImmun.Dec;62(12):5608-13;1994)。然而，其表達也會引起對寄主細胞的損傷。Llo顯示了與PfoA相似的特性，除了它可在pH5.5下具有最佳活性而在pH7.0下顯示較低活性。因此，一旦內體的pH降到pH5.5，Llo就會介導內體的逃出而且不會影響寄主細胞，因為細胞質的pH值接近中性，阻止了Llo的活性。Portnoy等的研究已進一步表明，當PfoA在單核細胞增生李斯特菌中以帶有一個氨基酸改變的突變體形式表達時，PfoA的突變體形式不再對寄主細胞有毒性，而且仍然可介導細菌逃出液泡并完成胞內生長(Portnoy&a/.,;y";ra,1992)。在Pfo中將Glyl37突變?yōu)镚lnl37的具體菌株DP-12791(即，PfoAG137Q)，能夠以一種類似于野生型的方式從巨噬細胞中逃出，但不會對寄主細胞產生毒害作用。此外，PfoAdmQ在pH5.6和pH7.4下均有活性，胞質半衰期減少一半。PfoA(H37Q基因序列如附圖3所示(SEQIDNO:3)。PfoA的表達可允許逃出內體，因為PfoA的形成孔隙的活性可導致真核細胞膜的損傷。PfoA通過將結構域自發(fā)插入到雙分子層中，從而在含有膽固醇的膜中形成孔隙。這可通過結合膽固醇來實現(xiàn)，膽固醇充當受體。結合后，毒素形成一種單體-單體界面(寡聚裝配所需)，寡聚化并通過改變其結構分配到膜中，屬于膜結合依賴性。膜結合寡聚體的形成導致膜損傷，最終裂解(Ramachandranetal.，NatureStructureandMolecularBiology,11(8):697-705，1995)。PfoA(j闊能以這種方式介導液泡的裂解。優(yōu)選的PfoA。37Q在感染寄主細胞胞質中的活性有限，因為它對寄主蛋白酶敏感。在本發(fā)明的一個實施方案中，由rBCG表達的功能性溶內體酶是從產氣莢膜梭菌(C./7^/W"ge""中衍生或分離出的PfoA。然而，本領域技術人員應該認識到，其它在pH中性或接近中性的環(huán)境下有活性的溶內體蛋白也適合于本發(fā)明。這樣的溶內體蛋白的例子包括但不限于月巿炎球菌溶素(由月巿炎鏈球菌(S&e/^ococciwjcwe"mom'ae)產生)、鏈溶素O(由釀膿鏈球菌(&re;^ococc"jj^oge"w)產生)、溶蠟素(由蠟狀芽孢桿菌(Sac"wscerew)產生)、a-溶血素(由金黃色葡萄球菌(5Va;/z少/ococcwj產生)等，及其功能性變體。對于蛋白的"功能性溶內體蛋白"或"功能型"(或基因"功能性表達"的基因產品)，我們指的是由rBCG細菌產生的蛋白型可對存在于在原初生物體內的天然或自發(fā)("野生型")蛋白顯示特征性大小的活性。如本領域技術人員所認識到的，在標準條件下測定時，由rBCG產生的蛋白功能型的活性大小為野生型蛋白活性的至少約50%。蛋白的活性大小可通過任何物理觀察，比如結合脂，或產生一種作用，比如rBCG逃出內體等來確定。優(yōu)選地，本領域技術人員所認識的，在標準的測定條件下，活性大小是野生型蛋白的標準活性的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%，或更高。對于一種蛋白的"功能性突變體"，我們指的是那些氨基酸序列與野生型"參考"蛋白至少有約70%同源性的多肽，而且其仍然保留野生型蛋白的功能活性(如以上所描述)。參考野生型蛋白的氨基酸序列通常用作由基因工程化引起的突變和改變起點。優(yōu)選地，功能性突變體是氨基酸序列與參考氨基酸序列具有約75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的多肽。這樣的功能性變體包括但不限于多肽序列，其中有一個或多個保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本領域技術人公知的，而且還包括，例如，用一個荷正電氨基酸代替另一個、一個荷負電氨基酸代替另一個、一個疏水性氨基酸代替另一個等。假定產生的變體多肽保留這里所定義的功能性活性大小，那么變體多肽可含有一個或更多這樣的代替。"功能性變體"也包含目的多肽主要序列的其它變化。這種變化包括但不限于氨基酸的缺失、添加、或修飾(例如，諸如磺化作用、脫酰胺作用、磷酸化、羥化等化學修飾)。這種變化可能是遺傳工程化參考氨基酸序列的結果，或者是蛋白翻譯后修飾的結果，或者二者都有。再者，一種酶的功能性突變體可能是自發(fā)突變的結果，比如那些與從一個物種或不同物種或不同個體的生物體中分離到的不同菌株具有相同或相似活性的同功蛋白之間的突變體。來自這種自發(fā)變體的蛋白可能也會作為參考蛋白，以及這種自發(fā)變體的氨基酸序列可作為參考序列。無論如何，一種參考蛋白的所有功能性變體正如這兒所描述的那樣，仍然保留蛋白的活力大小。這兒所描述的序列同源性和同一性不包括異源氨基酸序列，這種氨基酸序列衍生于除了參考序列的來源,并且出于各種其它目的，被連接進或含進蛋白的多肽序列中。這種異源序列的實例包括但不限于促進多肽分離的序列(例如，組氨酸標簽)、促進多肽在細胞中的分泌和定位的序列(例如，各種前導或耙序列)、編碼糖基化位點的序列(糖基化序列)，等等。無論如何，如本本領域技術人員所認識到的，在標準的測定條件下，功能性變體要保留所述蛋白的活性，所述蛋白是變體，改變程度是功能性變體表現(xiàn)作為變體的蛋白的活性大小至少約50%，優(yōu)選約60%、70%、80%、90%、100%或更多。本發(fā)明還包括編碼蛋白和用于本發(fā)明的蛋白功能性變體的核酸序列。這種核酸序列可能是脫氧核糖核酸、核糖核酸或二者的修飾物，并且可能是單鏈或雙鏈。本發(fā)明的核酸序列包括任何在這里所列舉的序列，而且也包含其變體。例如，核酸的變體可能與所列序列相同，但因為基因碼的冗余性，仍然可以編碼相同的氨基酸序列?；蛘撸灰幋a的氨基酸序列是以上述參考氨基酸序列的功能性變體，本發(fā)明就可能會對一些序列做出變化(例如，替代、缺失或添加)，從而改變編碼的氨基酸序列。實例包括但不限于引起酶中保守氨基酸替代的改變；以及引起氨基酸序列中非保守替代、或缺失或添加等的改變。做出這種改變的原因很多，例如，為了改變酶的翻譯后修飾；增加或降低溶解性；在翻譯的多肽中阻止或引入空間相互作用，等等。通常，本發(fā)明的核酸序列突變體會至少呈現(xiàn)出與參考序列有至少約50%的同源性，優(yōu)選60%、70%、80%、90%或100%，這可由本領域技術人員所熟知的比較程序來決定。這種變體也可在通過高嚴謹性條件下，顯示其結合用于本發(fā)明中序列的能力來表征。高嚴謹性結合試驗被本領域技術人員所熟知并可用來測定本發(fā)明中序列的潛在突變體。這兒所述的序列同源性不是指編碼衍生于除參考氨基酸序列外的來源的異源氨基酸序列的核酸序列，并且因為其它各種目的被附加或囊括進蛋白的多肽序列。例如，這樣的核酸序列可編碼異源氨基酸序列，包括但不限于促進多肽分離的序列(例如，組氨酸標簽)、促進多肽在細胞中分泌和定位的序列(例如，各種前導序列和靶向序列)、編碼糖基化位點的序列(糖基化序列)等。意圖包括在本發(fā)明中的其他多種核酸序列是為了方便或改良，在核酸序列的遺傳工程化中或者在表達由其編碼的氨基酸序列中改變的序列。通常，這種改變不會影響最終由核酸序列所翻譯的多肽序列；或者該多肽仍然會為一種功能性突變體實現(xiàn)以上所設定的標準。這種改變類型的例子包括但不限于在核酸序列中包含方便的限制性內切酶位點促進序列的操縱(例如，用于將序列插入到載體中)；序列或者參與氨基酸表達的序列中的包含、缺失或其他改變(例如，任意多種啟動子和/或增強子序列的包含、停止信號、超級啟動子、誘導型啟動子、以及其它各種修飾核酸序列表達的序列)；促進載體與寄主生物體核酸相互作用的序列的包含；等等。此外，因為許多原因，本發(fā)明的核酸序列還可能是化學修飾的或包括為本領域技術人員所熟知的非傳統(tǒng)堿基，例如，促進核酸的穩(wěn)定性，或得到所期望的空間構象。對于"在中性pH有活性"和"在pH大約7.0有活性"，我們是指該酶在pH值在約6.0-8.0的范圍內是有活性的，優(yōu)選范圍為約6.5-7.5。本發(fā)明提供了重組分枝桿菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，分枝桿菌是減毒的，可以BCG作為例證。本領域技術人員可以認識到，其它減毒和非減毒分枝桿菌也適用于本發(fā)明。其它類型的分枝桿菌的實例包括但不限于結核分枝桿菌(M.化6m:w/0^)菌株CDC1551(參照，例如Griffith"a/"ies/n'rO".CweMed.Aug;152(2):808;1995)、結核分枝桿菌Beijing(Soolingen等，1995)、結核分枝桿菌菌株H37Ra(ATCC#:25177)、結核分枝桿菌菌株H37Rv(ATCC#:25618)、牛分枝桿菌(M.6ov&)(ATCC#:19211和27291)、偶然分枝桿菌(M./or化""m)(ATCC#:15073)、恥始分枝桿菌(Af.((ATCC#:12051和12549)、胞內分枝桿菌(M/"&a"〃"/we)(ATCC#:35772和13209)、堪薩斯分枝桿菌(MAa"^^//)(ATCC#:21982和35775)、鳥分枝桿菌(Mav/躍)(ATCC#:19421和25291)、享鳥雞分枝桿菌(Mga〃z'"an/m)(ATCC#:19711)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)(ATCC#:15483和23024)、麻風分枝桿菌(M./印rae)(ATCC#:)、游泳池肉芽瘤分枝桿菌(M.waW"wwm)(ATCC弁:11566和11567)、以及M.m〖cro"/(ATCC#:11152)。減毒分枝桿菌菌株的實施例包括但不限于結核分枝桿菌泛酸鹽缺陷型菌株(Sambandamurthy,A^.Me丄20028(10):1171;2002)、結核分枝桿菌rpoF突變型菌株(Collins"a/.,iVocWa,/爿cWScitAW.92(17):8036;1995)、結核分枝桿菌亮氨酸缺陷型菌株(Hondaluse^/"Infect.Immun.68(5):2888;2000)、BCG丹麥菌株(ATCC#35733)、BCG日本菌株(ATCC#35737)、BCG芝加哥菌株(ATCC#27289)、BCG哥本哈根菌株(ATCC#:27290)、BCG巴斯德菌株(ATCC#:35734)、BCG葛蘭素菌株(ATCC#:35741)、BCGConnaught菌株(ATCC#35745)、BCG蒙特利爾(ATCC#35746)。在本發(fā)明的另一個實施例中，減毒分枝桿菌菌株經過修飾可增強細胞凋亡，其中這樣的菌株可誘導強烈的細胞免疫應答。凋亡是指程序性細胞死亡，在誘導作用和結果上與細胞壞死有很大的區(qū)別。實際上，抗原包被細胞的凋亡誘導有效細胞免疫的過程被稱為交叉致敏(cross-priming)(Heathcr/"7mm"no/iev199;2004;Galluccia/.,淑,跑ec/mo/ogy.5:1249;1999;Albert&a/"淑,392:86;1998)。引導增強性抗原特異性細胞介導免疫的凋亡有若干誘導機制。Caspase8介導的凋亡可導致抗原特異性細胞的免疫保護(SheridanwSc/e"ce277:818;1997)。因此，本發(fā)明的另一實施方案提供了表現(xiàn)增強型前細胞凋亡特性的減毒分枝桿菌菌株，例如，但不限于secAl分泌的SodA，缺乏來自腸炎沙門氏菌(Sa/mo"e〃ae"&nW/j)(Genebank登錄號1068147)、大腸埃希桿菌(&c/^Wc/n'aco")(Genebank登錄號1250070)或弗氏志賀菌(W/ge〃flyZe義"en')(Genebank登錄號1079977)等的前導肽，或者，SodA蛋白，其天然不分泌諸如來自單核細胞增生李斯特菌(丄/We〃'amowoc,ge,)EGD-e(Genebank登錄號986791)的SodA。這樣的減毒分枝桿菌菌株不能產生胞外Sod，因此不能抑制寄主免疫應答，然而它們確實表達胞內Sod，從而能使所述的分枝桿菌存活(Edwardsetal.，Am.J.Respir.Crit.CareMed.164(12):2213-9;2001)?；蛘撸憩F(xiàn)增強型前細胞凋亡特性的減毒分枝桿菌菌株攜帶一種滅活的Rv3238c基因。或者，通過本發(fā)明的減毒分枝桿菌，在宿主細胞的胞質中表達沙門氏菌SopE(Genebank登錄號AAD54239、AAB51429或AAC02071)或caspase-8(Genebank登錄號AAD24962或AAH06737)將為誘導程序性細胞死亡賦予一種強有力的方法，程序性細胞死亡在由已述的減毒分枝桿菌表達的抗原體系中產生高水平的抗原特異性細胞免疫。死亡受體-5(DR-5)也稱作TRAIL-R2(TRAIL受體2)或TNFR-SF-10B(腫瘤壞死因子-超家族成員10B)也介導caspase8介導的細胞凋亡(Sheridanetal.,1997)。誘導細胞凋亡的呼腸病毒由TRAIL-DR5介導，TRAIL-DR5引起病毒隨后的清除(Clarkeetal.，丄PW.74:8135;2000)。