一種prrt2蛋白相關(guān)的抗原表位肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體地說,本發(fā)明涉及一種PRRT2蛋白相關(guān)的抗原表 位肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] PRRT2(proline_richtransmembraneprotein)為富含腦氨酸的跨膜蛋白,在人 類已發(fā)現(xiàn)了 3個PRRT2蛋白亞型(isoform1、isoform2和isoform3),其編碼基因定位于 16號染色體上(16pl1. 2)。最近的研究表明,PRRT2基因突變與運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙(PKD)、 良性家族性嬰兒癲癇癥(BFIE)和嬰兒驚厥伴發(fā)作性手足舞蹈徐動征(ICCA)等多種運(yùn)動障 礙疾病的發(fā)病相關(guān),提示PRRT2突變是多種運(yùn)動障礙疾病共同的致病因素之一。
[0003] 目前,已經(jīng)出現(xiàn)了商業(yè)化的PRRT2抗體,但這些商品化的抗體基本都只適用于單 一的檢測方法,如PRRT2的westernblot檢測,而且其識別抗原的特異性不強(qiáng)。此外,PRRT2 基因的突變會導(dǎo)致運(yùn)動障礙等相關(guān)的疾病。現(xiàn)有的商品化PRRT2抗體大多只能檢測正常的 PRRT2蛋白,不能檢測突變的PRRT2蛋白,因此,這類抗體無法用于疾病發(fā)病機(jī)理研究。
[0004] 由于沒有高質(zhì)量的同時可以檢測正常和突變PRRT2的抗體,人們無法在蛋白水平 上系統(tǒng)研究PRRT2在組織中的分布、表達(dá)規(guī)律、亞細(xì)胞定位及其與其他蛋白的相互作用,因 而無法揭示PRRT2基因突變導(dǎo)致運(yùn)動障礙的致病機(jī)理。因此,制備靈敏度高、特異性強(qiáng)、同 時可檢測正常和突變PRRT2的PRRT2抗體是此類運(yùn)動障礙疾病發(fā)病機(jī)理研究工作中亟待解 決的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種制備PRRT2抗體的技術(shù),通過該技術(shù)制備的PRRT2抗體 適用于組織、細(xì)胞中PRRT2的檢測,特別適合針對由PRRT2基因突變導(dǎo)致的人神經(jīng)系統(tǒng)疾病 的致病機(jī)理的研究。
[0006] 本發(fā)明的第一方面,提供了一種抗原表位肽,所述抗原表位肽源自PRRT2蛋白,并 且所述抗原表位肽的氨基酸長度為100-200個氨基酸。
[0007] 在另一優(yōu)選例中,所述的抗原表位肽的氨基酸序列選自下組:
[0008] (A)具有SEQIDN0:4或6所示氨基酸序列的多肽;
[0009] (B)具有與SEQIDN0:4或6中任一所示氨基酸序列彡80%同源性(優(yōu)選地, 彡90%的同源性;等優(yōu)選地彡95%的同源性;最優(yōu)選地,彡97%的同源性)的多肽,且所述 多肽具有與抗PRRT2蛋白抗體的結(jié)合能力;
[0010] (C)將SEQIDN0:4或6中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的,且保留與抗PRRT2蛋白抗體的結(jié)合能力的衍生多肽。
[0011] 在另一優(yōu)選例中,所述PRRT2蛋白為哺乳動物的PRRT2蛋白(包括人)。
[0012] 本發(fā)明的第二方面,提供了一種融合蛋白,所述融合蛋白含有本發(fā)明第一方面所 述的抗原肽和任選的標(biāo)簽序列。
[0013] 在另一優(yōu)選例中,所述標(biāo)簽序列選自:GST標(biāo)簽序列、FLAG標(biāo)簽序列、HIS標(biāo)簽序 列、MYC標(biāo)簽序列。
[0014] 本發(fā)明的第三方面,提供了一種抗體,所述抗體特異性的結(jié)合本發(fā)明第一方面所 述的抗原表位肽或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白,并且所述抗體能夠特異性地結(jié)合天然 的PRRT2蛋白和突變的PRRT2蛋白。
[0015] 在另一優(yōu)選例中,所述天然的PRRT2蛋白氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0016] 在另一優(yōu)選例中,所述突變的PRRT2蛋白氨基酸序列如SEQIDN0. : 10所示。
[0017] 在另一優(yōu)選例中,所述抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體或抗血清。
[0018] 本發(fā)明的第四方面,提供了一種分離的多核苷酸,它編碼本發(fā)明第一方面所述的 抗原肽或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白或本發(fā)明第三方面所述的抗體。
[0019] 本發(fā)明的第五方面,提供了一種表達(dá)載體,所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第四方面所 述的多核苷酸。
[0020] 本發(fā)明的第六方面,提供了一種宿主細(xì)胞,所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第五方面 所述的表達(dá)載體,或者在基因組中整合有本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸。
[0021 ] 本發(fā)明的第七方面,提供了一種藥物組合物,所述的組合物含有本發(fā)明第一方面 所述的抗原表位肽、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的抗體、本發(fā)明 第四方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第五方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第六方面所述的宿 主細(xì)胞,以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
