，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性。
[0039]3.2.1.3將樹脂濾干，用0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)反復平衡到pH7.5后，用緩沖液浸沒，待用；
3.2.1.4將上述平衡好的樹脂裝入柱內，柱裝好后，再用0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液走柱，以流出液的pH近7.5為標準。
[0040]3.2.2 上樣
3.2.2.1將協(xié)和干粉按1:100倍比例溶解于0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液中攪拌溶解；
3.2.2.2 上樣，流速控制在50-60ml/min。
[0041]3.2.3 洗滌
上樣結束后，用0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液洗滌至流出液0D值在0.25以下，流速控制在60 ml/min左右。
[0042]3.2.4 洗脫
用0.2M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗脫，流速控制在70ml/min左右，洗脫至流出0D值在0.35以上，滴加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到0D值在0.35以下，停止收集流出液。
[0043]3.2.5 沉淀
計量流出收集液體積，轉入桶內，加入5倍量(V/V) 95%乙醇，攪拌均勻，然后靜置。
[0044]3.2.6 干燥
3.2.6.1棄去桶內的上清液，沉淀物離心，棄去上清液；
3.2.6.2沉淀物用適量的無水乙醇脫水，離心棄去上清液，重復二次；
3.2.6.3最后，將沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG精品0.9g。
[0045]4、注射級HMG提取
4.1取精品HMG加入22.5ml純化水，攪拌溶解。
[0046]4.2溶解液加22.5ml乙醇，再加8%的醋酸銨溶液3.6ml，攪拌充分
4.3在不斷攪拌下分別加入11ml的0.2M磷酸鈉溶液，11ml的0.3M醋酸鈣溶液。
[0047]4.4用5M氫氧化鈉溶液調pH至8.5，攪拌2小時，離心取上清液。
[0048]4.5上清液用5M鹽酸調pH至6.5-7.0，加280ml95%乙醇，靜置，離心棄去上清液，沉淀物用無水乙醇洗滌，再離心棄去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得注射級HMG
0.85g0
[0049]照《中國藥典》二部，2010，第378頁，尿促性素質量標準，產品符合要求。照附錄XI E, XII Μ 測得 LSH, LH 效價分別為 584iu/mg 和 548iu/mg，HMG 效價達到 500iu/mg 以上。
[0050]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。
【主權項】
1.一種高效價尿促性素(HMG)的提取及純化方法，其特征在于:絕經(jīng)期婦女尿經(jīng)高嶺土和硅藻土提取制得HMG粗品后，再用醋酸銨提取HMG中間體，經(jīng)協(xié)和樹脂吸附和柱層析制得高純度的精品HMG，經(jīng)無菌無熱原的處理制得醫(yī)用的注射用HMG原料。2.根據(jù)權利要求1所述的HMG制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 一、粗品提取 1.1吸附:投入絕經(jīng)期婦女尿，加入高嶺土和硅藻土，調節(jié)PH，攪拌靜置，離心取吸附物； 1.2脫附:在干吸附物中加配好的洗脫液適量，調節(jié)pH，攪拌，離心取上清液； 1.3干燥:調節(jié)上清液pH，加乙醇，攪拌均勻，靜置沉淀，將沉淀物干燥得粗品； 二、HMG中間體提取 2.1將粗品投入到乙酸銨提取液中，低溫攪拌，離心取上清液； 2.2上清液加入乙醇，攪拌，靜置，離心棄去上清液； 2.3沉淀物加適量乙醇脫水，再離心棄去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中間體； 三、HMG精品提取 3.1協(xié)和工序 3.1.1吸附 將HMG中間體用醋酸鈉緩沖液低溫溶解，離心取上清液；上清液加協(xié)和樹脂攪拌，離心棄去上清液；樹脂用醋酸鈉緩沖液反復洗滌，至280nm0D值小于0.25為止； 3.1.2洗脫，吸附好的樹脂柱加洗脫液洗脫，流出液加乙醇，靜置，離心取沉淀物，沉淀物反復脫水離心，再干燥的協(xié)和干粉； 3.2 DEAE-Cellulose 柱層析工序 3.2.1 DEAE-Cellulose 樹脂處理 3.2.1.1將柱中的DEAE-Cellulose樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，純化水浸沒靜置； 3.2.1.2 將DEAE-Cellulose樹脂濾干，用少量純化水洗滌，濾干后，裝入桶中，用0.5M