一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高通量測序領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及一種應(yīng)用于SOLiD測序系統(tǒng)的，可 有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各大領(lǐng)域，很多生物學(xué)問題借助高通 量測序技術(shù)予W解決。S化iD測序系統(tǒng)可W對(duì)由任何方法制成的測序文庫進(jìn)行測序，其最大 的特點(diǎn)是使用了雙堿基編碼技術(shù)，該技術(shù)具有誤差校正功能，因?yàn)樗峭ㄟ^兩個(gè)堿基來對(duì) 應(yīng)一個(gè)巧光信號(hào)而不是傳統(tǒng)的一個(gè)堿基對(duì)應(yīng)一個(gè)巧光信號(hào)，運(yùn)樣每一個(gè)位點(diǎn)都會(huì)被檢測兩 次，因此錯(cuò)誤率明顯降低。利用常規(guī)方法構(gòu)建測序文庫之后，在微反應(yīng)器中加入測序模板、 反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行油包水PCR。運(yùn)一步可W形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間W進(jìn)行 擴(kuò)增。理想狀態(tài)下，每個(gè)反應(yīng)空間只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)Pl磁珠，由水相中的P2引物和 磁珠表面的Pl引物所介導(dǎo)進(jìn)行PCR反應(yīng)，運(yùn)個(gè)DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加。S化ID測 序系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)更高的通量。
[0003] 二代測序系統(tǒng)中，只有SOLiD測序系統(tǒng)W四色巧光標(biāo)記寡核巧酸進(jìn)行連續(xù)連接合 成為基礎(chǔ)，使得該方法在系統(tǒng)準(zhǔn)確性和下游數(shù)據(jù)分析上表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性：獨(dú)特的內(nèi)置 錯(cuò)誤檢查能力能把測量錯(cuò)誤和真正的基因多態(tài)性區(qū)別開來。S化iD測序系統(tǒng)適用于基因組 測序的同時(shí)在轉(zhuǎn)錄組測序有很大的優(yōu)勢(shì)，例如，采用SOLiD測序系統(tǒng)對(duì)構(gòu)建的RNA文庫進(jìn)行 測序可W快速獲得大量數(shù)據(jù)，即使RNA表達(dá)水平很低系統(tǒng)也能夠無偏向性地分析樣品中存 在的已知和未知的RNA而定量測定的RNA差異表達(dá)模式，因而可W檢測到低豐度的RNA。因 此，測序系統(tǒng)在對(duì)miRNA和mRNA進(jìn)行大規(guī)模識(shí)別及其表達(dá)分析方面非常有優(yōu)勢(shì)。
[0004] 在進(jìn)行高通量測序之前，最重要的步驟莫過于進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建。例如，在 S化iD測序系統(tǒng)DNA測序文庫構(gòu)建中，首先要把基因組DNA隨機(jī)打斷，獲得大量的DNA片段， 其次選取其中一定范圍大小的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，然后在片段兩端連上Pl和P2平端 接頭并進(jìn)行缺口平移，最后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)得到所需要的DNA測序文庫。但是，在其文庫構(gòu)建 的過程中，往往會(huì)出現(xiàn)同一測序片段只有一端連上Pl或者P2接頭中，而且由于接頭連接時(shí) 具有隨意性，還會(huì)出現(xiàn)在同一測序片段兩端連上同一接頭的現(xiàn)象。運(yùn)樣減少接頭利用率，降 低擴(kuò)增效率，不利于確定測序文庫片段大小，同時(shí)提高了分離目的文庫片段的難度。
[0005] 針對(duì)SOLiD測序系統(tǒng)，為了解決W上在文庫構(gòu)建中出現(xiàn)的同一測序片段只有一端 連上Pl或者P2接頭和同一測序片段兩端連上同一接頭的現(xiàn)象，需要設(shè)計(jì)一種適用于此系 統(tǒng)的新的接頭，W及采用新接頭的一種文庫構(gòu)建新方法。運(yùn)種新的接頭可W提高接頭的連 接效率和減少錯(cuò)誤接頭連接的情形，并且接頭連接之后目的DNA文庫片段易于分離，最終 提高測序文庫構(gòu)建的成功率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引發(fā)明目的：
[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接 頭及其應(yīng)用，W解決在文庫構(gòu)建的過程中目的DNA片段兩端連上同一接頭的問題。
[000引技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，由兩條DNA寡核 巧酸單鏈組成。