通過本發(fā)明的減毒分枝桿菌，DR-5的表達，諸如人類DR-5(Genebank登錄號BAA33723)、皰疹病毒-6(HHV-6)DR-5同源物(Genebank登錄號CAA58423)等，為誘發(fā)抗結核分枝桿菌抗原的抗原特異性細胞免疫提供了一種有效的輔助作用。此外，寄主抗原遞呈細胞(諸如巨噬細胞和樹狀突細胞)也能通過Fas連接誘發(fā)凋亡，這對誘發(fā)抗原特異性細胞免疫應答是一種很強的朿U激(Chattergoonetal.，5z'o&c/mo/.18:974;2000)。因此，表達Fas或Fas胞質結構域/CD4外結構域融合蛋白的減毒分枝桿菌將誘導細胞凋亡和增強型抗原特異性細胞免疫應答。概括來講，促進誘導細胞凋亡的減毒分枝桿菌菌株為細胞應答的誘導提供一種強有力的工具，細胞應答引起受結核分枝桿菌感染細胞的免疫介導細胞的破壞，隨后消除、降低或預防結核分枝桿菌的感染。在本發(fā)明的另一實施例中，雙組分TB疫苗可以包含至少過表達一個分枝桿菌抗原的減毒分枝桿菌，包含但不限于Rv0125、Rv0203、Rv0287、Rv0288、Rv0603、Rvl196、Rvl223、Rvl271c、Rvl733c、Rvl738、Rvl804c、Rvl886、Rv2031c、Rv2032、Rv2253、Rv2290、Rv2389c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2779c、Rv2873、Rv2875、Rv3017c、Rv3407、Rv3804c、Rv3810或Rv3841?？蛇x地，過表達的分枝桿菌抗原可以融合蛋白的形式組成一個或更多已述的分枝桿菌融合蛋白，例如Mtb72f(Brandtetal"/"/e"./m扁w.,72:6622-6632;2004;Skeikyetal.:丄/畫畫/"172:7618-7628;2004)、Hybrid-1(Olsenetal"/"/e",/麵亂，72:6148-6150;2004;Langermansetal"23:2740-2750;2005)、Hyvac-4(Dietrichetal">/./扁,/.,174:6332-6339;2005)等。本發(fā)明在發(fā)展抗病原性分枝桿菌類疫苗和抗原傳遞疫苗載體上具有功用。分枝桿菌載體在這兒被定義為至少表達一個組成DNA或RNA并且編碼任意抗原復合物、免疫調節(jié)因子或輔劑的路過核苷酸序列(passengernucleotidesequence)(這兒指作"PNS")的任何分枝桿菌工程菌，這點由以下來陳述。PNS能被導入染色體或應用本發(fā)明已知的組分和方法作為表達載體部分(Jacobsetal.,油嫌327:532-535;1987;Barlettaetal.，ResMicrobiol.141:931-939;1990;Kawaharaetal.,C//"/mmwwo/.105:326-331;2002;Limetal.,JiDSies/fttmie"ovinwes.13:1573-1581;1997;Chujohetal.Facc/"e，20:797-804;2001;Matsumotoetal.，F(xiàn)"flccz曙we,14:54-60;1996;Haeseleeretal.,A/o/5z.oc/em尸ams"o/"57:117-126;1993)。在本發(fā)明中，分枝桿菌載體可能攜帶編碼免疫原的PNS，其可能是來自病毒、細菌和寄生蟲病原體的外源免疫原，或是內生免疫原，例如，但不限于自體抗原或腫瘤抗原。這種免疫原可能在外源免疫原和內生蛋白或擬態(tài)、斷片或斷片中含有源自病毒、細菌和寄生蟲病原體免疫原之間的全長天然蛋白、嵌合體融合子。如這里所用，"外源免疫原"意味著蛋白或其中的片斷，其通常不在受體動物細胞或組織中表達，例如，但不限于病毒蛋白、細菌蛋白、寄生蟲蛋白、細胞素、趨化激素、免疫調節(jié)劑、或治療劑。"內生免疫原"意味著存在于受體動物細胞或組織中的蛋白或蛋白片斷，例如，但不限于內生細胞蛋白、免疫調節(jié)劑、或治療劑?？蛇x地或額外地，該免疫原可能由一種合成基因編碼，并且可能使用為本領域技術人員所知的傳統(tǒng)重組DNA方法被構建。外源免疫原在動物寄主中侵入、克隆或復制前或期間，可以是任何病毒、細菌或寄生蟲病原體分子；分枝桿菌載體可能表達源自病毒、細菌或寄生蟲病原體的免疫原或其中的部分片斷。這些病原體會感染人類、家畜或野生動物。病毒抗原被衍生、包埋的病毒病原體包含但不限于正粘病毒，例如流感病毒(分類ID:59771);逆轉錄病毒，例如RSV、HTLV-1(分類ID:39015)、以及HTLV-II(分類ID:11909)，皰疹病毒，例如EBV(分類ID:10295);CMV(分類ID:10358)或單純皰疹病毒(ATCC#:VR-1487);慢病毒屬，例如，HIV-1(分類ID:12721)和HIV-2(分類ID:11709);棒狀病毒，例如狂犬?。晃⑿『颂呛怂岵《?，例如脊髓灰質炎病毒(分類ID:12080);痘病毒，例如牛痘(分類ID:10245);輪狀病毒(分類ID:10912);以及細小病毒，例如腺伴隨病毒1(分類ID:85106)。病毒抗原可在以下群體中被發(fā)現(xiàn)，包含但不限于人類免疫缺陷病毒抗原Nef(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseaseHIVRepositoryCat.#183;Genbank登錄號AF238278))、Gag、Env(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseaseHIVRepositoryCat.#2433;Genbank登錄號U39362)、Tat(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseaseHIVRepositoryCat.#827;Genbank登錄號M13137)、Tat的突變衍生物，例如Tat-A31-45(Agwalee"/.，iVoc.S";2002)、Rev(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseaseHIVRepositoryCat.#2088;Genbank登錄號LI4572)、以及Pol(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseaseHIVRepositoryCat.#238;Genbank登錄號AJ237568)及gpl20的T和B細胞的抗原決定部位(HankeandMcMichael，AIDSImmunolLett.,66:177;1999);(Hanke,"cr/.,K固'we,17:589;1999);(Palker"a/">/./mmwwo/"142:3612-3619;1989)、HIV-1Envandgp120的嵌合體衍生物，例如但不限于gpl20和CD4之間的融合(Fouts"a/.,丄F&o/.,74:11427-11436;2000);切去頂端和修飾的HIV-1env衍生物，例如但不限于gpl40(Stamatos"a/,，/K>o/，72:9656-9667;1998)或HIV-1Env和/或其中的gpl40衍生物(Binley,&fl/.，/F/ro/，76:2606-2616—;2002);(Sanders,Wfl/"■/Wro/，74:5091-5100;2000);(Binley，a/"/J^o/，74:627-643」2000)、肝炎B表面抗原(Genbank登錄號AF043578);(Wu&a/.,/Voc.iWz".爿cac/.Scz'.,C/SX,M:4726-4730;1989);輪狀病毒抗原，例如VP4(Genbank登錄號AJ293721;Mackowe,a/.,A^〃.Jcafif.Sc/.，C/SJ,87:518-522;1990)和VP7(Genbank登錄號AY003871;)(Green"a/.,F"/ro/.,62:1819-1823;1988)，流感病毒抗原，例如紅血球凝集素或(Genbank登錄號AJ404627、)；(PertmerandRobinson,P^oZogy,257:406;1999);核蛋白質(Genbank登錄號AJ289872);(Lin"a/"尸roc.脂/.JcW.ScZ.，97:9654-9658;2000)、單純皰疹病毒抗原，例如胸苷激酶(Genbank登錄號AB047378):(Whitley"a/"Ge"era"o"Faccz'"ej，825-854;2004)。衍生細菌抗原的細菌病原體包含但不限于，分枝桿菌屬(AfycoZa"m.wmi77p.)、(/fe"co6flc^/>;;/oW)、沙門氏菌屬(iSa/mowe〃a)、dge〃fl5p;.)、大腸桿菌co//)、立克次氏體屬(ifdte"Wa、李斯特菌屬(iz'WeW。j;;.)、軍團桿菌屬(丄eg/owe〃a戶eM附owz.fle)、假單胞菌屬(-Psei^/omowasJjPj3.)、弧菌屬(Fz力n'o)、以及伯氏疏螺旋體(5ore肌aZn^gc/o;/en')。細菌病原體的保護性抗原的實施例包括產腸毒素大腸桿菌的菌體抗原，例如CFA/I菌毛抗原(Yamamoto"<a/.，/"/e"./mmww.，50:925-928;1985)和熱不穩(wěn)定毒素的無毒B亞基(Klipstein"a/.,/"/e"./mmww.，40:888-893;1983);百日咳博德特氏菌(5oWe《e〃a;em^^)的百日咳外膜蛋白(Robertse"/.,Vacc.,10:43-48;1992)、百日咳博德特氏菌的腺苷酸化環(huán)化酶-溶血素(Guiso"a/.,7kT/cro.尸flA.，11:423-431;1991)、破傷風梭菌(C/o^nW/wm《dam')破傷風毒素的C片斷(FairweatherWa/"7n/e"Twmim.，58:1323-1326;1990)、伯氏疏螺旋體(5ore〃/a6wgdor/eW)的OspA(Sikand,e,a/"Pe^cr,n'os,108:123-128;2001);(Wallich,"a/"/"/e"/mmw",69:2130-2136;2001)、普氏立克次體(j^owazehZ)禾口斑疹傷寒立克次氏體(i^'cA:eto/a)的保護性類結晶-表面-層蛋白(Carl，"iVocA^/JcaJSc/C7&4，87:8237-8241;1990)、單核細胞增生李斯特菌a/WeWamo"oc;^oge"w)的李斯特菌細胞溶解素(也以"Llo"和"Hly"聞名)和/或超氧化物歧化酶(也以"SOD"和"p60"聞名)(Hess，&a/"i>z/ecf./mmim.65:1286-92;1997;(Hess,"a/"/Voc.JcaJ.SW.93:1458-1463;1996);(Bouwer,&a/"丄Med.175:1467-71;1992)、幽門螺桿菌(//e//co6a"er/y/oW)的脲酉每(Gomez-Duarte,&a/.'Fbcc/we16，460-71;1998);Corthesy-Theulaz,efa/.,//ec"'owc&/附m腿々66,581-6;1998)、以及致死毒素的受體結合域和/或炭疽桿菌(5acz7/i^fl"Ara;c)的保護性抗原(Price,Wa/.,/"/e"./mm"".69,4509-4515;2001)。衍生寄生蟲抗原的寄生蟲病原體包括但不限于瘧原蟲屬(尸/osmo(i/Mmj//.)，例如惡性痕原蟲(_p/<xsmo(^z'Mwyb/c^ctn^m)(ATCC#:30145);錐蟲屬(ro^a"oJowe^p.)，例如克氏錐蟲(7>>^a"osoma"mz/)(ATCC#:50797);梨形蟲屬(G/aWZa^;7.)，例如腸吉亞爾氏鞭毛蟲(G/wAa/"^s"'"afe)(ATCC#:30888D);牛蜱屬(5oop/n7iw^p.)，巴貝蟲屬(5。6ew'awp.)，例如田鼠巴貝蟲(歸ew.amfc融')(ATCC弁30221);阿米巴屬(^,歸oe6a卿.)，例如痢疾阿米巴(五""moe^M^o/;^'cfl)(ATCC#:30015);愛美爾球蟲屬(五z'mer/fl印p.)，例如巨型艾美耳球蟲(五i'men'ama;cz'ma)(ATCC#40357);利什曼原蟲屬(丄e/5/mjam'a)(分類ID:38568);裂體吸蟲屬(Sc/^^somew;.)，魯絲蟲屬(5r"gfai1/7/7.)，(Fasciaj//.)，犬心絲蟲屬(Df廠o力/an'a577;7.)，吳策線蟲屬(『wc/zereWa印/.)，以及(OwcAocerea5p/7.)。寄生蟲病原體保護性抗原的實施例包括瘧原蟲屬的環(huán)子孢子抗原(Sadoff"a/.,Scz'e"ce240:336-337;1988)，例如尸.6ergm'/的環(huán)子孢子抗原或惡性瘧原蟲的環(huán)子孢子抗原；瘧原蟲屬的裂殖子表面抗原(SpetzlerWa/.，,尸e/^./Votiw.，43:351-358;1994);痢疾P可米巴的半乳糖專一性外源凝集素(Mann"a/.'Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,88:3248-3252;1991)、利什曼蟲屬的gp63(Russelle"/.,J.Immunol"140:1274-1278;1988);(XuandLiew,Immunol.,84:173-176;1995)、利什曼蟲主要的gp46(Handmane《a/.,r固."e，18:3011-3017;2000))、馬來絲蟲(5rwg^ma/a少/)的副肌球蛋白(Li"a/.,Mo/.萬/ocAem.尸腦j"o/"49:315-323;1991)、曼氏裂體吸蟲(ScW加畫ama譜wi)的丙糖-磷酸鹽異構酶(Shoemaker"尸roc.A^/.^cad.USA,,842-1846;1992);蛇形毛圓線蟲(7V/c/zoW層gy/wjco/w6咖腦;s)的分泌型類球蛋白蛋白(Frenkel&a/.,Mo/.尸araWo/.,50:27-36;1992);」FVwc/o/a/印^'ca的谷胱苷肽-S-轉移酶(Hillyerwa/"尸酒Wo/"75:176-186;1992)、牛裂體吸蟲和日本血吸蟲(Bashir"a/"7>o,46:255-258;1994);以及牛血吸蟲(Sctoosoma6ov&)禾口日本血吸蟲(S.y'fl，/c譜)的KLH(Bashir"a/.，supra，1994)。如早期所提及，分枝桿菌載體可能攜帶編碼內生免疫源的PNS，這有可能是任意細胞的蛋白質、免疫調節(jié)劑、或治療劑、或在受體細胞中表達的部分，包含但不限于腫瘤、移植物、以及自體免疫的免疫原，或腫瘤、移植物和自體免疫原的斷片和衍生物。因此，在本發(fā)明中，分枝桿菌載體可能攜帶編碼腫瘤、移植物或自體免疫原、或其中的斷片和衍生物等的PNS。可選地，分枝桿菌載體可能攜帶合成的PNS(同以上描述)，編碼腫瘤專一性物質、移植物、或自體免疫原或其中的部分。腫瘤專一性抗原的實施例包括前列腺專一性抗原(Gattusowa/.,i/謂a"尸w/zo/"26:123-126;1995)、TAG-72禾口CEA(Guadagniefct/"M5fo/.MaAeny，9:53-60;1994)、MAGE-1禾口酪氨酸酶(Couliee"/"丄/mmimo^enz.，14:104-109;1993)。近年來，小鼠實驗已表明，表達腫瘤抗原的具有非惡性細胞的免疫可提供一種有效的疫苗，同時也輔助動物增強免疫應答，清除顯示同樣抗原的惡性瘤細胞(KoeppenWa/.,^"fl/.釘.鵬:244-255;1993)。移植抗原的實施例包括T細胞上的CD3分子(Alegre"40:58-64;1995)。用一種抗體對CD3進行處理，結果表明其可迅速清除環(huán)狀T細胞，而且細胞反過來可介導移植受體(Alegre"supra,1995)。自體免疫抗原的實施例包括IAS0鏈(Topham"ZVoc.A^/.^c。"cz'.，USA'91:8005-8009;1994)。用來自IASj8鏈的18氨基酸月太為小鼠接種疫苗，結果表明其對有自體免疫腦脊髓炎的實驗小鼠有保護和治療作用(Topham"fl/"supra，1994)。表這薪淑游分橋^蘑載沐構建攜帶編碼免疫原和輔劑的PNS的分枝桿菌載體是可行的，而且能增強寄主對載體和PNS編碼的免疫原的應答?？蛇x地，構建攜帶編碼輔劑的PNS的分枝桿菌載體是可行的，其是一種混合物，與其它攜帶至少編碼一個免疫原的PNS的分枝桿菌混合在一起，提高寄主對已述的由伴侶分枝桿菌載體編碼的免疫原的應答。這種由插入到已述分枝桿菌載體上的PNS編碼的特殊輔劑不是本發(fā)明的關鍵點，可能是霍亂毒素的A亞基(例如，CtxA;Genbank登錄號X00171,AF175708,D30053,D30052)，或其中的片斷和/或突變衍生物(例如，CtxA亞基的Al于(例如CtxAl;Genbank登錄號K02679))，任何典型的霍亂弧菌(r/6Woc/o/eme)(例如霍亂弧菌菌株395,ATCC#39541)或ElTor霍亂弧菌(例如霍亂弧菌菌株2125,ATCC#39050)菌株?？蛇x地，任何腺苷-磷酸二鹽-核糖基化內毒素家族成員中的細菌毒素(KmegerandBarbier,Clin.Microbiol.Rev.，8:34;1995)，可被用來替代CtxA，例如，產腸毒素大腸埃希氏菌熱不穩(wěn)定毒素的A亞基(這兒指作EltA)(Genbank登錄號M35581)、百日咳毒素Sl亞基(例如p"W,Genbank登錄號AJ007364,AJ007363,AJ006159,AJ006157,etc.);作為進一步的可選，輔劑可能是百日咳博德特氏菌(ATCC#8467)、oWe&〃a^o"c/^印"ca(ATCC#7773)或副百日咳博德特氏菌(SoW^e〃apara/eWMM^)(ATCC#15237)的腺苷酸化環(huán)化酶-溶血素之一，例如，百日咳博德特氏菌的c;^4基因(Genbank登錄號X14199)、副百日咳博德特氏菌的c3;"基因(Genbank登錄號AJ249835)或支氣管炎博德特菌(5.Z^o"c/^印"ca)的c少"基因(Genbank登錄號Z37112)。表達免疫調節(jié)劑的分枝桿菌載體還有一個方法使得對攜帶至少一個編碼免疫原和細胞因子的分枝桿菌載體的使用是必需的，可用于增強寄主對編碼免疫原分枝桿菌載體的PNS的應答?？蛇x地，構建一個攜帶僅編碼已述細胞因子的PNS的分枝桿菌載體是有可能的，這可通過與至少一個其它攜帶編碼免疫原的PNS的分枝桿菌混合來使用，從而增強寄主對編碼伴侶分枝桿菌載體表達的免疫原的PNS的應答。這種由分枝桿菌載體編碼的特殊細胞因子不是本發(fā)明的關鍵點，包括但不限于白細胞介素-4(這兒指為"IL-4";Genebank登錄號AF352783(鼠科IL-4)或畫一000589(人類IL-4))、IL-5(Genebank登錄號NM—010558(鼠科IL-5))或NM—000879(人類IL-5))、IL-6(Genebank登錄號M20572(鼠科IL-6)或M29150(人類IL-6))、IL-10(Genebank登錄號NM_010548(鼠科IL-10)或AF418271(人類IL誦IO))、Il-12p40(Genebank登錄號NM—008352(鼠科IL-12p40)或AY008847(人類IL-12p40))、IL-12p70(Genebank登錄號NM—008351/NM_008352(鼠科IL-12p35/40)或AF093065/AY008847(人類IL-12p35/40))、TGFp(Genebank登錄號NM—011577(鼠科TGF(31)或M60316(人類TGF卩1))、以及TNFa(Genebank登錄號X02611(MurineTNFa)或M26331(人類TNFa))。用于將編碼P/o基因的基因導入BCG基因組的特殊方法不是本發(fā)明的一個關鍵特征，而且可能選自為本領域技術人員所熟知的方法(Parish"a/.,M/croZn'o/ogy，145:3497-3503;1999)。一個優(yōu)選的方法將P/o基因耙向weC位點，從而導致后面基因的失活并為修飾菌株的篩選創(chuàng)造一個標記(Qadrier/CZ/m'cM/cro.20(6)，1198-1199;1984)。為了達到目的，一種合成的等位基因交換質粒，例如以下所選實施例中多描迷的質粒，可經過修飾而引導(harbor)側翼ureC基因(基因組數(shù)據(jù)庫號Mbl881)末端5個和3個閱讀框的lkb序列。然后，尸/o^基因(基因組數(shù)據(jù)庫號CPE0163)被插到Ag85B啟動子控制下的側翼序列。為了分泌PfoA蛋白，可用Ag85B的前導肽序列來置換天然的PfoA信號序列，確保其從重組BCG菌株中有效地分泌。將等位基因交換質粒導入目標BCG菌株的方法不是本發(fā)明的關鍵特征，可通過對分枝桿菌使用標準的電穿孔方法來完成。同樣地，這種影響等位基因交換和將Pfo等位基因導入weC位點的特殊方法不是本發(fā)明的關鍵特征，可從為本領域技術人員所熟知的方法中挑選。一個自殺載體，例如附圖l所描述，可提供一種優(yōu)選的方法，因為這種質粒含有兩個抗生素篩選標記，可縮小對自發(fā)的抗生素抗性突變體的篩選。在等位基因交換期間，PfoA基因片斷置換"^C基因，結果形成左右側翼序列的同源性重組，從而導致穩(wěn)定的染色體整合和PfoA的表達。這種方法的優(yōu)點在于不需要抗生素來維持終產物，在終菌株中也不會出現(xiàn)無抗生素抗性的基因型或表現(xiàn)型。這是為人類所使用產品的優(yōu)選實施例(它們是"無抗")。UreC陰性表現(xiàn)型將標記經過等位基因交換的菌株并用Pfo置換weC，這可理解為陽性表現(xiàn)型可能也有一定的應用。在本發(fā)明中，；/o^在BCG中的定位不限于t^eC。其它位置包括但不限于/7/^(整合進質粒，以及染色體的fl"萬位點。本發(fā)明的那些技術人員將會明確其它;/b^在染色體中整合和表達的潛在位點。本發(fā)明也提供疫苗制劑，用于引發(fā)抗結核的免疫應答。這種疫苗制劑至少包括一個rBCG菌株和一個藥理上合適的攜帶體。用于疫苗的這種合成物的制劑為本領域的那些技術人員所熟知。這種復合物的制劑以液態(tài)或懸浮狀為代表，然而，諸如藥片、藥粒、粉末或類似物等固態(tài)物也有望得到。可能也會制備使用前可溶解進或懸浮進液體的固態(tài)物。該制劑也可能被乳化?；钚猿煞挚赡軙c賦形劑一起被混合，這種賦形劑是藥學上可接受的并能與活性成分兼容。合適的賦形劑是，例如，水、鹽、葡萄糖、棉子糖、甘油及其類似物、或其中的化合物。此外，該合成物可能含有少量的輔劑，例如濕劑或乳劑、pH緩沖劑及其類似物。此外，該合成物可能含有其它輔劑。如果想合成一種口服物，那么就要加入各種增稠劑、風味劑、稀釋劑、乳化劑、分散劑或結合劑及其類似物。本發(fā)明的合成物可能含有任意這樣的輔劑，以便提供適于應用的合成物形式。rBCG在這種形成物中的最終量可能不同。然而，通常在形成物中的量約為1-99%。本發(fā)明的疫苗制劑也可能含有輔劑，合適的實施例包括但不限于Seppic、QuilA、Alhydrogel等。此外，本發(fā)明的疫苗制劑可能含有一個rBCG的單一型，可選地，超過一個rBCG的類型可能也被用于疫苗。本發(fā)明也提供對結核產生免疫應答的方法和對哺乳動物接種抗結核疫苗的方法。對于產生免疫應答，我們是指本發(fā)明疫苗制劑的應用可引起專一性抗體(滴定范圍在l-lxl06,優(yōu)選范圍在l-lx103，更優(yōu)選范圍大約在lxl0、lx106，最優(yōu)選范圍大于lx106)和/或細胞增殖的合并，這可通過，例如，3H胸苷合并被測量。該方法涉及使用由本發(fā)明中rBCG菌株組成的合成物，其在藥理上對哺乳動物具有可接受的攜帶體。本發(fā)明的疫苗制劑可能以那些為本領域技術人員所熟知的任何適合的方式被使用，包括但不限于注射、口服、intranasally、食用含有rBCG的食品等。在優(yōu)選實施例中，應用的方式是皮下或肌肉注射。以下實施例被認作本發(fā)明各方面的示例，同時并不限于本發(fā)明的實踐方面。本發(fā)明的那些普通技術人員將感到欣慰的是，如果不背離本發(fā)明說明書中的常規(guī)范圍的話，那么可選的材料、方法和程序可能會不同并仍然保留在普通技工的技術中。實施例存在于結核桿菌里的MHCI型-限制性CD8+T細胞免疫保護的重要作用已得到了證實(Flynn"a/.,j";m，1992)。為了努力改善CD8T細胞應答，已構建了一株重組BCG菌株，來表達單核細胞增生李斯特菌的李斯特菌細胞溶解素。然而，這個重組BCG(rBCG)不能顯示逃出內體的增強能力，因此不能引起細胞應答誘導的提高，例如，MHCI型-限制性CD8+T細胞應答。檢測發(fā)現(xiàn)，有不至lJl^的該菌株逃出了內體。這是不足為奇的，因為李斯特菌細胞溶解素的活性對pH非常敏感，因此在內體內的pH下，酶可能不顯示活性。盡管有這種缺陷，這個重組菌株的保護性和安全性均得到了顯著改善。在此發(fā)現(xiàn)的基礎上，我們己通過將衍生于產氣莢膜梭菌的Pf0A(3,37Q導入BCG染色體中，構建了一株新的rBCG菌株。PfoAcju7Q具有一個氨基酸位點的變化，其137位的G變?yōu)镼。這種單個氨基酸的改變導致了哺乳動物細胞中野生型PfoA的毒性喪失，然而酶仍然保持其內體溶素功能。該成品菌株通過小鼠實驗顯示是安全的并具有免疫原。材料和方法常規(guī)的對于以下部分所描述的每個實驗，限制性內切酶(這兒指"REs";NewEnglandBiolabsBeverly,MA)、T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabsBeverly,MA)和Tag多聚酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)根據(jù)制造商的方法來使用；質粒DNA根據(jù)制造商的方法(Qiagen，SantaClarita，CA)應用小規(guī)模(QiagenMiniprepRkit,SantaClarita,CA)或大規(guī)模(QiagenMaxiprepRkk，SantaClarita,CA)質粒DNA純化盒來制備；無核酸酶、分子生物學級milli-Q水，Tris-HCl(pH7.5)，EDTApH8.0,lMMgCl2，100%(v/v)乙醇和超純瓊脂糖和瓊脂糖凝膠電泳緩沖液等購買于LifeTechnologies,Gaithersburg,MD。