[0022] 在另一優(yōu)選例中,所述藥物組合物包括疫苗組合物。
[0023] 本發(fā)明的第八方面,提供了本發(fā)明第一方面所述的抗原表位肽、本發(fā)明第二方面 所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的抗體、本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第 五方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞的用途,
[0024] (a)用于制備針對所述PRRT2蛋白的抗體;和/或
[0025] (b)用于制備治療與所述PRRT2蛋白相關(guān)的疾病的藥物。
[0026] 在另一優(yōu)選例中,所述疾病包括發(fā)作性運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙(PKD)、良性家族性嬰 兒癲癇癥(BFIE)和嬰兒驚厥伴發(fā)作性手足舞蹈徐動征(ICCA)。
[0027] 本發(fā)明的第九方面,提供了本發(fā)明第三方面所述的抗體的用途,用于
[0028] (1)PRRT2蛋白的分離純化;或
[0029] (2)非診斷目的PRRT2蛋白的檢測;或
[0030] (3)制備檢測PRRT2蛋白的試劑或試劑盒。
[0031] 在另一優(yōu)選例中,所述PRRT2蛋白包括天然PRRT2蛋白和/或突變的PRRT2蛋白。
[0032] 本發(fā)明的第十方面,提供了一種制備抗PRRT2蛋白抗體的方法,包括步驟:
[0033] (1)使用本發(fā)明的本發(fā)明第一方面所述的抗原表位肽或本發(fā)明第二方面所述的融 合蛋白作為抗原免疫動物,并在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗PRRT2蛋白的抗體;
[0034] (2)分離純化所述抗PRRT2蛋白的抗體。
[0035] 在另一優(yōu)選例中,所述動物為哺乳動物。
[0036] 在另一優(yōu)選例中,所述動物包括人、鼠、兔、?;蜓?。
[0037] 應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0038] 圖1顯示了實(shí)施1中所制備的抗原肽電泳結(jié)果。
[0039] 圖2顯示了以人流產(chǎn)胎兒腦組織為材料,通過WesternBlot實(shí)驗(yàn),檢測本抗體對 組織中PRRT2的檢測效果;其中圖2A為實(shí)施例中所用的腦組織圖片以及3個不同部位的檢 測結(jié)果,圖2B為對照抗體的檢測結(jié)果。
[0040] 圖3顯示了以流產(chǎn)胎兒的腦組織為材料,通過IP實(shí)驗(yàn),檢測抗體在IP實(shí)驗(yàn)中的應(yīng) 用效果;圖3A為本發(fā)明抗體的檢測結(jié)果,圖3B為對照抗體的檢測結(jié)果。
[0041] 圖4免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果,其中圖4A顯示了體外過表達(dá)PRRT2_flag蛋 白,通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn),檢測本發(fā)明抗體的特異性,圖4B顯示了對照抗體檢測神經(jīng)前 體細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果,圖4C顯示了本發(fā)明抗體檢測神經(jīng)前體細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究,獲得一種源于PRRT2的抗原表位,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明,使用包含該抗原表位的多肽免疫動物,能夠制備出對PRRT2特異性強(qiáng)、靈敏度度高的抗 PRRT2抗體。而且該抗體對檢測方法的適用性廣,可用于westernblot分析、細(xì)胞免疫突光 檢測、組織免疫熒光檢測和免疫共沉淀(IP)分析等。
[0043] 術(shù)語
[0044] PRRT
[0045] PRRT家族包括PRRT1、PRRT2、PRRT3、PRRT4,其中PRRT2 (proline-rich transmembraneprotein2)包含4個外顯子,共3794bp,編碼一個由340個氨基酸組成的跨 膜蛋白/膜蛋白,UCSC上的序列編號為NM_145239。PRRT2主要在大腦表達(dá),尤其是基底節(jié) 區(qū),其功能不詳,編碼的蛋白與SNAP25(synaptosomal_associatedprotein)是互做蛋白。 SNAP25蛋白是一種突觸相關(guān)膜蛋白,參與軸突發(fā)生、鈣離子依賴性神經(jīng)遞質(zhì)胞吐作用、神經(jīng) 遞質(zhì)(乙酰膽堿、GABA、谷氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、胰島素)等的分泌和循環(huán)過程、突觸 發(fā)生的調(diào)節(jié),且SNAP25的過表達(dá)可抑制鉀離子通道蛋白的活性。
[0046] 在本發(fā)明中,術(shù)語"PRRT2"、"PRRT2蛋白"具有相同的含義。在本發(fā)明的一個優(yōu)選 地實(shí)施方式中,天然PRRT2的氨基酸序列為:
[0051] 突變的PRRT2的氨基酸序列為:
[0052] 第一種突變類型:
[0053] PKD-(CDS573dupT) :192fs8
[0055] 其對應(yīng)的編碼多核苷酸序列為:
[0057] 第二種突變類型:
[0058] PKD_(CDSC487T) :163X
[0060] 其對應(yīng)的編碼多核苷酸序列為:
[0062] 活性多肽
[0063] 如本文所用,術(shù)語"PRRT2抗原"、"PRRT2抗原肽"、"多肽抗原"可互換使用。指多 肽序列來自于PRRT2蛋白的多肽。
[0064] 如本文所用,術(shù)語"本發(fā)明的PRRT2抗原"、"本發(fā)明PRRT2抗原肽"可互換使用,指 可結(jié)合于抗PRRT2抗體的抗原肽(如SEQIDN0:4或6所示的多肽)。
[0065] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實(shí)施方式中,