越南槐內(nèi)生細(xì)菌b29在防治三七黑斑病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29在防治三七黑斑病 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對植物病害的防治過度依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用，大量化學(xué)農(nóng)藥的施放不 僅對生態(tài)環(huán)境具有長期的破壞作用，也引起農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，農(nóng)藥殘留超標(biāo)、病原菌的耐藥 性以及對人畜有害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義，利用 生物的方法來防治植物病害可以有效解決上述問題。
[0003] 三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不換等，具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效，是一種中國傳統(tǒng)名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來，對三七原材料的需求日益增長。但是栽培過程中的真菌病 害嚴(yán)重影響了三七生長。目前，在三七種植上，防治真菌病害過度依賴化學(xué)農(nóng)藥，大量化學(xué) 農(nóng)藥的使用不僅影響了三七的品質(zhì)，也造成了三七藥材的大量農(nóng)藥殘留。
[0004] 三七黑斑病能侵染三七植株和地下根系，以莖、葉、花軸受害較重，根部感染后呈 褐色濕腐狀，四季均可發(fā)生，三七園棚內(nèi)溫度高、濕度大，施肥不當(dāng)都有可能使病害蔓延加 重，一般常年發(fā)病率在5%-20%之間，嚴(yán)重時高達(dá)60%以上。其癥狀大都由三七黑斑病菌 AlternariapanaxWhetzel(簡稱A.panax)危害所致。
[0005]這個真菌病害是造成多年來三七產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降的主要原因之一。在廣西三 七的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時發(fā)生的，造成 了三七的大量減產(chǎn)甚至絕收，給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了控制這個真菌病害，大 量的化學(xué)農(nóng)藥被使用，造成了三七產(chǎn)品的大量農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重的污染了環(huán)境，大大的威脅了 人們的健康。因此，開展生物防治三七真菌病害對三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是非常迫切和必 要的。為此篩選出能同時拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義，篩選進(jìn)而開發(fā)利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧┲弧?br>[0006]公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29在防治三七黑斑病中的應(yīng)用，從 而能有效的防治三七種植過程中出現(xiàn)的三七黑斑病，從而提高三七的產(chǎn)量以及質(zhì)量。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0009] -種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29,越南槐內(nèi)生菌B29的分類命名為伯克霍爾德氏菌 (Burkholderiasp.)B29,菌株的16SrDNA基因序列表如SEQIDN0.1所述，保藏單位：中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2015年05月13日，保藏號:CGMCCNo. 10807。
[0010]優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29代謝產(chǎn)物的制備方法為：將越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29接種于NB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為130r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天，所得 發(fā)酵物超聲40min，然后用乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮得到菌株發(fā)酵物 的乙酸乙酯粗提物，即為越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29代謝產(chǎn)物。
[0011]優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29接種于含1000mlNB液體培養(yǎng)基。
[00?2]優(yōu)選的是，所述的NB液體培養(yǎng)基含牛肉浸膏3g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，鹿糖10g，培 養(yǎng)基pH值為7.0。
[0013]如上述制備所得越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29的代謝產(chǎn)物在防治三七黑斑病中的應(yīng)用。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0015]本發(fā)明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內(nèi)生細(xì)菌(Burkholderia sp.)B29,該菌對三七黑斑病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，為三七真菌病害的生物防治領(lǐng)域帶來 廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29與三七黑斑病的平板對峙培養(yǎng)，其中F為三七黑 斑病菌(AlternariapanaxWhetzel)，a為空白對照，b為實驗組。
[0017]圖2是本發(fā)明越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29菌株形態(tài)特征，其中，al為菌落形態(tài)，b1為菌體形 ??τ〇
