一種以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法，屬農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensi Berliner (Bt)是一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生伴胞晶體、α-外毒素、外毒素等多種對(duì)鱗翅目、膜翅目、雙翅目等9個(gè)目500多種害蟲(chóng)有毒殺作用的物質(zhì)，且對(duì)人畜和環(huán)境無(wú)害，目前已成為世界上產(chǎn)量最大的生物殺蟲(chóng)劑，廣泛用于農(nóng)林果蔬害蟲(chóng)的防治。目前Bt的生產(chǎn)主要以液體深層發(fā)酵為主，此外還有部分固態(tài)發(fā)酵，其碳源主要用糖類和玉米淀粉，氮源主要利用有機(jī)氮化合物，如魚(yú)粉、豆柏粉、蛋白胨等，生產(chǎn)成本較高，是目前生物源殺蟲(chóng)劑普及的主要限制因素之一。因此如何降低Bt的生產(chǎn)成本是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。已有研究報(bào)道，可利用味精生產(chǎn)廢水、廢啤酒酵母浸出液、廢蜜糖、乳清、污泥等發(fā)酵生產(chǎn)Bt，但仍存在原料處理工序繁瑣、成本相對(duì)較高、后期處理工藝復(fù)雜、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差等諸多問(wèn)題。
[0003]與此同時(shí)，經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展及污染物排放增加導(dǎo)致大量湖泊水庫(kù)的水體出現(xiàn)了富營(yíng)養(yǎng)化，夏季藻爆發(fā)已成為一大環(huán)境公害。對(duì)藍(lán)藻的治理目前仍以機(jī)械打撈分離為主，打撈出的藍(lán)藻不能直接被家畜食用，也無(wú)法直接提取蛋白，堆積在岸邊不僅占用土地，其產(chǎn)生的藻毒素、多環(huán)芳烴(PAHs)及NH3、H2S等物質(zhì)還會(huì)二次污染環(huán)境。如何妥善處理這些藻泥有機(jī)廢棄物，是湖泊污染治理中迫切需要解決的難題。目前對(duì)藍(lán)藻藻泥主要以焚燒發(fā)電、轉(zhuǎn)化生產(chǎn)有機(jī)肥為主，但受其水分含量過(guò)高等因素制約，尚不能滿足當(dāng)前的實(shí)際需要。研究表明新鮮藍(lán)藻用于發(fā)酵制備Bt生物殺蟲(chóng)劑具有一定可行性，由于新鮮藍(lán)藻本身含藻毒素等多種毒素，直接噴施對(duì)植物有不利效果，但發(fā)酵后藻毒素降低。另外藍(lán)藻較易腐爛發(fā)酵，新鮮藍(lán)藻制備Bt使用不便。因此考慮使用藍(lán)藻沼液作為基質(zhì)發(fā)酵制備Bt。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種利用藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的制備方法，
[0005]本發(fā)明的以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法，具體步驟如下:
[0006](1)原料選擇:
[0007]成分及質(zhì)量百分比為:微囊藻屬93.12%，魚(yú)腥藻屬1.66%，束絲藻屬1.72%，綠藻門2.99%，硅藻門0.51%的新鮮藍(lán)藻；
[0008]菌種標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):FSCC(T) 115030，GIMCC編號(hào):G頂1.32的蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis);該菌種于2013年06月18日向廣東省微生物菌株保藏中心購(gòu)買，地址:廣州市先烈中路100號(hào)實(shí)驗(yàn)樓五樓。
[0009]常規(guī)的LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨:40 %，酵母提取物:20 %，氯化鈉40 % ;或含固率1-3%的常規(guī)的藍(lán)藻沼液培養(yǎng)基。
[0010](2)藍(lán)藻沼液制備
[0011]用10-25L不銹鋼厭氧發(fā)酵罐，加入占罐容積20-50%的藍(lán)藻藻泥，排氧溫度30°C下自然發(fā)酵發(fā)酵2個(gè)月。
[0012](3)Bt GIM1.32 菌種活化:
