一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積的方法及其專用試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積 的方法及其專用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬為六畜之首，養(yǎng)豬業(yè)在世界尤其是中國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。豬肉在諸多 肉類產(chǎn)品中的比重一直保持在Ξ分之一左右，是人們比較喜愛的副食之一。人們的生活不 斷改善，傳統(tǒng)的養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)不能滿足人們對(duì)豬肉的需求量。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)的發(fā)展，豬 的生產(chǎn)性能顯著提高，豬的健康養(yǎng)殖和育肥就顯得格外重要。
[0003] 豬背腰厚和眼肌面積與豬瘦肉率直接相關(guān)，是豬的遺傳育種和性能鑒定上的重要 指標(biāo)參數(shù)，豬的眼肌面積越大，瘦肉率越高。遺傳力是數(shù)量性狀的重要參數(shù)，根據(jù)遺傳力的 大小，可W預(yù)測(cè)遺傳進(jìn)展，個(gè)體育種值。因此，如何增加眼肌面積和提高瘦肉率，并提前做出 判斷，是每個(gè)豬場(chǎng)經(jīng)營(yíng)者及育種學(xué)家追求的目標(biāo)。
[0004] 近十年來(lái)，分子生物技術(shù)的發(fā)展為豬的育種提供了一種基于DNA變異的新型遺傳 標(biāo)記。特別是分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的出現(xiàn)，為顯著改善豬的運(yùn)些數(shù)量性狀提供可能。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積和/或瘦肉 率的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積和/或瘦肉率的方法是檢測(cè) 待測(cè)豬的H19基因的第16位脫氧核糖核巧酸是C還是T還是C和T，W確定待測(cè)豬的基因 型是TT基因型還是CC基因型還是TC基因型，根據(jù)所述豬的基因型確定所述豬100kg體重 眼肌面積和/或瘦肉率的大小：TT基因型的豬個(gè)體100kg體重眼肌面積和/或瘦肉率大于 CT基因型的豬個(gè)體，CT基因型的豬個(gè)體100kg體重眼肌面積和/或瘦肉率大于CC基因型 的豬個(gè)體；
[0007] 所述CC基因型為H19基因自5'末端第16位脫氧核糖核巧酸為C的純合體；
[0008] 所述CT基因型為H19基因自5'末端第16位脫氧核糖核巧酸為C和T的雜合體；
[0009] 所述TT基因型為H19基因自5'末端第16位脫氧核糖核巧酸為T的純合體；
[0010] 所述化9基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示。
[0011] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)豬的H19基因的第16位脫氧核糖核巧酸是T還是C還 是T和C的方法為如下A)或B): 陽(yáng)〇1引A)直接測(cè)序；
[0013]B)用能夠擴(kuò)增含有豬H19基因的第16位脫氧核糖核巧酸的引物對(duì)擴(kuò)增所述待測(cè) 豬的基因組DNA，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第16位的堿基均為C， 則所述豬的基因型為CC基因型，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第16位的堿基為C和T，則 所述豬的基因型為CT基因型，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第16位的堿基均為Τ，則所述 豬的基因型為ΤΤ基因型。
[0014] 上述方法中，所述Β)包括如下步驟：所述擴(kuò)增所用的引物對(duì)滿足如下條件：W所 述豬個(gè)體的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物含有Η19基因的第16位脫氧核糖核巧 酸；
[0015] 所述引物對(duì)為由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單 鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積和/或瘦 肉率的試劑。
[0017] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積和/或瘦肉率的試劑是檢測(cè) 待測(cè)豬的H19基因的第16位脫氧核糖核巧酸是T還是C還是T和C的物質(zhì)；
[001引所述化9基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示。
[0019] 上述試劑中，所述物質(zhì)為由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列 3所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0020] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積和/或瘦 肉率的試劑盒。
[0021] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積和/或瘦肉率的試劑盒含有 上述試劑。
