[0059] c.酶混合物 10μ1 ;
[0060]d.無RNA/DNA酶水100μ1 ;
[0061]e.陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒30μ1。
[0062] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測豬圓環(huán)病毒PCV1
[0063] (l)PCR總體系為25μ1。分別將本發(fā)明試劑盒中擴(kuò)增預(yù)混液：12. 5μ1、三條引物 共3μ1、無RNA/DNA酶水6. 5μ1、提取樣品的DNA模板3μ1、陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒 3μ1、陰性對照無RNA/DNA酶水3μ1，加入到0. 2ml擴(kuò)增管中。
[0064] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽性對照3μ1、從豬肺臟組織中提取DNA模板 3μ1、陰性對照3μ1，12000rpm離心5-30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò) 增：94°(：預(yù)變性21^11 ;941€2〇8，退火溫度55.51€3〇8,721€2〇8,40個循環(huán)。直接在實(shí)時定 量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0065] 5、結(jié)果分析
[0066] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于 35-40為可疑，需重復(fù)檢測。再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰性。也可 以依擴(kuò)增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始樣品中病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0067] 實(shí)施例2
[0068] 步驟1、2同實(shí)施例1。
[0069] 3、制備用于檢測20頭份的試劑盒
[0070] 本試劑盒由以下組分組成：
[0071] a. One Step RT-PCR buffer ：250 μ 1；
[0072] b.引物濃度均為lOpmol/μΙ的三條引物混合液60μ1，其中173bp上游引物 20 μ 1，173bp下游引物20 μ 1，探針引物20 μ 1 ;
[0073] c.酶混合物20 μ 1 ;
[0074] d.無RNA/DNA酶水200μ1;
[0075]e.陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒60μ1〇
[0076] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測豬圓環(huán)病毒PCV1
[0077] (l)PCR總體系為25μ1。分別將本發(fā)明試劑盒中擴(kuò)增預(yù)混液：12. 5μ1、三條引物 共3μ1、無RNA/DNA酶水6. 5μ1、提取樣品的DNA模板3μ1、陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒 3μ1、陰性對照無RNA/DNA酶水3μ1，加入到0. 2ml擴(kuò)增管中。
[0078] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽性對照3μ1、從豬肺門淋巴結(jié)中提取的DNA模板 3μ1、陰性對照3μ1、12000rpm離心5-30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò) 增：94°C預(yù)變性2min;94°C20s，退火溫度55. 5°C30s，72°C20s，40個循環(huán)。直接在實(shí)時定 量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0079] 5、結(jié)果分析
[0080] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于 35-40為可疑，需重復(fù)檢測。再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰性。也可 以依擴(kuò)增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0081] 實(shí)施例3
[0082] 步驟1、2同實(shí)施例1。
[0083] 3、制備用于檢測50頭份的試劑盒
[0084] 本試劑盒由以下組分組成：
[0085]a. One Step RT-PCR buffer：625μ1；
[0086]b.引物濃度均為lOpmol/μΙ的三條引物混合液150μ1，其中173bp上游引物 50 μ 1，173bp下游引物50 μ 1，探針引物50 μ 1 ;
[0087]c.酶混合物50 μ 1 ;
[0088]d.無RNA/DNA酶水5〇0μ1;
[0089]e.陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒150 μ 1〇
[0090] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測豬圓環(huán)病毒PCV1
[0091] (l)PCR總體系為25 μ1。分別將本發(fā)明試劑盒中擴(kuò)增預(yù)混液：12. 5 μ 1、三條引物 共3 μ 1、無RNA/DNA酶水6.5 μ 1、提取樣品的DNA模板3 μ 1、陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒 3 μ 1、陰性對照無RNA/DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml擴(kuò)增管中。
[0092] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽性對照3μ1、從豬腸系膜淋巴結(jié)中提取的DNA模 板3μ1、陰性對照3μ1、12000rpm離心5-30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下 擴(kuò)增：94°C預(yù)變性2min;94°C20s，退火溫度55. 5°C30s，72°C20s，40個循環(huán)。直接在實(shí)時 定量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0093] 5、結(jié)果分析
[0094]根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于 35-40為可疑，需重復(fù)檢測。再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰性。也可 以依擴(kuò)增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始樣品中病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0095] 實(shí)施例4
[0096] 步驟1、2同實(shí)施例1。
[0097] 3、制備用于檢測100頭份的試劑盒
[0098] 本試劑盒由以下組分組成：
[0099] a. One Step RT-PCR buffer :1250 μ 1；
[0100] b.引物濃度均為iopmol/μL的三條引物混合液300 μ1，其中173bp上游引物 100 μ 1，173bp下游引物100 μ 1，探針引物100 μ 1 ;