[0013]在250-500mL錐形瓶中裝入配置好的100_200mL常規(guī)LB液體培養(yǎng)基并在103.4kPa，121.3°C下滅菌15min。無(wú)菌操作臺(tái)上用浸過(guò)70-80%的酒精脫脂棉擦凈菌種凍干管，用火焰加熱頂部，滴無(wú)菌水使凍干管頂端破裂，用鑷子敲破凍干管，取50-150mg菌種置于LB液體培養(yǎng)基中，在溫度25-35°C、50-150rpm/min的條件下培養(yǎng)活化5_20h。用無(wú)菌月旲封口后放入2 C冰箱冷減備用。
[0014](4)發(fā)酵:在0.5-1L錐形瓶中加入100-300mL LB培養(yǎng)基或含固率1_3%的藍(lán)藻沼液培養(yǎng)基并在103.4kPa，121.3°C下滅菌15min，每瓶接種1_3%已活化的pH值為5.0-8.0的Bt GIM1.32，在溫度25-35°C、50-150rpm/min的條件下培養(yǎng)發(fā)酵40_60h。大批量生產(chǎn)時(shí)按比例擴(kuò)大。
[0015](5)干燥:采用_55°C，4Pa常規(guī)真空冷凍干燥法對(duì)上述發(fā)酵脫水處理，當(dāng)含水率小于質(zhì)量百分比5%時(shí)即得到發(fā)酵Bt原粉。
[0016]本發(fā)明所用儀器為常規(guī)的市購(gòu)儀器。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0018]1、與沼渣、啤酒糟、玉米粉、豆餅粉、米糠、及麥麩傳統(tǒng)底物相比，能夠使生產(chǎn)Bt的成本大幅降低；
[0019]2、利用發(fā)酵了 2個(gè)月的藍(lán)藻沼液制備Bt，成品晶體蛋白含量1.87g/L、毒力效價(jià)679.89IU/ μ L、LC50 0.353mL/L，均大于利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基同條件制備的Bt ；
[0020]3、產(chǎn)毒素性能整體上較常規(guī)LB培養(yǎng)基優(yōu)良，成品效價(jià)高，分散性好，質(zhì)量好，同時(shí)提升了藍(lán)藻資源化再利用率；
[0021]4、按比例擴(kuò)大后能用于大批量生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施例所用儀器為常規(guī)的市購(gòu)儀器。
[0023]本發(fā)明的以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法，具體步驟如下:
[0024](1)原料選擇:
[0025]成分及質(zhì)量百分比為:微囊藻屬93.12%，魚(yú)腥藻屬1.66%，束絲藻屬1.72%，綠藻門2.99%，硅藻門0.51%的新鮮藍(lán)藻；
[0026]菌種標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):FSCC(T) 115030，GIMCC編號(hào):G頂1.32的蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis);該菌種于2013年06月18日向廣東省微生物菌株保藏中心購(gòu)買，地址:廣州市先烈中路100號(hào)實(shí)驗(yàn)樓五樓。
[0027]常規(guī)的LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨:40%，酵母提取物:20%，氯化鈉40%;或含固率1-3%的常規(guī)的藍(lán)藻培養(yǎng)基。
[0028](2)藍(lán)藻沼液制備
[0029]用10L或25L不銹鋼厭氧發(fā)酵罐，加入藍(lán)藻藻泥占罐容積的20%或50%，排氧溫度30°C下自然發(fā)酵發(fā)酵2個(gè)月。
[0030](3)Bt GIM1.32 菌種活化:
[0031]在250mL或500mL錐形瓶中裝入配置好的100mL或200mL常規(guī)LB液體培養(yǎng)基并在103.4kPa，121.3°C下滅菌15min。無(wú)菌操作臺(tái)上用浸過(guò)70%或80%的酒精脫脂棉擦凈菌種凍干管，用火焰加熱頂部，滴無(wú)菌水使凍干管頂端破裂，用鑷子敲破凍干管，取50mg或150mg菌種置于LB液體培養(yǎng)基中，在溫度25°C或35°C、50rpm/min或150rpm/min的條件下培養(yǎng)活化5h或20h。用無(wú)菌膜封口后放入2°C冰箱冷藏備用。
[0032](4)發(fā)酵:在0.5L或1L錐形瓶中加入100mL或300mL LB培養(yǎng)基或含固率1%或3%的藍(lán)藻沼液培養(yǎng)基并在103.4kPa，121.3°C下滅菌15min，每瓶接種1%或3%已活化的pH 值為 5.0 或 8.0 的菌種活化的 Bt GIM1.32，在溫度 25。?；?35°C、50rpm/min 或 150rpm/min的條件下培養(yǎng)發(fā)酵40h或60h。大批量生產(chǎn)時(shí)按比例擴(kuò)大。
