一種穿膜多肽與抗腫瘤藥偶聯(lián)物的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤相關(guān)的藥物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種多肽與抗腫瘤藥偶 聯(lián)形成一種新藥物，該多肽本身不具有生理活性，但是具有透過血腦屏障的作用，本發(fā)明還 涉及該多肽的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦瘤及腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)病率逐年上升。在對其治療方面，血腦屏障被認(rèn)為是阻止化 療藥物進(jìn)入腦組織進(jìn)而影響療效的主要原因。血腦屏障是機(jī)體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之 一，由介于血循環(huán)與腦實(shí)質(zhì)間的軟腦膜、脈絡(luò)叢的腦毛細(xì)血管壁和包于壁外的膠質(zhì)膜所組 成，能阻擋病原生物和其他大分子物質(zhì)由血循環(huán)進(jìn)入腦組織和腦室。基本上100%的大分子 藥物，包括多肽、重組蛋白、單克隆抗體、基于RNA干擾技術(shù)的藥物、基因治療相關(guān)藥物等都 無法穿越血腦屏障，且大于98 %的小分子藥物也無法穿過血腦屏障。目前，放射性治療與 化學(xué)療法只能延長患者生命4個(gè)月，因此本發(fā)明致力于研究使現(xiàn)有藥物更好的透過血腦屏 障。
[0003]多肽由于其具有極性末端和非極性末端，因此在體內(nèi)有較高的利用度，由于本身 是內(nèi)源性物質(zhì)所以毒性小，但是多肽直接作為藥物受到較大的限制，例如其穩(wěn)定性差，不能 口服。近年來，多肽作為藥物輔助功能的應(yīng)用逐漸成為了新藥研制的熱點(diǎn)之一。細(xì)胞穿膜肽 是20世紀(jì)中期開始認(rèn)識(shí)到的一類具特殊功能的多肽分子，英文學(xué)術(shù)名稱一般寫為cell2-p enetrating-peptides(CPPs)。它們通常由5~30個(gè)氨基酸組成，典型的一般由8~16個(gè)氨 基酸構(gòu)成，具有生物膜穿透功能，還可攜帶其它分子甚至超分子顆粒進(jìn)入細(xì)胞中。正是因?yàn)?這種特殊的功能，它們被看作生物活性分子有效的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)工具，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0004] 近些年來多肽和藥物通過共價(jià)方式形成組合物的例子很多，例如：多肽 Penetratin和阿霉素共價(jià)耦合用于治療乳腺癌；多肽TAT和藥物P53共價(jià)耦合用于治療眼 癌轉(zhuǎn)移；多肽YTA4與甲氨蝶呤共價(jià)耦合治療乳腺癌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述：
[0006] (1)本發(fā)明所述的穿膜肽
[0007] 本發(fā)明所述的細(xì)胞穿膜肽，由13個(gè)氨基酸組成，而且是親水性和疏水性交替組合 的，氨基酸序列為：SEQIDN0 :1。
[0008] (2)本發(fā)明所述的穿膜肽的制備方法
[0009] 本發(fā)明所需多肽是采用固相的方法制備的，固相合成是以固相載體樹脂為載體， 從C端即羧基端向N端即氨基端逐漸添加氨基酸的過程。
[0010] 本發(fā)明中優(yōu)選樹脂：Fmoc-wang樹脂、2-cl-trt樹脂，樹脂取代度0. 24~0. 4。
[0011] 本發(fā)明所使用的保護(hù)氨基酸為：Fmoc-Arg(pbf)-〇H，F(xiàn)moc-Gly-〇H，F(xiàn)moc-Val-〇H， Fmoc-Trp-〇H，反應(yīng)過程中保護(hù)氨基酸3~5倍過量。
[0012] 本發(fā)明所使用的脫保護(hù)試劑為：哌啶/N，N_二甲基甲酰胺，比例為10:90~ 30:70。
[0013] 本發(fā)明所使用的偶聯(lián)試劑為：①苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν'-四甲基脲六氟磷酸鹽 /1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑）-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯 /1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，③Ν，Ν' -二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)。
[0014] 本發(fā)明中，若使用第①或者第②種偶聯(lián)試劑，那么反應(yīng)中過程中應(yīng)添加縛酸劑： DIEA/NMPo
[0015] 本發(fā)明中所使用的切割試劑為：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比例 為：82· 5:5:5:5:2. 5〇
[0016] 本發(fā)明中所使用MS-IT-T0F確定分子量，使用HPLC純化粗肽。
[0017] (3)本發(fā)明所述多肽與抗腫瘤藥物阿霉素的連接方法
[0018]
[0019] 首先阿霉素與酸酐反應(yīng)，在阿霉素分子上構(gòu)建羧基；再將多肽片段的末端氨基與 上述分子上的羧基反應(yīng)，生成偶聯(lián)物；最后分離純化偶聯(lián)物。
[0020] (4)本發(fā)明所述多肽與抗腫瘤藥物紫杉醇的連接方法
[0021]
[0022] 首先紫杉醇與酸酐反應(yīng)，在紫杉醇分子上構(gòu)建羧基；再將多肽片段的末端氨基與 上述分子上的羧基反應(yīng)，生成偶聯(lián)物；最后分離純化偶聯(lián)物。
【附圖說明】
[0023] 附圖1:革巴向肽的液相純度譜圖
[0024] 附圖2:靶向肽的液相純度譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0027] 實(shí)施例1:多肽的固相合成
[0028] 使用Fmoc策略的固相多肽合成方法（使用的氨基酸購自上海吉爾公司），使用 CEM公司生產(chǎn)的Liberitity型儀器進(jìn)行本發(fā)明的穿膜多肽的合成。操作方法按照生產(chǎn)商的 儀器說明書進(jìn)行。
[0029] 合成所用試劑選擇：
[0030] (1)載體樹脂：Fmoc-Arg(pbf)-wang-rink，替代度：0· 33〇
[0031] (2)所選用的保護(hù)氨基酸：Fmoc_Arg(pbf)-〇H，F(xiàn)moc-Gly-〇H，F(xiàn)moc-Val-OH， Fmoc-Trp-〇H，反應(yīng)中所用保護(hù)氨基酸5倍過量。
[0032] (3)本發(fā)明所使用的脫保護(hù)試劑為：哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，比例為20:80。
[0033] (4)本發(fā)明所使用的偶聯(lián)試劑為：Ν，Ν'-二異丙基碳二亞胺（DIO/1-羥基苯并三 唑（Η0ΒΤ)。
[0034] (5)本發(fā)明中所使用的切割試劑為：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比 例為：82. 5:5:5:5:2. 5。
[0035] 將制得的多肽使用HPLCC18半制備柱（購自Phenomenex公司）進(jìn)行純化，檢測 條件為：檢測波長：214nm，流動(dòng)相A:乙腈（含0. 1 %三氟乙酸），流動(dòng)相B:水（含0. 1 %三 氟乙酸），洗脫條件：30分鐘內(nèi)由35 %A~50 %A，利用MS-IT-T0F確定所得純品分子量， 用HPLC確定樣品純度（液相純度譜圖見附圖1)，純度大于95%經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多 肽凍干粉。
[0036] 實(shí)施例2:腦靶向肽與抗腫瘤藥物阿霍素的偶聯(lián)物
[0037] 化合物II的合成
[0038] 50m反應(yīng)瓶中加入L0g(1.72mmol)阿霉素，0.52g(5.20mmol) 丁二酸酐，30mlTHF， 滴加0. 66g(5. 12mmol)N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，27°