[0018]圖3為越南槐內(nèi)生細(xì)菌Β29菌株基于16SrDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0019]圖4是根據(jù)本發(fā)明菌株越南槐內(nèi)生細(xì)菌B29的代謝產(chǎn)物對三七黑斑病菌的菌絲生 長的抑制效果;其中第1、第5個為空白對照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個為陽性對照 多菌靈粉劑;第6、第7、第8為菌株B29的代謝產(chǎn)物，且濃度分別為2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml;L 為三七黑斑病菌AlternariapanaxWhetz〇
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體 實施方式的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施 例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。乙酸乙酯為市購分析純 乙酸乙酯。2XTagMasterMix購自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由華 大基因合成。
[0021] 實施例1
[0022]菌株的分離、篩選及鑒定 [0023] 一、菌株的分離
[0024]供試材料:采自廣西天等縣石灰?guī)r地區(qū)的野生越南槐。
[0025]供試菌株:由廣西大學(xué)植物病理研究所提供。
[0026]培養(yǎng)基：1000mlNA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，鹿糖10g，瓊脂15g，pH7.0〇
[0027] 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，移到超凈工作臺，在無菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無菌水洗3次，無菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?br>[0028]菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根，無菌條件下，用無菌木片刮去表皮，用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質(zhì)部和韌皮部，分 別取0.5cm長的組織塊，用無菌枝剪剪碎并加無菌水研磨，研磨充分后加無菌水定容至5ml 并靜置lOmin，取0.5ml上清液梯度稀釋10~105倍，分別取100yL稀釋液涂布到ΝΑ平板上，每 個稀釋濃度重復(fù)3次，取最后一次漂洗液涂布在ΝΑ平板上，作為陰性對照。ΝΑ平板置于培養(yǎng) 箱28°C恒溫培養(yǎng)24~96h，挑取不同形態(tài)菌落反復(fù)劃線純化，將純化的菌株即越南槐內(nèi)生細(xì) 菌用20 %甘油保存。
[0029]將分離到的越南槐內(nèi)生細(xì)菌接種于LA平板上，28°C下培養(yǎng)24h后待用。將三七黑斑 病菌接種于PDA平板，28°C下培養(yǎng)3天后待用。
[0030]二、篩選
[0031]采用平板對峙法對供試越南槐內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行菌體抑菌活性的初篩。
[0032] 首先，無菌條件下，用滅菌打孔器將三七黑斑病菌制成6mm菌餅;在處理組中，將三 七黑斑病菌菌餅轉(zhuǎn)接到含NA的培養(yǎng)皿中央，然后在距離菌餅2cm的位置，將分離到的越南槐 內(nèi)生細(xì)菌菌株接上一條細(xì)菌線，每株內(nèi)生細(xì)菌重復(fù)3皿;在對照組中，只接三七黑斑病菌菌 餅，不接越南槐內(nèi)生細(xì)菌，重復(fù)3皿。然后，在28°C下培養(yǎng)，定期觀測。待對照組中真菌長滿培 養(yǎng)皿時，在處理組中，測量三七黑斑病菌菌餅中心到越南槐內(nèi)生細(xì)菌線中心之間三七黑斑 病菌的生長半徑為處理生長半徑;在對照組中，三七黑斑病菌的生長半徑為對照生長半徑。 最后，根據(jù)以下公式，計算抑菌率：
[0033]對照生長量=對照生長半徑-菌餅半徑[0034]處理生長量=處理生長半徑-菌餅半徑
[0036]結(jié)果共得到3株對三七黑斑病菌抑制作用都很強(qiáng)的拮抗越南槐內(nèi)生細(xì)菌菌株，其 中一株名稱為B29,對三七黑斑病菌的抑制率為57 %。
[0037]三、鑒定
[0038](一）菌株形態(tài)特征
[0039]菌落形態(tài)特征觀察:將待鑒定的菌株接種在NA培養(yǎng)基上，置于28°C培養(yǎng)24h，觀察 菌株的菌落形態(tài)特征。
[0040]菌體形態(tài)特征觀察:取上述在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h的菌株進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢， 將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相，如圖2所示。
[0041](二)菌株16S rDNA序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析
[0042] DNA模板的制備：
[0043]試劑：（1)裂解緩沖液：Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDSl%(w/ v)；
[0044] (2)5MNaCl溶液。
[0045] DNA提?。?br>[0046] (a)將1.5ml細(xì)菌過夜培養(yǎng)液培養(yǎng)物置于微量離心管（EP管）內(nèi)，12000rpm離心 0.5min，棄去上清液，保留沉淀物；
[0047] (b)在沉淀物中加入400μ1裂解緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸；
[0048] (c)加入200ul5ΜNaCl，充分混勻，12000rpm離心lOmin，取600μ1 上清液；
[0049] (d)加入等體積的酚/氯仿（1:1)，混勻，離心（12000rpm，10min)，將上清液轉(zhuǎn)入另 一干凈的EP管中；
[0050] (e)向步驟(d)中獲得的上清液中加入等體積氯仿，混勻，離心（12000rpm，lOmin)， 將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的EP管中；
[0051] (f)向步驟(e)中所得上清液中加入等體積的異丙醇，混勻，置于室溫lOmin，離心 (12000rpm，15min)，棄去上清液，保留沉淀物；
[0052] (g)用體積濃度為70%乙醇洗滌步驟(f)所得沉淀物，晾干，即為DNA;
[0053] (h)將步驟(g)中已干的DNA溶于30μ1雙蒸水(ddH20)中，-20°C保存。
[0054]PCR擴(kuò)增16S rDNA序列：
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