HC1浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再分別用0.5M NaOH浸泡，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性； 3.2.1.3將樹脂濾干，用0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)反復平衡到pH7.5后，用緩沖液浸沒，待用； 3.2.1.4將上述平衡好的樹脂裝入柱內，柱裝好后，再用0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液走柱，以流出液的pH近7.5為標準； 3.2.2上樣 3.2.2.1將協(xié)和干粉按1:100倍比例溶解于0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液中攪拌溶解； 3.2.2.2 上樣，流速控制在50-60ml/min ； 3.2.3洗滌 上樣結束后，用0.05M Tris-HCl (pH7.5)緩沖液洗滌至流出液0D值在0.25以下，流速控制在60 ml/min左右； 3.2.4洗脫 用0.2M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗脫，流速控制在70ml/min左右，洗脫至流出OD值在0.35以上，滴加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到OD值在0.35以下，停止收集流出液； 3.2.5沉淀 計量流出收集液體積，轉入桶內，加入5倍量(V/V)95%乙醇，攪拌均勻，然后靜置12h ;3.2.6干燥 3.2.6.1棄去桶內的上清液，沉淀物離心，棄去上清液； 3.2.6.2沉淀物用適量的無水乙醇脫水，離心棄去上清液，重復二次； 3.2.6.3最后，將沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG精品； 四、注射級HMG提取 4.1取精品HMG加入25倍量(ml)純化水，攪拌溶解； 4.2溶解液加等體積乙醇，再加總體積8%的醋酸銨溶液，攪拌充分； 4.3在不斷攪拌下分別加入精品HMG12倍的0.2M磷酸鈉溶液，純品HMG12倍的0.3M醋酸鈣溶液； 4.4用5M氫氧化鈉溶液調pH至8.5，攪拌2小時，離心取上清液； 4.5上清液用5M鹽酸調pH至6.5-7.0，加10倍量95%乙醇，靜置，離心棄去上清液，沉淀物用無水乙醇洗滌，再離心棄去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得注射級HMG。3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(1.1)中，吸附，按尿量:高嶺土:硅藻土 =100:0.06:0.02比例投料;調尿液pH至3.8-4.8，加高嶺土攪拌2小時，靜置，離心取干吸附物。4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(1.2)脫附，洗脫液配比為尿液:水:氨水=1000:15:1.5 ;在干吸附物中加洗脫液適量，調pH至9-11，攪拌2小時，離心取上清液；上清液用醋酸調PH5.5，加2倍量乙醇，攪拌均勻，靜置沉淀，將沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品。5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(二沖將粗品慢慢投入1:30比例的乙酸銨提取液中，在低溫下攪拌2小時，離心取上清液；上清液加3倍量95%乙醇，攪拌2小時靜置，離心棄去上清液。6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(3.1)中將HMG中間體用100倍量醋酸鈉緩沖液在低溫下溶解，離心取上清液；上清液加10倍量協(xié)和樹脂攪拌2小時，離心棄去上清液；樹脂用醋酸鈉緩沖液反復洗滌，至280nm0D值小于0.25為止。7.如權利要求1?6所述的方法，其特征在于:提取純化所得HMG效價高達500iu/mg。8.—種藥物組合物，其含有根據(jù)權利要求1-7制備的尿促性素作為活性成分，還含有乙醇。
【專利摘要】本發(fā)明為一種高效價尿促性素（HMG）的提取及純化方法，尿促性素是一種存在于絕經(jīng)期婦女尿液中的促性腺激素，通常采用傳統(tǒng)的高嶺土提取工藝制得HMG粗品。與已有的HMG提取分離方法相比，本發(fā)明的純化方法獲得的HMG具有更高的效價（>500iu/mg）。其特征在于采用醋酸銨提取HMG中間體，經(jīng)協(xié)和樹脂吸附和柱層析制得高純度的精品HMG，經(jīng)無菌無熱原的處理制得醫(yī)用的注射用HMG原料。
【IPC分類】C07K1/14, C07K14/59, A61P15/08, A61K38/24
【公開號】CN105399813
【申請?zhí)枴緾N201510832517
【發(fā)明人】劉乃山, 劉君, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月26日