CR反應(yīng)體系如下：
[0090] 組分體積（μ1)
[0091 ]模板DNA5μ1 ;
[0092] 10XBuffer5μ1;
[0093]dNTP(25mmol/L) 4μ1；
[0094]Padh-1(20μmol/L) 1μ1 ;
[0095]Padh-2 (20μmol/L) 1μ1 ;
[0096]PfuDNA聚合酶（5U/μ1) 1μ1 ;
[0097]ddH2033μ1 ；
[0098]PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C30秒s，56°C20秒，72°C30秒，26個循 環(huán)后72°C10分鐘。
[0099] 將乙醛脫氫酶啟動子Paldh序列和質(zhì)粒pBBRlMCS-4(KovachΜE,ElzerP H,StevenHillD,etal.Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloning vectorpBBRIMCS,carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes. Gene, 1995, 166(1) :175-176)分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和SpeI處理（37°C，4 小時）， 利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）分別回收目的片段，將 酶切后的質(zhì)粒和乙醛脫氫酶啟動子Paldh序列按1:3 (物質(zhì)的量之比）的比例進(jìn)行連接反 應(yīng)（16°C，12小時）；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒PBBR-Paldh。
[0100] (2)重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的構(gòu)建
[0101] 以AcetobacterpasteurianusCGMCC3089 基因組為模板，利用引物ATPase-1 和 ATPase-2進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得ATP酶序列，PCR反應(yīng)體系如下：
[0102] 組分體積（μ1)
[0103]模板DNA5μ1 ;
[0104]lOXBuffer5μ1 ；
[0105]dNTP(25mmol/L) 4μ1；
[0106]pqq_l(20μmol/L) 1μ1 ;
[0107] pqq_2 (20μmol/L) 1μ1 ;
[0108]PfuDNA聚合酶（5U/μ1) 1μ1 ;
[0109]ddΗ2033μ1 ；
[0110] PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C30秒s，54°C20秒，72°C3分鐘，26個 循環(huán)后72°C10分鐘。
[0111] 將獲得ATP酶序列和質(zhì)粒pBBR-Paldh分別用限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI處理 (37°C，4小時），利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）分別回 收目的片段，將酶切后的質(zhì)粒和ATPase序列按1:3 (物質(zhì)的量之比）的比例進(jìn)行連接反應(yīng) (16°C，12小時）；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase。
[0112] (3)重組表達(dá)ATP酶的巴氏醋桿菌基因工程菌的獲得
[0113]①AcetobacterpasteurianusCGMCC3089 感受態(tài)細(xì)胞的制備：
[0114]挑取AcetobacterpasteurianusCGMCC3089 接種于YPG培養(yǎng)基中，30°C、220 轉(zhuǎn) /分鐘預(yù)培養(yǎng)12小時，至0D550約0. 6,取lmL預(yù)培養(yǎng)的菌液接入裝有l(wèi)OOmLYPG培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，30°C、220轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)8h，至0D600約0. 6 ;將裝有菌液的三角瓶置于冰 浴上冷卻20分鐘，4°C下5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；加80mL預(yù)冷至0°C的10%甘 油（質(zhì)量比）溶液重懸菌體，使菌體充分?jǐn)U散后于4°C下5000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，棄上 清；加3mL預(yù)冷的10%甘油溶液搖勾，置于冰浴中，獲得AcetobacterpasteurianusCGMCC 3089感受態(tài)細(xì)胞。
[0115] ②質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的電激轉(zhuǎn)化
[0116]取 100μLAcetobacterpasteurianusCGMCC3089 感受態(tài)細(xì)胞于小離心管中， 加入10μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase，混合均勻后加入到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi) 冰浴3分鐘；打開電脈沖儀，按設(shè)定的轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行電激（2.OkV);向電脈沖杯內(nèi)迅速加入 lmL預(yù)冷的無菌YPG培養(yǎng)基，混勻后，轉(zhuǎn)入試管中，30°C緩慢振蕩培養(yǎng)2小時后，涂布到加有 適當(dāng)抗生素的選擇平板上，30°C倒置培養(yǎng)48小時，獲得含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase 的AcetobacterpasteurianusCGMCC3089 基因工程菌。
[0117] (4)然后利用含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacterpasteurianus CGMCC3089基因工程菌和原始菌株醋酸發(fā)酵比較：