[0022] 上述試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 上述試劑或上述試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積的產(chǎn)品中 的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 上述試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定豬瘦肉率中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[00巧]上述試劑或上述試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定豬瘦肉率的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[00%] 上述方法或上述試劑或上述試劑盒在豬育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027] 上述方法或上述試劑或上述試劑盒在選育瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大 的種豬中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種選育瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大的 種豬的方法。
[0029] 本發(fā)明提供的選育瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大的種豬的方法包括選擇 TT基因型的豬進(jìn)行育種；
[0030] 所述TT基因型為H19基因的第16位脫氧核糖核巧酸為T的純合體；
[0031] 所述化9基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示。
[0032] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了豬H19基因的第四內(nèi)含子的C16T位點(diǎn)對(duì)豬100kg體重眼肌面積有 顯著影響，并基于該SNP位點(diǎn)提供了一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積的方法：ΤΤ 基因型的豬個(gè)體100kg體重眼肌面積高于CT基因型的豬個(gè)體，CT基因型的豬個(gè)體100kg體 重眼肌面積高于CC基因型的豬個(gè)體。通過(guò)試驗(yàn)證明：本發(fā)明的方法可W準(zhǔn)確并快速的鑒定 豬100kg體重眼肌面積，對(duì)豬的遺傳育種和性能鑒定具有重要的參考意義。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] 下述實(shí)施例中的豬100kg體重眼肌面積為豬體重達(dá)到100kg時(shí)的活體眼肌面積。
[0036] 實(shí)施例1、一種鑒定或輔助鑒定豬100kg體重眼肌面積的方法
[0037] 一、豬H19基因的SNP位點(diǎn)的篩選
[0038]1、豬耳組織樣品DNA的提取
[0039] 分別采集來(lái)自河北豬場(chǎng)的32頭長(zhǎng)白豬的血液樣品，樣品采集后，保存于75%酒精 中，并于-20°C保存。采用苯酪-氯仿抽提法提取血液樣品的基因組DNA，得到豬耳組織的 基因組DNA。具體步驟如下：
[0040] (1)耳組織樣的準(zhǔn)備：剪取大小適中的耳組織樣，用生理鹽水沖洗掉表面的雜質(zhì) 和血污，放于1. 5ml離屯、管中，用眼科剪剪碎，并向其中加入500UL的組織裂解液（北京百 泰科生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)品編號(hào)：AU19011);
[OOW似根據(jù)所剪取的耳組織樣的大小，向離屯、管中加入25uL的蛋白酶K(SIGMA-ALDRICH;產(chǎn)品編號(hào)：SRE0005);
[0042] (3)放于水浴搖床上，55°C消化過(guò)夜，確保耳組織樣消化完全，得到消化徹底的耳 組織；
[0043] (4)將上述消化徹底的耳組織樣于室溫放置，加入等體積的Tris-飽和酪（江蘇寶 萊生物科技有限公司），翻覆顛倒混勻5min;
[0044] 巧）14000巧m/min離屯、lOmin，離屯、管中會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，上層為含有核酸的水 相，下層為含有其他雜質(zhì)的有機(jī)相；
[0045] (6)利用微量移液器小屯、吸取上層含核酸的水相，放置于一個(gè)新的1. 5ml離屯、管 中（為了避免吸起下層的有機(jī)相，最好用去除尖頭的藍(lán)槍頭），棄下層有機(jī)相；
[0046] (7)重復(fù)步驟（4)~化）；
[0047] (8)向含有水相的離屯、管中加入等體積的飽和酪：氯仿=1 :1，反復(fù)顛倒混勻 5min，14000巧m/min離屯、lOmin，然后吸取上層液體，放于一個(gè)新的1. 5血離屯、管中； W48] (9)重復(fù)步驟做；
[0049] (10)向其中加入飽和酪、氯仿和異戊醇，飽和酪：氯仿：異戊醇的體積比為25 :24: 1，翻覆顛倒混勻，14000;rpm/min離屯、lOmin;
[0050] (11)吸除上層液體，加入2倍體積的無(wú)水乙醇（事先放于-20°C冰箱內(nèi)預(yù)冷）沉 淀DNA，此時(shí)會(huì)在離屯、管內(nèi)出現(xiàn)絲狀或絮狀DNA沉淀；
[(X)川用黃色槍頭小屯、的挑出絲狀或絮狀DNA沉淀，放于一個(gè)新的1. 5血的EP管， 向其中加入70%乙醇（-20°C預(yù)冷）500祉，洗涂DNA沉淀，溫和顛倒30s，棄70%乙醇；
[0052] (13)重復(fù)步驟（12);
[0053] (14)將含有DNA沉淀的離屯、管放于室溫環(huán)境中，干燥20~30min;
[0054](15)加入60~80uL的TE緩沖液或雙蒸水溶解DM沉淀（勿劇烈振蕩或離屯、）， 將其保存于-20°C冰箱內(nèi)。
[0055] 2、目的片段的擴(kuò)增及測(cè)序
[0056] (l)PCR擴(kuò)增
[0057] W步驟1獲得的基因組DNA為模板，采用上游引物：TGCCCAACCTGAGCCCTGAC(序列 2)和下游引物：TCCCACCAGACTCGCTTGA(序列3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0058]PCR擴(kuò)增體系：10XLAPCRBuffer化l，10mMdNTPMix1.6ul，上下游引物 (lOpmol/L)各lul，LATaqDM聚合酶巧U/ul)，基因組DMlul，d地20 13. 2ul。
[0059]PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性，5min;94°C變性，30s，58°C退火，30s，72°C延伸，30s， 72°C延伸，lOmin。
[0060] (2)PCR產(chǎn)物的回收純化
[0061] 利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)