[0033](5)干燥:采用_55°C，4Pa常規(guī)真空冷凍干燥法對(duì)上述發(fā)酵脫水處理，當(dāng)含水率小于質(zhì)量百分比5%時(shí)即得到發(fā)酵Bt原粉。
[0034]實(shí)際應(yīng)用表明:本方法不僅成本大幅降低，且成品效價(jià)高，分散性好，產(chǎn)量大，質(zhì)量好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種本發(fā)明的以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法，其特征在于方法的該具體步驟如下: (1)原料選擇 成分及質(zhì)量百分比為:微囊藻屬93.12%,魚(yú)腥藻屬1.66%，束絲藻屬1.72%，綠藻門.2.99%，硅藻門0.51%的新鮮藍(lán)藻； 菌種標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):FSCC(T) 115030，GHCC編號(hào):GIM1.32的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)； 常規(guī)的LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨:40%，酵母提取物:20%，氯化鈉40% ;或含固率.1-3%的常規(guī)的藍(lán)藻沼液培養(yǎng)基； (2)藍(lán)藻沼液制備 用10-25L不銹鋼厭氧發(fā)酵罐，加入占罐容積20-50%的藍(lán)藻藻泥，排氧溫度30°C下自然發(fā)酵發(fā)酵2個(gè)月； (3)BtGIM1.32菌種活化 在250-500mL錐形瓶中裝入配置好的100_200mL常規(guī)LB液體培養(yǎng)基并在103.4kPa，.121.3°C下滅菌15min，無(wú)菌操作臺(tái)上用浸過(guò)70-80%的酒精脫脂棉擦凈菌種凍干管，用火焰加熱頂部，滴無(wú)菌水使凍干管頂端破裂，用鑷子敲破凍干管，取50-150mg菌種置于LB液體培養(yǎng)基中，在溫度25-35°C、50-150rpm/min的條件下培養(yǎng)活化5_20h ;用無(wú)菌膜封口后放入2 °C冰箱冷藏備用； (4)發(fā)酵 在0.5-1L錐形瓶中加入100-300mL LB培養(yǎng)基或含固率1_3%的藍(lán)藻沼液培養(yǎng)基并在.103.4kPa，121.3°C下滅菌 15min，每瓶接種 1_3% 已活化的 pH值為 5.0-8.0 的 Bt GIM1.32，在溫度25-35°C、50-150rpm/min的條件下培養(yǎng)發(fā)酵40_60h ； (5)干燥 采用-55°C，4Pa常規(guī)真空冷凍干燥法對(duì)上述發(fā)酵脫水處理，當(dāng)含水率小于質(zhì)量百分比.5%時(shí)即得到發(fā)酵Bt原粉。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法，屬農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的以藍(lán)藻沼液為基質(zhì)發(fā)酵Bt的方法包括：原料選擇、藍(lán)藻沼液制備、Bt？GIM1.32菌種活化、發(fā)酵、及干燥步驟。本發(fā)明的有益效果在于：1、與沼渣、啤酒糟、玉米粉、豆餅粉、米糠、及麥麩傳統(tǒng)底物相比，能夠使生產(chǎn)Bt的成本大幅降低；2、利用發(fā)酵了2個(gè)月的藍(lán)藻沼液制備Bt，成品晶體蛋白含量1.87g/L、毒力效價(jià)679.89IU/μL、LC50？0.353mL/L，均大于利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基同條件制備的Bt；3、產(chǎn)毒素性能整體上較常規(guī)LB培養(yǎng)基優(yōu)良，成品效價(jià)高，分散性好，質(zhì)量好，同時(shí)提升了藍(lán)藻資源化再利用率；4、按比例擴(kuò)大后能用于大批量生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/07
【公開(kāi)號(hào)】CN105296403
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510865971
【發(fā)明人】張乃明, 譚超, 秦太峰, 包立
【申請(qǐng)人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月1日