RE消化、PCRs、DNA連接反應及瓊脂糖凝膠電泳等根據(jù)眾所周知的程序來進行(Sambrook，etal.,Mo/ecw/arC7om'wg..爿丄a6ora《orj;Afa聰a/.1，2,3;1989);(Straus,e"/"ProcNatlAcadSciUSA.Mar;87(5):1889-93;1990)。為了證實以下部分所描述的每個重組質粒的DNA序列，可進行核苷酸測序，測序可通過常規(guī)的自動化DNA測序技術來完成，所使用的測序儀是應用生物系統(tǒng)的自動化測序儀，型號為373A(AppliedBiosystemsautomatedsequencer,model373A)。PCR引物購自商業(yè)化的賣主，例如Sigma(St.Louis，MO)，或使用應用生物系統(tǒng)的DNA合成儀(型號373A)來合成。PCR引物的使用濃度為150-250pM，.PCR反應的退火溫度使用CloneManager軟件4.l版(ScientificandEducationalSoftwareInc.,Durham,NC)來決定。PCRs在StrategeneRobocycler，型號400880(Strategene,LaJolla,CA)上來操作。用于擴增的PCR引物使用CloneManager⑧軟件4.1版(ScientificandEducationalSoftwareInc.,Durham,NC)來設計。這個軟件能設計PCR引物，也能鑒別與所使的專一性DNA片斷匹配的RE位點。PCRs在熱循環(huán)裝置上來操作，例如StrategeneRobocycler,型號400880(Strategene),PCRs中引物退火、延伸和變性的時間根據(jù)標準程序來設定(Straus"a/,1990)。RE消化和PCRs接著通過使用標準程序的瓊脂糖凝膠電泳來分析(Strausa/，sw戸1990;andSambrook"a/.，，ra1989)。一個陽性克隆被定義為一個具有適當?shù)腞E樣品和/或PCR樣品。如上所述，通過這個方法鑒定的質?？蛇M一步使用標準的DNA測序方法來評價。大腸桿菌菌株，例如DH5和Sable2R，購買自LifeTechnologies(Bethesda,MD)并用作重組質粒的起始寄主。重組質粒通過電穿孔導入大腸桿菌，電穿孔使用的是一種高壓電脈沖裝置，例如GenePulser(BioRadLaboratories,Hercules,CA)，設置在100-200。,，5-25(iF和1.0-2.5kV，這點已描述過(Straussfl/，w;ra1990)。電穿孔的最佳條件通過每個細菌每megDNA的最大轉化率來確定。細菌菌株代表性地生長于胰蛋白酶的大豆瓊脂上(Difco，Detroit,MI)或胰蛋白酶的大豆肉湯里，這可根據(jù)制造商的指導來做。除非另有說明，所有細菌生長在37。C，5%(v/v)C02，溫和振蕩的條件下。在適當?shù)臈l件下，要在培養(yǎng)基中補充抗生素(Sigma，St.Louis,MO)。細菌菌株有代表性地以每毫升大約109個菌落形成單位(這兒指"cfu")懸浮于含有30X(v/v)甘油的中，-80°(:儲存。BCG中的等位基因交換。先前技術講了將改變了的等位基因導入分枝桿菌菌株的方法，而且本發(fā)明的那些技術人員能夠解釋和執(zhí)行該方法(Parishe"/.，M/c油'o/ogy,146:1969-1975;2000)。一個新的產生等位基因交換質粒的方法使得合成DNA的使用成為必需。本方法的優(yōu)點在于這種質粒產品具有很高的定義史(definedhistory)并符合聯(lián)邦監(jiān)管的要求，以前使用的方法盡管有效，但缺乏文獻記載的實驗室培養(yǎng)記錄，因此不可能符合聯(lián)邦監(jiān)管的要求。如果一個適用于人類的產品要得到美國和歐洲監(jiān)管部門的許可，就必須符合這些要求。作為分枝桿菌中等位基因交換的一個自殺載體，是能夠在大腸桿菌菌株中復制而不能在分枝桿菌屬，例如結核分枝桿菌和BCG中復制的質粒。本發(fā)明中用于等位基因交換程序的專一性自殺載體是不重要的，能從學術和商業(yè)資源中得到篩選(Parishe"/.,j"/ra,2000)。等位基因交換的一個自殺質粒的優(yōu)選設計如附圖1所示。該質粒由以下DNA片斷組成質粒在大腸桿菌中復制的一個oriE序列(Genebank登錄號L09137)，在大腸桿菌和分枝桿菌中篩選的一個卡那霉素抗性基因(Genebank登錄號AAM97345)，以及一個額外的抗生素篩選標記，例如抗性基因(Genebank登錄號AAU06610)，其受一個分枝桿菌啟動子的控制(例如，/z^M啟動子)。第二個抗生素篩選標記是不重要的但可能會被包含，形成雙篩選，在等位基因交換過程中阻止自發(fā)卡那霉素抗性分離物的產生。這種自殺載體的構建可使用標準重組DNA技術來完成。然而，當前的監(jiān)管標準(例如聯(lián)邦監(jiān)管)已從對已曝光產品中含有朊病毒顆粒到受瘋牛病(BSE')感染的牛制品中提高了警覺。為了避免將物質(例如DNA序列)引入來源未知的目標菌株，所以通過商業(yè)資源(例如Picoscript，Inc.)來合成存在于自殺載體里的所有DNAs是更可取的。因此，構建自殺載體的一個優(yōu)選方法是應用DNA軟件(例如CloneManager)來組裝一套DNA序列的方案，然后通過任何供應商所提供的服務(例如PicoscriptInc.)來免費合成該DNA。該程序用來設計和獲得用于以下部分實施例的自殺載體。以上所述自殺載體(附圖1)的構形具有優(yōu)勢，因為這個質粒含有兩個抗生素篩選標記，這會降低對一個抗生素顯示抗性的自發(fā)突變體的篩選，其每代約以1/108的幾率產生。對兩個抗生素有自發(fā)抗性的非常少，僅以每代約1/1016的幾率產生。因此，雙抗菌株出現(xiàn)在培養(yǎng)物中的概率小于1/106，該培養(yǎng)物用來完成等位基因交換程序。要在等位基因交換過程中進行陰性篩選，可用一個具有蔗糖敏感表現(xiàn)型的^W基因(Genebank登錄號NT01BS4354)來濃縮菌株培養(yǎng)物，該菌株己經過了最終的DNA重組并完成了等位基因交換。分枝桿菌的培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已選的BCG菌株，例如Middlebrook7H9或Saulton合成培養(yǎng)基，適宜在37°C下培養(yǎng)。該菌株可靜止或振蕩培養(yǎng)。此外，可通過加入油酸(0.06%v/v;ResearchDiagnosticsCat.No.01257)和清潔劑，例如Tyloxapol(0.05%v/v;ResearchDiagnosticsCat.No.70400)，來提高BCG的生長率。BCG培養(yǎng)物的純化用磷酸鹽緩沖液(這兒指PBS)連續(xù)稀釋(例如10倍稀釋法，0-l(T8)BCG，然后取100ml的BCG稀釋物，均勻鋪在含有25-30ml固體培養(yǎng)基的3.5英寸平板上，例如Middlebrook7H10。此外，該培養(yǎng)物的純化可進一步應用商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基來評定，例如巰基乙酸鹽培養(yǎng)基(ScienceLab,cataloguenumber1891)和大豆-酪素培養(yǎng)基(BD，cataloguenumber211768)。BCG種批以0.1-2xl07cfu/inl的密度保存在-80。C。典型地，液體培養(yǎng)物在0.2-4.0的光密度(600nm)下獲得，以無菌空白作為對照；培養(yǎng)物置于適當大小的離心管中，8,000g離心5-10min。廢棄上清，生物體以0.1-2xl07cfu/ml懸浮在含有10-30%(v/v)甘油的Middlebrook7H9儲存液中。將懸浮物分裝在L5ml無菌的硅酸硼冷凍小瓶中，然后置于-80°C。實施例1.能逃出內體的rBCG-PfoA菌株的構建能逃出內體的rBCG-PfoA菌株的構建可通過ureC基因側翼區(qū)的等位基因交換來實現(xiàn)。結果，PfoA基因片斷置換"wC基因，允許穩(wěn)定染色體的PfoA表達。詳細描述如下。構建等位基因交換質粒等位基因交換質粒由下列DNA片斷組成一個在大腸桿菌中復制的oriE序列，一個在大腸桿菌和分枝桿菌兩者中篩選的卡那霉素抗性基因，以及一個額外的抗生素篩選標記((zeocin抗性基因)，其由Hsp60啟動子表達。第二個標記可用于制作雙篩選，從而在此過程中阻止對卡那霉素的自發(fā)抗性。對于等位基因交換過程中的陰性篩選，可使用一個蔗糖敏感性基因。最終，側翼目標BCG丹麥1331菌株ureC基因左右lkb的序列將PfoA基因夾在之間。該基因在Ag85B啟動子控制下表達。前導肽序列用于置換最初的PfoA分泌信號肽序列。最終，所有這些組分由PicoscriptInc(Houston,TX)合成和裝配。最終生成的質粒是一個分枝桿菌自殺載體，獲得該質粒的圖如附圖1所示。最終生成的質粒結構如附圖5所示被確認。將等位基因交換質粒導入牛分枝桿菌BCG丹麥1331菌株等位基因交換的過程由附圖4流程圖來說明，其概括了該程序的主要步驟。那些步驟由以下來詳細描述。BCG丹麥1331培養(yǎng)在7H9培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有10%的OADC(油酸-白蛋白-葡萄糖-觸酶)(BDGibco)和0.05%(v/v)的Tyloxapol(researchanddiagnosticlab)補充物。當培養(yǎng)進入對數(shù)期時，收集細菌并按以前說述的方法(Sun"a/.,2004)為電穿孔做準備。使用標準的方法將5/xg等位基因交換質粒導入新鮮制備的電感受態(tài)細胞。通過標準電穿孔分枝桿菌的方法，將以上構建的等位基因交換質粒導入牛分枝桿菌BCG丹麥1331菌株。電穿孔后，細胞在7H9培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10%的OADC和0.05%(v/v)的Tyloxapol補充物。然后細胞被鋪在含有50Mg/ml卡那霉素和zeocin的7H10平板上。挑選最終生成的克隆并培養(yǎng)在含有10c/c(v/v)蔗糖的7H9培養(yǎng)基中。將獲得的培養(yǎng)物鋪在7H10平板上進行克隆，獲得單個菌落，其可由PfoA基因置換ureC得到識別。附圖4所示的流程圖概括了這個方法的主要步驟，表l描述了自殺載體、pAF102，其在附圖l中也有描述。表l.用于本發(fā)明的自殺載體<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例l表明，分枝桿菌BCG菌株通常被工程化，表達一個可選的溶內體蛋白，其在中性pH是有活性的，允許分枝桿菌逃出細胞胞質中的內體。實施例2.rBCG-PfoA菌株的確認實施例2的材料和方法.分枝桿菌的培養(yǎng)對于以下實驗，BCG菌株在含有10。/。OADC補充物的Middlebrook7H9培養(yǎng)基(BDbiosciences)中，37。C下培養(yǎng)。使用Tyloxapol(0.05%v/v，ResearchDiagnosticsCat.No.70400)來分散細菌。實驗中比較不同菌株之間的生長，在接種后的不同時間測定光密度(600nm)。對于卡那霉素敏感性的測試，可按以上所述制備培養(yǎng)物并測定其生長，除了卡那霉素加入的終濃度為50/ig/ml。當使用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)該細菌時，適當時可使用Middlebrook7H10瓊脂(BDbiosciences)，卡那霉素加入的終濃度為50/ig/ml，蔗糖加入的終濃度為3%。脲酶活性的測定根據(jù)制造商的指導，在缺乏脲酶活性的條件下，使用脲酶測試盒(BDDifico)初次篩選實施例l所描述的來自蔗糖平板的終產克隆。簡要地，挑取一環(huán)細菌再次懸浮在制造商所提供的測定緩沖液中，緩沖液裝在透明試管中。BCG丹麥1331菌株用作脲酶陽性對照。單獨的緩沖液用作陰性對照。室溫下培養(yǎng)反應混合物30min，結果可根據(jù)制造商的指導來判定。攜帶AwwC://b」的rBCG菌株的遺傳型分析.使用正向引物[acggctaccgtctggacat](SEQIDNO:4)和反向引物[cgatggcttcttcgatgc〗(SEQIDNO:5)來進行PCRs，擴增尸/o專一性插入等位基因的DNA序列和側翼weC基因的BCG基因組的DNA序列。PCR參數(shù)如下步驟l:95'C4min，l個循環(huán)；歩驟2:95°C1min，60°C1min，72°C1min，共30個循環(huán)；步驟3:72°C10min，l個循環(huán)；步驟4:4'C儲存。