[0118]a.制備種子液：分別從斜面取含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter pasteurianusCGMCC3089 基因工程菌和AcetobacterpasteurianusCGMCC3089 原始菌 接種于種子培養(yǎng)基中，在30°C，160轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時。按10% (v/v)的接 種量轉(zhuǎn)接入新鮮的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行放大培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖20g/L，酵母膏 15g/L，乙醇3. 5% (v/v)，其余為水。
[0119] b.醋酸發(fā)酵：按10%的接種量，將種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在 30°C條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵；發(fā)酵培養(yǎng)基分為兩組；第一組發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖20g/L， 酵母膏15g/L，乙醇8% (v/v)，醋酸10g/L，MgS042g/L，CaCl23g/L，其余為水；第二組培養(yǎng)基 為含有8 % (v/v)乙醇的蘋果酒。然后在30°C，通風(fēng)量1 : 0.15 (v/v)/min條件下發(fā)酵生 產(chǎn)醋酸，并每5h測試一次醋酸濃度，具體結(jié)果參見圖1-圖2。
[0120] 實(shí)施例2
[0121]利用含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCCl. 1809基因 工程菌發(fā)酵生產(chǎn)醋酸
[0122] (1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0123]①Acetobacter acetiCGMCCl.1809 感受態(tài)細(xì)胞的制備：
[0124] 挑取AcetobacteracetiCGMCCl. 1809 接種于YPG培養(yǎng)基中，30°C、220 轉(zhuǎn) / 分鐘 預(yù)培養(yǎng)12小時，至0D550約0. 6,取lmL預(yù)培養(yǎng)的菌液接入裝有100mLYPG培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，30°C、220轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)8h，至0D600約0. 6 ;將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷 卻20分鐘，4°C下5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；加80mL預(yù)冷至0°C的10 %甘油（質(zhì) 量比）溶液重懸菌體，使菌體充分?jǐn)U散后于4°C下5000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，棄上清；加 3mL預(yù)冷的10%甘油溶液搖勻，置于冰浴中，獲得AcetobacteracetiCGMCCl. 1809感受態(tài) 細(xì)胞。
[0125] ②質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的電激轉(zhuǎn)化
[0126]取 100μLAcetobacter acetiCGMCCl.1809感受態(tài)細(xì)胞于小離心管中，加入 10μL 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase，混合均勻后加入到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴3分鐘； 打開電脈沖儀，按設(shè)定的轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行電激（2.OkV);向電脈沖杯內(nèi)迅速加入lmL預(yù)冷的無 菌YPG培養(yǎng)基，混勻后，轉(zhuǎn)入試管中，30°C緩慢振蕩培養(yǎng)2小時后，涂布到加有適當(dāng)抗生素的 選擇平板上，30°C倒置培養(yǎng)48小時，獲得含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCCl. 1809 基因工程菌。
[0127] (2)制備種子液
[0128] 分別從斜面取含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCCl. 1809基因工程菌和AcetobacteracetiCGMCCl. 1809原始菌接種于種子培養(yǎng) 基中，在30°C，160轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時。按10% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮 的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行放大培養(yǎng)。
[0129]種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇3. 5%(v/v)，其余為水。
[0130] (2)醋酸發(fā)酵
[0131] 按10%的接種量，將種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在30°C條件下進(jìn) 行醋酸發(fā)酵。
[0132] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇8% (v/v)，醋酸10g/L， MgS042g/L，CaCl23g/L，其余為水。
[0133]利用含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的AcetobacteracetiCGMCCl. 1809 基因 工程菌在30°C，通風(fēng)量1 : 0. 15(v/v)/min條件下