[0101] c.酶混合物100μΙ;
[0102]d.無RNA/DNA酶水1ml;
[0103] e.陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒300 μ 1。
[0104] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測豬圓環(huán)病毒PCV1
[0105] (l)PCR總體系為25 μ1。分別將本發(fā)明試劑盒中a.擴(kuò)增預(yù)混液：12. 5 μ 1 ;b.三 條引物共3 μ 1 ;c.無RNA/DNA酶水6.5 μ 1 ;e.提取樣品的DNA模板3 μ 1 ;f.陽性對照 pGM-173陽性質(zhì)粒3 μ 1 ;g.陰性對照無RNA/DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml擴(kuò)增管中。
[0106] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽性對照3μ1、從豬頌下淋巴結(jié)中提取的DNA模板 3μ1、陰性對照3μ1、12000rpm離心5-30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò) 增：94°C預(yù)變性2min;94°C20s，退火溫度55. 5°C30s，72°C20s，40個循環(huán)。直接在實(shí)時定 量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0107] 5、結(jié)果分析
[0108] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于 35-40為可疑，需重復(fù)檢測。再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰性。也可 以依擴(kuò)增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始樣品中病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，所述試劑盒包含 擴(kuò)增預(yù)混液、陽性對照、無RNA酶水、序列SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的引物及SEQID NO:3的探針引物的混合物，其特征在于所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:2的引物序列 為： SEQIDN0:1 :上游引物GAAAGGTAGGGGTAGGGGGTTGGT; SEQID2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試 劑盒，其特征在于所述探針引物序列為： SEQIDN0:3 ：CCGCCTGAGGGGGGGAGGAACTG〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征在 于所述引物混合物擴(kuò)增出的條帶序列為： SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延長的序列： SEQIDNO:4 (173bp)： gaaaggtaggggtagggggttggtgccgcctgagggggggaggaactggccgatgttgaaccgcagctggt taacattccaagatggctgcgagtgtcctccttctatggtgagtacaaattctctagaaaggcgggaattgaagat acccgtctttcggcgccatctgtaac〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于檢測豬圓環(huán)病毒PCVl的Taqman Real-timePCR試劑盒，其特征在于所述引物濃度均的lOpmol/μL，擴(kuò)增引物及探針引物體 積配比為1:1:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試 劑盒，其特征在于所述陽性對照為構(gòu)建的PGM-173陽性質(zhì)粒以及利用其制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。6. -種如權(quán)利要求1所述檢測豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒的使 用方法，其特征在于所述實(shí)時熒光定量RT-PCR包括以下步驟： a. 使用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件如下：94°C預(yù)變性2min; 94°C20s，退火溫度 55. 5°C30s，72°C20s，40 個循環(huán)； b. 結(jié)果分析 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于35-40 為可疑，需重復(fù)檢測；再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰性；也可以依擴(kuò) 增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始樣品中病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。7. -種如權(quán)利要求6所述檢測豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒的使 用方法，其特征在于所述實(shí)時熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系為： a. OneStepRT-PCRbuffer:12· 5 份； b. 引物混合液3份 c. 酶混合物1份； d. 無RNA/DNA酶水 5. 5 份； e. 提取樣品的RNA模板3份； f. 陽性對照pGM-173陽性質(zhì)粒3份； g. 陰性對照無RNA/DNA酶水3份。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的豬圓環(huán)病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR試劑盒，其特征
【專利摘要】一種用于檢測豬圓環(huán)病毒PCV1的Taqman？Real-timePCR試劑盒及其使用方法，所述試劑盒包含擴(kuò)增預(yù)混液、陽性對照、無RNA酶水、序列SEQ？ID？NO:1和？SEQ？ID？NO:2的引物及SEQ？ID？NO:3的探針引物的混合物，所述檢測方法包括使用所述試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增的步驟及評定標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明設(shè)計了特異性針對PCV1的引物及探針，優(yōu)化并組裝成試劑盒。與普通RT-PCR方法相比，本發(fā)明省時、省力，成本較低，所述使用方法能快速、敏感、準(zhǔn)確以及低成本地對豬圓環(huán)病毒PCV1進(jìn)行檢測及定量分析，該方法的建立對臨床診斷PCV1和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公開號】CN105274256
【申請?zhí)枴緾N201510719725
【發(fā)明人】吳錦艷, 田宏, 尚佑軍, 陳妍, 王光祥, 劉湘濤, 張志東, 欒志舫, 王耀杰, 臧金鳳
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年10月30日