PCR終產物通過瓊脂糖凝膠電泳來分析，通過自動化雙脫氧核苷酸測序技術來測序，并證實全長尸/o^基因置換"wC基因的出現(xiàn)(例如wreC::尸/oJ)。AFV102在巨噬細胞中的生長通過決定分枝桿菌在已感染巨噬細胞里的菌落形成單位(CFUs)，rBCG菌株AFV102的原位生長可在J774A.1類巨噬細胞里得到測定。J774A.1細胞感染后的3小時，通過測定胞內CFU來決定分枝桿菌吞噬作用的效率。隨后如先前所述(Sun^"/.,2004)，通過裂解細胞來釋放胞內細菌，用5倍的PBS清洗后，計數(shù)CFU。由AFV102表達的Pfo溶血活性的分析為了評價PfoA的分泌作用，讓菌株生長到以上所述的對數(shù)中期。然后收集培養(yǎng)物上清和細菌。AFV102細菌沉淀物再次用100pl含有0.1。/cBSA的PBS(pH7.0)懸浮在96孔V底平板中。為了測定PfoA蛋白是否分泌到培養(yǎng)物上清中，離心液體培養(yǎng)物，所得上清用于測定。為了測定表達的PfoA的溶血活性與其pH無關，樣品用如上所述的方法來制備，除了用不同pH值的PBS緩沖液作為反應緩沖液。每孔中加入100pl1%的清洗過的綿羊紅細胞。輕輕混合反應物，于37'C下振蕩培養(yǎng)1h。BCG丹麥1331菌株作為溶血的陰性對照。連續(xù)稀釋已知溶血活性單位的a-溶血素(Sigma)作為溶血的陽性對照。培養(yǎng)結束后，于500g下離心15min,來自V底板的上清被轉移到平底96孔板的相同位置，并測定光密度(450nm處的吸光度減去540nm處的吸光度)。通過測量紅細胞裂解后顏色改變的光密度，定量PfoA分子的溶血活性。顏色的亮度與紅細胞裂解量成比例，其然后與溶血素的量成比例。然后樣本值可通過已知標準從標準曲線上讀出。溶血單位定義為50%免疫紅細胞裂解后的樣本稀釋度。AFV102對巨噬細胞的細胞毒性應用"CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssay"試劑盒(Promega，cat#:G3580),根據(jù)制造商的說明，通過測量從感染細胞中釋放觸的乳酸脫氫酶(LDH)，來確定重組菌株對J774A.1巨噬細胞(ATCCNo.ATIB-67)的細胞毒性。簡要地，AFV102細菌以10倍的級數(shù)感染細胞。在感染后的不同時間，以細胞中釋放出的LDH量測量上清，然后與BCG丹麥1331菌株比較。以非感染的正常細胞為陰性對照。以感染細胞中釋放出的LDH量與陰性對照細胞(100%的細胞存活)的對照為基礎，計算存活細胞的比例。實施例2的結果.AFV102的構建在AFV102的構建過程中，可選的局部二倍體細菌培養(yǎng)在含有Middlebrook7H10的蔗糖平板上，最終通過PfoA表達盒來讓等位基因交換基因置換"reC基因，該細菌可經過其同源性DNA片斷與敲除質粒上的DNA片斷進行等位基因交換，在其染色體上引導全部敲除質粒。在蔗糖平板上產生的菌落中，發(fā)現(xiàn)一個菌落Pfo-105-5(重新命名為AFV102)對脲酶是陰性的，推斷wreC基因已通過PfoA表達盒被置換了。這個細菌菌落進一步通過AweC.vfi;7/oJ基因型的PCR來進行基因型分析。PCR反應的終產物通過1.2y。的瓊脂糖凝膠電泳來分析，結果如附圖6所示。從結果可看出，用細菌作為模板的PCR可產生所期望大小的PCR產物，其大于雙親本BCG丹麥1331菌株的大小。AweC::Q;/"基因型的DNA條帶的預期大小為2180bps，然而雙親本BCG丹麥1331菌株的大小為1967bps?？寺?05-5的PCR產物進一步通過凝膠被純化，也通過JohnsHopkinsUniversity(Baltimore,MD)的商業(yè)化測序設備被測序。測序結果顯示，該菌落具有期望的AweC::Q;/o^基因型。此外，PCR可靶向擴增卡那霉素基因和從AFV102菌株上得不到的^c5基因，得到任意PCR產物(數(shù)據(jù)未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)推斷，AFV102已經過了最終的等位基因交換步驟并具有期望的A"^C.fi;/^4基因型。AFV102的生長特性和卡那霉素敏感性測試在脲酶活性測定和基因型結果的基礎上，克隆105-5(重命名為AFV102)顯示出了期望的基因型和AwreC.vfl;/o^基因型。然后，通過其與雙親本BCG1331菌株的比較，進一步測定AFV102在7H9生長培養(yǎng)基上的生長能力。結果如附圖7顯示?？煽闯?，AFV102在7H9生長培養(yǎng)基上具有與雙親本菌株非常相似的增殖曲線。此外，在卡那霉素存在的情況下，AFV102的生長降低程度與雙親本BCG丹麥1331菌株的相似，由此推斷，如期望一樣，其對卡那霉素具有相似的敏感性。AFV102的細胞毒性已報道，PfoA蛋白的單個氨基酸的改變(密碼子從編碼Gly的gga突變?yōu)榫幋aGln的cag)可導致對哺乳動物細胞毒性的喪失。然而該蛋白仍保留介導細菌逃出液泡的能力(Portnoysupra,1996)。從AFV102中表達的蛋白毒性通過用AFV102細菌感染J7741A細胞來評定。感染后在不同的時間點與未感染的正常細胞進行比較，AFV102不會引起任何比當前使用的BCG丹麥1331疫苗菌更重要的細胞死亡(附圖8)。在肺泡巨噬細胞細胞系中的存活為了調查該構建物是否能在巨噬細胞中存活，使用對數(shù)中期培養(yǎng)物來感染J774A.1肺泡巨噬細胞。細胞以l:l的感染復數(shù)(MOI)被感染。感染后，通過在不同時間間隔對細菌進行平板計數(shù)，來監(jiān)控分枝桿菌的胞內存活。這點可能會在附圖9中看到，AFV102構建物顯示出與雙親本菌株相似的持久基因型，意味著這個構建物在J774A.1細胞中的胞內存活沒有缺陷。通過AFV102分泌PfoA蛋白由含有AFV102構建物的細菌分泌PfoA蛋白可通過與BCG丹麥1331菌株相比能提高溶血活性的細菌培養(yǎng)物上清的測量來測定。在相同的光密度下獲得AFV102和BCG丹麥1331菌株的培養(yǎng)物上清，并比較二者裂解紅血細胞的能力。結果顯示在附圖10中。與以前的報道一致，由于細菌在生長期間釋放代謝物，BCG培養(yǎng)物上清顯示出一個基線水平的溶血活性，可能導致紅細胞裂解(Grodeetal"Jo訓a/o/C/z'wica//騰j爭"'ow，115:2472-2479;2005)。與BCG丹麥1331菌株相比，AFV102培養(yǎng)物上清具有更高水平的溶血活性，與分泌進培養(yǎng)物上清的PfoA分子一致。此外，PfoA的非pH依賴性的溶血活性進一步在pH5.5和7.0下被測定和比較，結果顯示在附圖IO中。可看出，來自AFV102的上清在pH5.5和7.0下具有相似的溶血活性，這就意味著，如期望的一樣，PfoA的溶血活性是pH非依賴性的。實施例2表明，該構建菌株具有預期的生物活性，以及該菌株所產生的Pfo是分泌型的并具有pH非依賴性活性。實施例3.rBCG-PfoA內體逃出和動物免疫原性測試結核分枝桿菌發(fā)病機理的一個主要范例是噬菌化膿的捕捉。Armstrong和Hart(1971)已確定，結核分枝桿菌的吞噬體不能與鐵蛋白標簽溶酶體混合，稱作吞噬體-溶酶體融合子的抑制。牛分枝桿菌疫苗菌(BCG)也發(fā)現(xiàn)存在于吞噬體的間室中，隱匿在終端內吞細胞器官中(ClemensandHorwitz，1995;Hasane"/.，1997;Viae"/.,1997)。發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌吞噬體具有的鐵傳遞蛋白受體(TfR)在密度上與那些存在于質膜上的TfR相似。鐵傳遞蛋白受體被快速(t1/2inminutes)從內體中移出，并回傳到質膜；然而，在分枝桿菌吞噬體內，這個過程被中斷了，而且吞噬體將包含鐵傳遞蛋白受體。就是這個現(xiàn)象允許我們來將含有分枝桿菌的吞噬體形象化。用抗體將吞噬體標記到鐵傳遞蛋白上。同時，分枝桿菌用熒光染料染色，一旦細菌進入吞噬體，該染料可對其進行視角監(jiān)控。結果表明，感染細胞后，rBCG-Pfo構建物能夠逃出內體。內體逃出測試的材料和方法細菌和細胞BCG丹麥1331和rBCG-A"reC.$^/0^(^7)2(AFV102)生長在含有10%(v/v)OADC和0.05%(v/v)Tyloxapol補充物的7H9培養(yǎng)基上(生長培養(yǎng)基)，OD600大約在0.8-1.0。感染前，根據(jù)廠商指導，用AlexaFluor568succinimidylester(MolecularProbes,Eugene,OR)標記細菌細胞，置于PBS中，室溫下放置1-1.5小時。這個染料會在位于細菌表面上蛋白的一級胺上形成非常穩(wěn)定的氨鍵。簡要來講，10ml細菌培養(yǎng)物被顆粒化并重新懸浮在25ml含有0.625pg/mlAlexaFluor568的PBS中，室溫下培養(yǎng)1-1.5小時，來標記細菌。然后用PBS(pH7.2)清洗標記的細菌細胞3次，并重新懸浮在7H9生長培養(yǎng)基中，在冰箱中過夜儲存。如前所述(Simwa/，2004)，J774A.1細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，使用6孔培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板表明有人類顯微連接蛋白包被的涂層。細胞鋪在培養(yǎng)板上的密度是3xl(^個細胞/L，在37。C、5%(:02和潮濕的條件下培養(yǎng)2天。感染期間，標記細菌被顆?；⒅匦聭腋≡贒MEM+10%FBS培養(yǎng)基中，并且直接以每個細胞10的感染復數(shù)(MOI)添加到J774A.1細胞。20min、8h、24h后，細胞在室溫下用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)清洗。然后細胞用2%多聚甲醛在PBS(pH7.2)中、室溫下固定20min。固定的細胞然后用0.1%TritonX-100在PBS(pH7.2)中、室溫下滲透10min，接著用PBS(pH7.2)洗2次。用3%牛血清白蛋白(BSA)、5%正常山羊血清(NGS)禾n0.5%疊氮鈉在PBS(pH7.2)中、室溫下至少終止2h或4。C過夜。去除終止緩沖液，然后將抗小鼠的鐵傳遞蛋白受體-FITC(USBiological,Swampscott,MA)以1:50的稀釋倍數(shù)加入到PBS(pH7.2)中，該PBS含有1。/。BSA、3%NGS和0.5%疊氮鈉，接著在室溫下至少培養(yǎng)1h。然后用PBS清洗2-3次，并且用vectsheildmounting培養(yǎng)基層鋪在玻片上。使用NikonTE2000反向顯微鏡，以1500的放大倍數(shù)分析，該顯微鏡上配備有RetigaEXIMono,12bitcooled,IR濾波數(shù)字式成像機。結果在顯微鏡下檢査時，發(fā)現(xiàn)感染后15min，BCG和rBCG-PfoA細菌均被寄主細胞內在化(internalized)，然而，感染后8h，發(fā)現(xiàn)與BCG細菌相比，rBCG-PfoA細菌在內體的外面，大部分BCG細菌位于寄主吞噬體內。這些結果在附圖11A-D中用圖解進行了說明，其說明了細菌侵染巨噬細胞(附圖11A)、BCG在內體中的持續(xù)(附圖IIB)、早期內體內的AFV102(附圖11C)、以及由于重組PfoA的分泌，AFV102細菌從內體中逃出進細胞胞質中(附如11D)。細菌計數(shù)表明，感染后8小時，138個AFV102細菌中有100個逃出了內體(72%)，然而100個BCG細菌中僅有29個逃出了內體(26%)。感染后24小時內檢査細菌，產生相似的結果。這個發(fā)現(xiàn)表明，PfoA的表達可增強AVF102從吞噬體中釋放出來。應用一種不同的體系，對這個結果進行了進一步的驗證，該體系在一個和以上相似的實驗環(huán)境和程序下，用pH敏感性染料標記內體和溶酶體(Lysotracker-Red，Molecularprobes,catalognumberL-7528)。細菌在568的波長發(fā)射下觀察，而吞噬體在488的波長發(fā)射下觀察。該結果與以上發(fā)現(xiàn)一致。實施例3表明，重組菌株AVF102能夠逃出內體，而BCG菌株逃出內體的效率甚微。因此，菌株AVF102比BCG更有可能引起組織相容性-I型免疫應答，而且將在疫苗應用上非常有用。實施例3的參考文獻.ArmstrongJ,HartPD.1971.ResponseofculturedmacrophagestoAfyco6a"e"'謂fw6ercw/o&，withobservationsonfusionoflysosomeswithphagosomes,/五xpMed.134:713-40.Afyco6a"eW訓/wZercw/os/jand戶ewmo/7/zZ/cphagosomesexhibitarrestedmaturationdespiteacquisitionofRab7./"/e"/mmw".68(9):5154-66.HasanZ,SchlaxC，KuhnL，LefkovitsI，YoungD，TholeJ,PietersJ.1997.Isolationandcharacterizationofthemycobacterialphagosome:segregationfromtheendosomal/lysosomalpathway.Mo/Mcro6/o/25(2):427ViaLE，DereticD,UlmerRJ，HiblerNS,HuberLA，DereticV.Arrestofmycobacterialphagosomematurationiscausedbyablockinvesiclefusionbetweenstagescontrolledbyrab5andrab7.■/5/o/CTzem.1997.272(20):13326-31.SunR,ConversePJ,KoC，TyagiS，MorrisonNE，BishaiWR.2004.M少co6a"eWwm^e/-cw/oj/-yECFsigmafactorsigCisrequiredforlethalityinmiceandfortheconditionalexpressionofadefinedgeneset.M/M/cro6zW.52(l):25-38實施例4.疫苗接種方法和配方.疫苗配方以決定其在整個生產過程中的最大生存能力和穩(wěn)定性研究為基礎。這包括培養(yǎng)期間微生物的最大生存能力(活到死)的確定，分枝桿菌的培養(yǎng)可使用各種常規(guī)培養(yǎng)基，包括甘油、糖、氨基酸、以及清潔劑或鹽等添加劑。培養(yǎng)后，通過離心或切向流過濾獲得細胞，并將之重新懸浮在一種穩(wěn)定性培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基在冷凍或冷凍干燥期間可保護細胞。通常使用的穩(wěn)定劑包括谷氨酸鹽、氨基酸或氨基酸的衍生物、甘油、糖或常用鹽。終配方將提供由皮內輸送、皮下注射、灌注或口服的完全存活的微生物，為運輸和使用保持充足的貨價期。TB疫苗的潛伏期評價常規(guī)安全試驗以2xl06CFU的rBCG有益菌株和同功的雙親本菌株對6組BALB/c小鼠進行腹膜內感染。侵染后14天對這些動物進行常規(guī)的健康和體重檢查。獲得BCG和rBCG菌株的動物依然健康，而且體重下降，在觀察期間沒有明顯的病癥。新的菌株在免疫活性鼠中的毒性.以2xl06rBCG和雙親本菌株對15組BALB/c小鼠分別進行腹膜內感染。浸染后的第l天，將每組中的3只小鼠致死，分析脾、肺或腎中的CFUs，確保每只動物具有相同的感染劑量。在浸染后的第4，8，12和16周，將每組中的3只小鼠致死，獲得其脾臟、肺或腎中的CFUs，與雙親本BCG菌株比較，確定rBCG菌株的體內生長。免疫低弱老鼠的嚴謹安全測試.以2x10、BCG和雙親本菌株感染IO組具有SCID(嚴重聯(lián)合免疫缺陷)表現(xiàn)型的免疫低弱小鼠。侵染后的第1天，將每組中的3只小鼠致死，評價其脾、腎和肺中的cfii來確定接種劑量。監(jiān)控每組中剩余7只小鼠的一般健康和體重。追蹤這些存活的小鼠并在整個觀察期間比較存活的rBCG感染小鼠與存活的雙親本菌株感染的動物。'豚鼠安全試驗.與已確定對人類具有很好安全性的雙親本BCG疫苗進行比較，rBCG菌株的安全性也在豚鼠模型中進行了評定。首先，檢查該疫苗對動物普通健康狀況的作用，包括增重。以107(100倍的疫苗劑量)的重組和雙親本菌株對豚鼠進行肌內免疫，連續(xù)6周對這些動物的常規(guī)健康和體重進行監(jiān)控。對6周前死亡的動物進行事后分析檢査。所有動物在感染后6周的末期被致死。在該試驗的證實下，沒有發(fā)現(xiàn)減重和非異常行為，而且所有器官在6周尸體解剖中顯示正常，而且/或者發(fā)現(xiàn)對rBCG，PfoA疫苗沒有不良健康作用，以及接種rBCG-PfoA疫苗的動物與接種雙親本菌株的動物相比，以正常的速率獲得了體重。同時監(jiān)控了動物器官中的細菌水平。用雙親本或重組疫苗免疫的豚鼠在接種后的不同間隔施無痛致死術，之后化驗肺、脾和局部(腹股溝)淋巴結中的BCG或rBCG的CFU。毒性試驗.為了評價rBCG菌株的毒性，用1個劑量、高于單劑量4倍或低于單劑量4倍的使用于人類的rBCG菌株、BCG雙親本菌株或鹽水對豚鼠(每組12只)進行皮內疫苗接種。接種后的第3天，將6只動物致死來評定疫苗對這些動物的急性效應。接種后的第28天，將剩余的6只動物致死來評價慢性效應。在兩者的時間點，獲得每只動物的體重，并檢査肉眼病理和注射部位的外觀。鼠科保護性研究.13組C57B1/6小鼠(雌性，5-6周歲)以106CFU的rBCG、雙親本BCG或鹽水進行皮下免疫。另組小鼠作為健康對照。免疫后的第8周，小鼠用結核分枝桿菌株(或H37Rv卡那霉素抗性株)進行激發(fā)，所用的是一種產自共含有1(^CFU激發(fā)株的10ml單細胞懸浮液的氣溶膠(aerosol),如前所述，一個劑量可傳遞大約100個活菌到每個動物的肺部(Brodine"/.，JInfectDis.,190(1):115-122;2004)。監(jiān)控接種動物伴隨未激發(fā)動物的存活。隨著激發(fā)，發(fā)現(xiàn)這些動物的體重健康狀況下降。激發(fā)后的第l天，將3只小鼠致死獲得肺部CFU來確定激發(fā)劑量，致死1只動物進行脾臟和肺臟組織病理學研究。激發(fā)后的第5周，將每組中的9只動物致死，并進行組織病理學和微生物學分析。對6只小鼠肺臟和脾臟組織進行CFU計數(shù)分析(使用選擇性平板來將疫苗株從激發(fā)株中區(qū)分開來)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性株激發(fā)，那么可用卡那霉素或TCH(噻酚-2-羧基?；?來將疫苗株從激發(fā)株中區(qū)分開來(BCG是易感的，而結核分枝桿菌是天然抗性的)。皮膚遲發(fā)性超敏反應的誘導(DTH).以103rBCG或BCG雙親本菌株對無特殊病源體(SPF)進行皮層免疫。免疫后的第9周，削刮這些動物的后背并用100pl含有l(wèi)OpgPPD(蛋白純化衍生物)的磷酸鹽緩沖液進行皮內注射。24小時后測量硬結外徑(DTH)。rBCG株誘導的DTH等于或大于雙親本BCG株誘導的。豚鼠激發(fā)研究.為了確定rBCG疫苗抗結核分枝桿菌激發(fā)的功效，對12組豚鼠(年輕成年SPFHartley，250-300g，雄性)進行免疫，每個用rBCG、雙親本BCG株或鹽水進行免疫。以106cfti進行皮內疫苗接種。用含有結核分枝桿菌的氣溶膠在免疫后的第10周，對rBCG-、BCG-和假免疫的動物進行激發(fā)，該氣溶膠是由含有共107cfu結核分枝桿菌的10ml單細胞懸浮物產生的；如前所述，這個過程將大約100個活菌傳遞到每只動物的肺部(Brodine"/.,2004)。激發(fā)后，伴隨未接種、未激發(fā)的健康組動物監(jiān)控這些激發(fā)動物的存活、喪失的體重和一般健康。激發(fā)后的第10周，將每組動物中的6只致死，每組中的其余6只在激發(fā)后的第70周進行長期評價。在二者的時間點，對這些動物進行組織病理學和微生物學分析。通過組織病理學和CFU計數(shù)來評價肺組織和脾組織(使用選擇性平板來將疫苗株從激發(fā)株中區(qū)分開來)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性株激發(fā)，那么可用卡那霉素或TCH(噻酚-2-羧基?；?來將激發(fā)株從疫苗株中區(qū)分開來。如果使用結核分枝桿菌Erdman株來激發(fā)，那么可用TCH來將疫苗株從激發(fā)株中區(qū)分開來(BCG是易感的，而結核分枝桿菌是天然抗性的)。對一成功的激發(fā)研究來說，激發(fā)后假免疫動物大多很快死亡，而且rBCG免疫動物存活時間要長于BCG雙親本株免疫的動物。靈長類動物的安全和激發(fā)研究.最近，非人靈長類已用于評價抗結核分枝桿菌的疫苗。這種在人類和非人靈長類之間的進化關系以及這些種群之間相似的臨床和結核病理表現(xiàn)已使得非人靈長類模型在結核病和疫苗功效上的實驗研究引人注目。這個模型，以肺空洞(lungcavitation)的發(fā)展為特性，顯得適用于人類結核病。感染過程和疾病的追蹤手段有X射線、減重，以及各種血液學試驗，包括沉降反應(ESR)、周圍血液單核細胞(PBMC)和細胞因子、T淋巴細胞細胞毒(CTL)活性，以及抗體反應。隨著感染的進行，獼猴肺部表現(xiàn)出特征性病變，而且，根據(jù)激發(fā)劑量的差異，感染后4-6個月，會出現(xiàn)急性呼吸道感染引起的死亡。更低感染劑量會導致無疾病的慢性感染，與人類很相似。該研究直接比較各種劑量的BCG雙親本菌株對重組菌株，或單獨比較或由兩個帶有疫苗的繼發(fā)性激發(fā)劑跟蹤，該疫苗由rBCG構建物過表達的序列組成。后者以任意幾種已知的方式被傳遞，包括但不限于以基于合適輔劑的重組蛋白方式、以DNA方式或以Ad35構建物方式。初次研究在無激發(fā)劑的情況下評價雙親本BCG對rBCG構建物的保護性功效。該研究由3組動物組成，每組有10只動物一組每個包含BCG、rBCG和鹽水。每組中有2只動物用rBCG構建物中過表達的抗原進行皮試，同時以標準的PPD和鹽水為對照。與BCG比較，rBCG組中的一個陽性和較大的硬結是體內疫苗吸收和引起免疫應答的指示。每組中其它8只動物被用低劑量結核分枝桿菌Erdman株進行了氣溶膠激發(fā)，并且通過在激發(fā)后16周降低細菌載荷或用末端點的存活率進行保護性測定。隨后的BCG主要方案在本質上與以上相同，除了動物首先用BCG、rBCG和鹽水進行疫苗接種，隨后用兩個帶有過表達抗原的激發(fā)劑。在非人靈長類模型中的免疫原性和保護性研究可調査結核病在獼猴中對rBCG構建物在免疫生物學和免疫病理學方面的功效研究。這些動物是關養(yǎng)狀態(tài)下青年動物中的幼小動物，平均體重2-3kg，實驗前經過了全面的條件適應。預接種研究包括基線血液測試和沉降反應速率以及淋巴細胞繁殖分析，基線血液測試包括常規(guī)的血液學研究。用PPD進行皮試，確保對結核菌素敏感性的缺乏，并獲得胸腔X射線，作為部分預感染剖面。免疫期共持續(xù)21周，覆蓋在O周時用BCG或rBCG進行的初次疫苗接種，以及在12和16周的抗原激發(fā)?？乖禺愋悦庖咄ㄟ^測定繁殖和在淋巴細胞刺激試驗里分泌的7^擾素(IFNy)來評定。淋巴細胞產生干擾素的頻率由酶聯(lián)免疫試驗(ELISPOT)和熒光激活細胞分析儀(FACS)來確定。最后，相對于初次免疫，在0，4，8，12，16和20周采取血樣。最后免疫后的4-6周，在同一天，通過在動物的氣管內放置3ml(1,000cfu)結核分枝桿菌Erdman株以及相同的制劑來激發(fā)動物。感染過程的評價有體重下降、發(fā)燒、沉降反應速率(ESR)上升、DTH到PPD、用PPD刺激的PBMC體外增值反應以及rBCG中過表達的抗原伴隨IFN-g的測量水平。對胸部進行X射線來檢測伴隨肺部結核病的異常，最終，在激發(fā)后的12-16周進行尸體剖檢。TB載體和疫苗的臨床評價安全性和毒性研究根據(jù)以上所述的潛伏期和毒性研究，聯(lián)邦監(jiān)管要求進行潛伏期和毒性研究。這些研究后，也要進行人類安全性研究。這些研究首先在全血干擾素(Quantiferon)陰性的健康成年人身上進行，隨后將年齡降低，進入兒童和嬰兒的測試。免疫原性研究小鼠和靈長類中的免疫原性研究利用但不限于評價細胞免疫的標準方法，例如INF7、ELISPOT、用短期和長期抗原或肽刺激的流式細胞儀，等等。對人類的應答使用相似的方法。對人類接種疫苗后的CD4和CD8應答的評價，要進行四聚體研究。優(yōu)化致敏-加強(致敏-加強)療法rBCG可很好地用作抗TB或其它疾病的良好疫苗，因此，它已被工程化來表達相關抗原。這兒提到的rBCG可作為TB疫苗或表達抗原來抵抗其它疾病，也可很好地執(zhí)行用重組蛋白免疫的加強免疫前的初次免疫，重組蛋白混合有輔劑，或病毒或細菌載入的抗原。在動物臨床前研究和人類研究中，BCG初次免疫后要重組蛋白/輔劑或載體的再次免疫，可就服用方法和劑量進行優(yōu)化。這些致敏-加強療法對于誘導人類免疫是最有效的方法，因為BCG致敏的效力體現(xiàn)在本發(fā)明中，隨后通過重組蛋白或載體集中和加強免疫系統(tǒng)的加速響應。暴露后的疫苗療法在動物中的研究C57BL/6小鼠但不限于該動物將用于建立潛伏性感染；將對該小鼠在僅有可忽略的結核分枝桿菌專一性免疫誘導的時間點進行疫苗治療，并由記憶T細胞沉淀和控制。然后，將會通過對單個小鼠肺臟和脾臟的cfu進行計數(shù)，在最終疫苗治療后的2和5個月，對小鼠進行疫苗療效評定。Cfu計數(shù)將會通過標準的統(tǒng)計方法在鼠組中被分析，其結果將用于判斷疫苗療法是否可有效地降低潛伏的結核分枝桿菌對小鼠的感染。必要時，可用相似的方法來評價其它動物的應答。BCG載體的臨床評價rBCG疫苗的口服法.使用先前所述的方法可獲得帶有本發(fā)明rBCG的目標動物的口服疫苗(Milleretal.，MeJ121(1):45-54;1979)。本發(fā)明中rBCG的口服劑量將根據(jù)患者種類、疾病和治療條件而有差異。通常使用的劑量約10、10U個活力微生物，優(yōu)選約105-109個活力微生物。rBCG的使用通常要結合藥學上可接受的載體或稀釋劑。藥學上可接受的特殊載體或稀釋劑不是本發(fā)明的重點。稀釋劑的例子包括磷酸鹽緩沖液，對抵抗胃酸具有緩沖作用的緩沖液，例如含有蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(pH7.0)，單獨的碳酸氫鹽緩沖液(pH7.0)(Levinee^/.,J.Clin.Invest"79:888-902;1987;andBlack&a/"J.Infect.Dis.，155:1260-1265;1987)，或含有抗壞血酸、乳糖和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的碳酸氫鹽緩沖液(pH7.0)(Levinee《a/.，supra，1989;Lancet,11:467-470;1988)。載體的例子包括蛋白質，例如在脫脂乳中發(fā)現(xiàn)的這種蛋白質，糖類，例如蔗糖，或聚乙烯吡咯烷酮。有代表性的這種載體以大約0.1-90n/。(w/v)的濃度被使用，優(yōu)選濃度范圍在l-10°/。(w/v)。實施例5.在嚴重聯(lián)合免疫缺陷老鼠中的安全性如早期所提及，Llo在BCG中的表達證實了在促進內體逃出上相對無效，可能因為在BCG存在的修飾內體微環(huán)境的中性pH下，Llo的活性低(Hess,a/.,ProcNatlAcadSci95:5299;1998;Grodea/.,J.Clin.Invest,JClinInvest.115(9):2472;2005)。但是，Llo的表達明顯地對內體進行了充分的修飾，從而降低BCG-Llo+在SCID小鼠中的毒性(Grode"a/.，2005)。該發(fā)現(xiàn)提出，重定位BCG對寄主細胞的胞質具有潛在的免疫原性和獨特的活TB疫苗安全性的雙重促進作用。因此，該研究的目的是來確定在SCID小鼠中表達Pf0Ac;137Q的內體-逃出株AFV102的安全性。為此，雙親本菌株BCG蛋白1331((BCG1331)和表達PfoAG137Q的BCGm衍生物、菌株在2L的長頸瓶中振蕩(150個振蕩/min)培養(yǎng)至對數(shù)期(540nm處的光密度為6.5-7.5)。通過離心獲得細菌，-80°C儲存，1.5x109cfu/ml，儲存體系為鹽水十0.05%(v/v)tyloxapol+10%(v/v)甘油。通過在冰上解凍以上大瓶中的物質來制備接種物，并用無內毒素(<0.05EU/ml)的生理鹽水(0.85%w/vNaCl)做系列稀釋。用這些稀釋物對6組SCID小鼠進行皮下接種，接種劑量分別如表2所示，懸浮在0.1ml的體積中。表2.SCID小鼠安全性設計研究<formula>complextableseeoriginaldocumentpage50</formula>接種后，監(jiān)控小鼠在感染后100多天周期中的存活。該研究的結果表明，接種AFV102的小鼠存活時間要長于接種相似劑量BCG1331的小鼠。最近，使用異種加強免疫疫苗來支持BCG導致的免疫已引起了人們的關注。因此，BCG初級免疫實驗動物和人類產生強的細胞免疫應答，隨后有異種加強免疫，其由編碼結核分枝桿菌抗原85A(這兒指"Ag85A";也以Rv3804c而聞名；Vordemeiere"/.,Immunol.112(3):461;2004;McShane"a/.，NatureMed.10(11):1240;2004)的安卡拉疫苗(MVA)組成；對照中，空白個體對MVA-Ag85A載體產生相對弱的應答((McShanea/.,2004)。此外，己有獨立的研究表明，用BCG進行初級免疫和MVA-Ag85A((Williams&InfectImmun.73(6):3814;2005)或Mtb72f亞單位疫苗(BrandtWa/.,Infect.Immun.72(11):6622;2004)進行加強免疫的實驗動物產生對結核分枝桿菌抗性的水平要大于那些單獨用BCG進行疫苗接種的。盡管這些研究不能詳細說明關聯(lián)保護(correlatesofprotection)，但明確的是異種致敏-加強免疫接種疫苗的方法可提供一種有效的手段來促進對結核分枝桿菌的抵御。因此，其目的和下列實施例是為了評價在致敏-加強免疫疫苗接種后的內體-逃出菌株AFV102。實施例中該實驗的目的是來優(yōu)化致敏-力口強免疫疫苗接種的時間間隔，其中，內體-逃出株AFV102用作初級免疫，復制缺陷型腺病毒血清型35疫苗載體(Vogels"JVirol.77(15):8263-71;2003;Barouchwa/"J.Immunol.172(10):6290;2004)用作加強型免疫，該載體在細胞巨化病毒早期啟動子(Vogels"a/.,JVirol.77(15):8263-71;2003)的控制下，引導編碼融合蛋白的由結核分枝桿菌基因Rv3804c-Rvl886-Rv0288組成的表達盒。該激發(fā)劑通過鼻內給藥，因為通過這種服藥方式，腺病毒對TB抗原的表達比通過常規(guī)的腸道服藥方式更有效(Wange"/"J.Immunol.173(10):6357;2004)。因此，10組SPF雄性Hartley豚鼠(250-300g)如圖3所示被免疫，以便評價14，18和21周的致敏-加強免疫的間隔。表3.豚鼠服藥方式研究設計<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage52<table>注意Ad35-TBS表示復制缺陷型腺病毒血清型35疫苗載體(Vogels"a/"JVirol.77(15):8263-71;2003;Baroucheetal.，J.Immunol.172(10):.6290;2004)，其在細胞巨化病毒早期啟動子(Vogels"a/.,JVirol.77(15):8263-71;2003)的控制下，引導編碼融合蛋白的由結核分枝桿菌基因Rv3804c-Rvl886-Rv0288組成的表達盒。初級免疫以O.lml10%甘油中含10、61劑量進行皮內免疫。初級免疫后的第14周，豚鼠給予由Ad35-TBS組成的激發(fā)劑，并以懸浮在10mlPBS中的109空斑形成單位(i.e.Vogels"a/.,2003;Barouch"a/.2004)的劑量進行皮內免疫。加強免疫后的第14周，用含有分枝桿菌Erdman株的氣溶膠激發(fā)動物，氣溶膠產自共含有107cfu結核分枝桿菌的lOml單細胞懸浮液；如先前說述(Brodin"fl/.,2004),這個過程將大約100個活菌傳遞到每個動物的肺部。激發(fā)后的第5周，殺死每組中的動物，獲得肺臟和脾臟來進行組織學和微生物學分析。在后者的實施例中，對豚鼠肺和脾組織進行了cfu計數(shù)。因為結核分枝桿菌Erdman株用于激發(fā)，所以在培養(yǎng)基中加入TCH來將對TCH敏感疫苗株從激發(fā)株中區(qū)分開來。該研究的結果可鑒定rBCG初級免疫和^a5-r5S加強免疫之間的最佳間隔。實施例6.免疫激發(fā)為了測定候補TB疫苗株AFV102抗結核分枝桿菌激發(fā)的效力，如表4所示的8組？(年輕的成年SPFHartley豚鼠)豚鼠(250-300g)被進行了免疫。表4:豚鼠激發(fā)研究設計<table>complextableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>注意1.n*表示初級免疫和加強免疫之間的間隔將是前述實施例中所界定的值。2.Ad35-TBS表示復制缺陷型腺病毒血清型35疫苗載體(Vogels&a/.，JVirol.77(15):8263-71;2003;Baroucheetal.，J.Immunol.172(10):6290;2004)，其在細胞巨化病毒早期啟動子(Vogels&a/.,JVirol.77(15):8263-71;2003)的控制下，引導編碼融合蛋白的由結核分枝桿菌基因Rv3804c-Rvl886-Rv0288組成的表達盒。4和5組的初級免疫以含106cfu劑量的O.lml10%的甘油進行皮內免疫。l和3組的對照小鼠僅以0.1ml10%的甘油進行皮內免疫。2組的對照小鼠給予含有106cfu的BCG丹麥1331的0.1ml10%的甘油。初級免疫后的第14周，對豚鼠進行加強免疫。在第5組中，加強免疫由AFV102組成，并以含106cfti劑量的O.lml10°/。的甘油進行皮內免疫。4和6組的加強免疫由Ad35-TBS組成，并以懸浮在IO/zlPBS中的109空斑形成單位(i.e.Vogels"2003;Ba畫he《。/2004)的劑量進行皮內免疫在最終免疫后的第14周，動物用含有結核分枝桿菌的氣溶膠進行激發(fā)，氣溶膠產自共含107cfu結核分枝桿菌的10ml單細胞懸浮液；如前所述(Brodin"a/.，2004)，這個過程將大約100個活菌傳遞到每個動物的肺部。隨后進行激發(fā)，監(jiān)控這些動物伴隨健康組為接種疫苗、為激發(fā)動物的存活情況。也監(jiān)控這些動物的體重下降和一般健康狀況。該研究的結果表明，激發(fā)后假免疫的動物迅速死亡，皮內接種BCG疫苗但沒有加強免疫的動物顯示的死亡處于一種中間平均狀態(tài)，以及用AFV102進行免疫并用Ad35-TBS進行加強免疫的動物存活的時間最長實施例7.細胞凋亡細胞凋亡是程序性細胞死亡，就其感應性和結果來說，與壞死性的細胞死亡大大不同。含有外源抗原的細胞凋亡是抗這種抗原的一種強有力的己知的細胞免疫刺激。這個抗原包被細胞的凋亡誘導有效細胞免疫的過程導致的細胞免疫某些時候被稱作交叉啟動(cross-priming)'，2，3。誘導凋亡從而導致增強型抗原特異性細胞介導的免疫有幾種機制。Caspase8介導的凋亡導致抗原特異性細胞的免疫保護4。重組BCG逃出內體，進入細胞胞質，產生Caspase8,這是一種誘導程序性細胞死亡的強大的額外方法，與此相關，重組BCG表達外源抗原，抵抗BCG，而且其它由重組BCG過表達的結核病抗原也會抵抗BCG本身的抗原，導致高水平的抗原特異性細胞免疫。以TRAIL-R2(TRAIL受體2)聞名或TNFR-SF-10B(腫瘤壞死因子-超家族成員10B)的死亡受體-5((DR-5)也介導caspase8，從而介導細胞凋亡4。呼腸弧病毒誘導的凋亡由TRAIL-DR5介導，導致隨后的病毒清除5。由重組BCG表達的DR-5逃出內體，將對抗rBCG表達的抗原的抗原特異性細胞免疫的誘導提供一種有力的輔助作用。細胞表達的抗原也會被誘導，經受穿過Fas連接的凋亡，這對抗原特異性細胞免疫應答的誘導是一種很強的刺激6。重組BCG逃出內體，表達Fas或Fas胞質域/CD4胞外域融合蛋白，這將會誘導凋亡和抗原特異性細胞免疫應答。這種由rBCG內體逃出株增強的細胞免疫或由rBCG內體逃出株產生以上所述的額外加強性的凋亡不限于BCG抗原或為rBCG過表達專門編碼的抗原，而是包括任意上述的rBCG能夠入侵的真核細胞中的抗原。例如，如果這樣的一個rBCG被輸送到誘導凋亡的腫瘤細胞，那么抗重要腫瘤抗原的細胞免疫將被誘導，導致腫瘤和/或轉移性病灶的消除、減少或預防。當考慮到局部性癥狀時，例如膀胱癌，這個抗腫瘤作用將排除由BCG產生的一般性抗腫瘤作用。在本發(fā)明的另一實施例中，具有逃出內體功能的rBCG或由凋亡介導的專一性產物加強的具有逃出內體功能的rBCG傳遞進腫瘤或其它細胞，在其中，這個rBCG也會產生外源抗原，其中將要產生的強細胞免疫應答將會誘導強細胞應答的產物抵抗那些腫瘤細胞或其它含有這些抗原的真核細胞。這些細胞應答將導致免疫介導的腫瘤細胞破滅，進而進行交叉啟動并誘導抗腫瘤或其它重要抗原的細胞免疫，隨后消除、減少或預防腫瘤和/或轉移性病灶。這種外源抗原的一個實施例是與寄主細胞HLA不同的HLA抗原，在其抵抗下，將出現(xiàn)一種很強的異種細胞應答。具有逃出內體功能的rBCG或由輸送專一性腫瘤抗原的凋亡專一性介導物通過表達而加強的具有逃出內體功能的rBCG，將誘導抗這些腫瘤抗原的強抗原特異性細胞應答，包括打破對這些抗原的耐受性，導致腫瘤和/或轉移性病灶的消除、減少或預防，而且不需要直接rBCG輸送進腫瘤細胞本身。細胞凋亡后，DNA受到破壞或caspase9誘導對一定抗原的耐受性。耐受性的誘導在控制或預防自身免疫性疾病上是重要的，例如但不限于糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、克隆氏病、腸炎和多發(fā)性硬化。通過rBCG逃出內體進入細胞，例如但不限于/3胰腺細胞、結腸直腸和神經細胞，從而產生caspase9或其它凋亡介導的耐受性誘導蛋白，這將產生有限的凋亡，從而誘導對在那些細胞中進行自身免疫的抗原耙的耐受性，因此處理或預防自身免疫病的狀況。鑒定包含在自身免疫反應里的專一性抗原，將允許誘導對這些自身免疫靶抗原的耐受性，這可通過逃出內體的rBCG產物來實現(xiàn)，該產物是這些抗原和caspase9或能夠誘導凋亡介導的耐受性的其它分子。這樣的rBCG將處理和/或預防這些自身免疫病。實施例7的參考文獻.1.Heath,W.R.,G.T.Belz，G.M.Behrens，C.M.Smith,S.P.Forehan,I.A.,Parish,G.M.Davey，N.S.Wilson,F.R.Carbone,andJ.A.Villandangos.2004.Cross-presentaion,dentriticcellsubsets,andthegenerationofimmunitytocellularantigens,/m則wo/iev199:9.2.Gallucci，S.,M.Lolkema,andP.Matzinger.1999.Naturaladjuvants:Endogenousactivatorsofdendriticcells.5z'ofec/mo/ogy.5:1249.3.Albert,M.L.,B.Sauter,andN.Bhadrdwaj.1998.DendtriticcellsacquireantigenfromapoptoticcellsandinduceclassI—restrictedCTLs.Ato^e392:864.Sheridan,J.P.，S.A.Marsters,R.M.Pitti，A.Gnmey，M.Skutbatch，D.Baldwin,L.Ramakrishnan,C.L.Gray,K.Baker,W丄Wood:A.D.Goddard,P.Godowski,andA.Ashkenazi.1997.ControlofTrailinducedapoptosisbyafamilyofsignalinganddecoyreceptors.Sc/ewce277:818.5.Clarke,P.,S.M.Meintzer,S.Gibson,C.Widmann,T.P.Garrington，G丄.Johnson,andK.L.Tyler.2000.Reovirus-inducedapoptosisismediatedbyTRAIL./.F/ro/74:8135.6.Chattergoon，M.A.,J丄Kim,J.S.Yang，T.M.Robbinson，D.J.Lee,T.Dentchev,D.M.Wilson,V.Ayyavoo,andD.B.Weiner.2000.Targetedantigendeliverytoantigen-presentingcellsincludingdendriticcellsbyengineeredFas-mediatedapoptosis.iViaZ18:974.7.Hugues,S.,E.Mougneau，W.Ferlin，D.Jeske，P.Hofman,D.Homann,L.Beaudoin，D.Schrike,M.VonHerrath,A.Lehuen，andN.Glaichenenhaus.2002.Tolerancetoisletantigensandpreventionfromdiabetesinducedbylimitedapoptosisofpancreaticbetacells,/mmwm'/^16:169.實施例8.能夠逃出內體的rBCG株中的疫苗抗原的過表達為了過表達rBCG株AFV102里的TB抗原，需將與編碼Rv3804c(也以Ag85A聞名)、Rvl886(也以Ag85B聞名)和Rv0288(也以TB10.4聞名)的序列具有功能性相關的編碼Rv3031啟動子的序列插入pAF100的尸flcI位點。由此產生的質粒，pAF105(附圖12)，隨后用限制性內切酶M/el消化，移去大腸桿菌復制子和卡那霉素抗性基因，再用T4連接酶連接成環(huán)。將該DNA(1-2g)通過電穿孔導入rBCG株AFV102。該細菌在含有25-30ml固體培養(yǎng)基(Middlebrook7H10)的8.75cm平板上培養(yǎng)。隨后通過PCR預篩選來檢測引導抗原表達質粒的菌落，一個選擇性rBCG菌落，其既是陽性的，也含有TB抗原表達盒，被指定為AFV102，并通過500ml的液體培養(yǎng)基(Middlebrook7H9)，37。C下，振蕩，擴大培養(yǎng)。一旦培養(yǎng)物進入對數(shù)晚期，在該500ml的培養(yǎng)物中加入終濃度為10。/。(v/v)的甘油，并以5ml的量分裝該種子，-80。C儲存。將BCG和rBCG培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行系列稀釋(例如，10倍步驟，0-l(T8)，然后取100ml均勻涂在含有含有25-30ml固體培養(yǎng)基(Middlebrook7H10)的8.75cm平板上，進行純化。使用質粒DNA的PCR和限制性內切酶分析來確定所需基因型存在于每個rBCG的分離物中。此外，可通過自動化脫氧核苷酸測序技術對PCR產生的DNA片斷進行測序，來確定出現(xiàn)的全長基因。為了評價分泌PfoA的AFV102和引導TB抗原表達質粒的AFV112，如上所述，兩種菌株均可生長到對數(shù)中期。收集這些培養(yǎng)物的上清并通過0.2mm的濾膜過濾，這點如前所述(Hessetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，95:5299-304;1998)。然后如上所述，評價培養(yǎng)物過濾液中蛋白的溶血活性。結果表明，AFV102和AFV112顯示了相似的溶血活性，AFV112依然保留wwC::p/^4。37Q等位基因并表達一種功能性的PfoA蛋白。最后，培養(yǎng)物上清中的蛋白可在10-15%SDS-PAGE膠上被分開，從而來評價TB抗原的表達。結果顯示了Rv3804c和Rvl886的增強性表達。因為不希望Rv0288在培養(yǎng)物上清中過表達，所以通過觀察可推斷，這個10kDa蛋白的過表達物是過表達的，其在像Rv3804c和Rvl886的相同的mRNA上表達?？傮w來講，該實施例證明，rBCG株表達PfoA和過表達TB抗原均是可能的。這樣的菌株具有用作二代TB疫苗的潛力。當詳細描述了該發(fā)明，以及對特殊實施例附有參考文獻后，那么顯然，對該技術的普通技術人員之一來講，可在不違背其主題和范圍的情況下，在其中做出各種改變和修飾。權利要求1.分枝桿菌，經遺傳工程化來包括可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白，所述蛋白在pH6-8時有活性。2.權利要求1的分枝桿菌，其中所述可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白的是產氣莢膜梭菌細胞溶素或其功能性變體。3.權利要求1的分枝桿菌，其中所述可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白的氨基酸序列由SEQIDNO.2所示。4.權利要求1的分枝桿菌，其中所述可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白由產氣莢膜梭菌細胞溶素或其突變體的特異性基因序列編碼。5.權利要求4的分枝桿菌，其中所述的基因序列選自SEQIDNO.1和SEQIDN0.3。6.權利要求l的分枝桿菌，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子。7.權利要求6的分枝桿菌，其中所述的細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子選自caspase8，死亡受體-5，F(xiàn)as和Fas胞質結構域/CD4外結構域融合蛋白。8.權利要求1的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達目的基因。9.權利要求1的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子；以及目的基因。10.分枝桿菌，經遺傳工程化來包括可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白，其在由所述分枝桿菌感染的細胞內體所呈現(xiàn)的pH下有活性。11.權利要求10的分枝桿菌，其中所述可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白是產氣莢膜梭菌細胞溶素或其功能性變體。12.權利要求10的分枝桿菌，其中所述可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白的氨基酸序列由SEQIDNO.2所示。13.權利要求IO的分枝桿菌，其中所述可表達并可分泌的功能性溶內體蛋白由產氣莢膜梭菌細胞溶素或其突變體的特異性基因序列編碼。14.權利要求13的分枝桿菌，其中所述基因序列選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.3。15.權利要求10的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌是BCG。16.權利要求10的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌經遺傳工程化來表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子。17.權利要求16的分枝桿菌，其中所述的細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子選自caspase8，死亡受體-5,Fas禾BFas胞質結構域/CD4外結構域融合蛋白。18.權利要求10的分枝桿菌，所述分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達目的基因。19.權利要求10的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子；以及目的基因。20.能使分枝桿菌從內體中逃出的方法，包括如下步驟對所述分枝桿菌進行遺傳工程化來包括，表達和分泌功能性溶內體蛋白。21.權利要求20的方法，其中所述的功能性溶內體蛋白是產氣莢膜梭菌細胞溶素0或其突變體。22.權利要求21的方法，其中所述的功能性溶內體蛋白是由SEQIDNO:3編碼的突變體產氣莢膜梭菌細胞溶素O。23.權利要求20的方法，其中所述的分枝桿菌是減毒的分枝桿菌。24.權利要求23的方法，其中所述的減毒分枝桿菌是BCG。25.權利要求20的方法，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子。26.權利要求25的方法，其中所述的細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子選自caspase8，死亡受體-5,Fas和Fas胞質結構域/CD4外結構域融合蛋白。27.權利要求20的方法，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達目的基因。28.權利要求20的方法，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子；以及目的基因。29.疫苗制劑，含有經遺傳工程化來表達和分泌功能性溶內體蛋白的分枝桿菌，其中所述的功能性溶內體蛋白在中性pH時有活性。30.權利要求29的疫苗制劑，其中所述的功能性溶內體蛋白是產氣莢膜梭菌細胞溶素O。31.權利要求30的疫苗制劑，其中所述的功能性溶內體蛋白是由SEQIDNO:3編碼的突變體產氣莢膜梭菌細胞溶素O。32.權利要求29的疫苗制劑，其中由所述分枝桿菌表達的所述功能性溶內體蛋白的表達使所述的重組分枝桿菌從內體中逃出。33.權利要求29的疫苗制劑，其中所述的分枝桿菌是減毒的分枝桿菌。34.權利要求33的疫苗制劑，其中所述減毒的分枝桿菌是BCG。35.權利要求29的疫苗制劑，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子。36.權利要求35的疫苗制劑，其中所述的細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子選自caspase8,死亡受體-5，F(xiàn)as和Fas胞質結構域/CD4外結構域融合蛋白。37.權利要求29的疫苗制劑，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來功能性表達目的基因。38.權利要求29的疫苗制劑，其中所述的分枝桿菌經遺傳工程化來功能性地表達細胞凋亡蛋白或細胞凋亡的功能性增強子；以及目的基因。全文摘要本申請?zhí)峁┝司哂性鰪姷囊鸾M織相容性-I型-限制性CD8⁺T細胞免疫應答能力的分枝桿菌菌株。該分枝桿菌菌株經過遺傳工程化來表達在中性pH下具有活性的溶內體蛋白(例如，產氣莢膜梭菌細胞溶素O)，允許分枝桿菌從內體中逃出到細胞胞質中。本發(fā)明還提供了含有分枝桿菌菌株的疫苗制劑。文檔編號A61K48/00GK101198358SQ200580041438公開日2008年6月11日申請日期2005年11月23日優(yōu)先權日2004年12月1日發(fā)明者大衛(wèi)·邁克爾·霍恩,孫榮改,杰拉爾德·C·薩多夫申請人:Aeras全球Tb疫苗基金會