[0010] 所述的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，其接頭是：由兩條DNA 寡核巧酸單鏈經(jīng)過退火得到的接頭。其接頭序列是：
[0011]Pl-A:5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3，
[0012] PY-2 :3,GACGGGGCCCAAGGAGTAAGACCGTCAGCCACT(PO4) 5，；
[0013] 所述的非對(duì)稱高通量測序接頭的結(jié)構(gòu)見附圖1。
[0014] 所述的非對(duì)稱高通量測序接頭中Pl-A序列與Pl接頭的其中一條序列一致，其Pl 接頭為SOLiD測序系統(tǒng)中構(gòu)建DNA文庫所用接頭；
[0015] 所述的Pl接頭，其序列是由兩條DNA寡核巧酸單鏈經(jīng)過退火得到的；其的接頭序 列是：
[0016]Pl-A:5,CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3，
[0017] Pl-B:3'TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA5，。
[0018] 所述的非對(duì)稱高通量測序接頭的PY-2DNA單鏈中下劃線標(biāo)記部分序列（3' -5'方 向）與P2接頭中的P2-B單鏈中下劃線標(biāo)記部分序列（3'-5'方向）一致，橫線后面的序列 為與Pl-A單鏈對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列，其P2接頭為SOLiD測序系統(tǒng)中構(gòu)建DNA文庫所用接頭；
[0019] 所述的P2接頭，其序列是由兩條DNA單鏈經(jīng)過退火得到的P2接頭；其接頭序列 是：
[0020] P2-B:5'AGAGAATGAGGAACCCGGGGCAGTT3'
[0021] P2-A:3'TCTCTTACTCCTTGGGCCCCGTC5，。
[0022] 前述提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，其為雙鏈DNA接 頭。
[0023] 前述提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，其所述的非對(duì)稱的 設(shè)計(jì)是為了在測序文庫構(gòu)建的過程中避免目的DNA片段兩端連上同一接頭的現(xiàn)象。
[0024] 前述提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，其所述的接頭沒有 完全互補(bǔ)的一端含有擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)，可直接用于結(jié)合擴(kuò)增引物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0025] 前述提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，其Pl-A 3'端為突 出末端T(胸腺喀晚），其突出末端與DNA片段粘性末端A(腺巧酸）互補(bǔ)配對(duì)。
[0026] 前述提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，其PY-25'端用憐酸 基團(tuán)修飾，目的是為了在后續(xù)的接頭連接步驟中更好的與DNA片段相連接。
[0027] 前述提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，是將Pl-A和PY-2 兩條DNA寡核巧酸單鏈溶于無酶水，分別取Pl-A單鏈（100yM)和PY-2單鏈（100yM) 40y1 于200yl薄壁PCR管中，加入IOyl的IOXPCRBuffer和IOyl無酶水，經(jīng)過下列程序 退火：95°C，Smin;72°C，Smin;60°C，Smin;50°C，Smin;40°C，Smin;30°C，Smin;20°C，Smin; 10°C，3min;4°C保存，即得到終濃度為40iiM的有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接 頭溶液。
[0028] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭的建 庫方法，其采用W下步驟（圖20):
[0029] 1.對(duì)源基因組DNA進(jìn)行片段化處理，此處的片段化處理方式為超聲打斷；
[0030] 2.已片段化的DNA進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的DNA片段進(jìn)行切 膠回收。此處所用的切膠回收試劑盒為天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒；
[0031] 3.對(duì)回收的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)并純化；
[003引4.對(duì)已經(jīng)末端修復(fù)的DNA片段在3'端進(jìn)行加A處理并純化；
[0033] 5.對(duì)已經(jīng)在3'端進(jìn)行加A(腺巧酸）處理的DNA片段進(jìn)行接頭連接并純化，所述 的接頭是本發(fā)明中提供的一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭；
[0034]6.對(duì)已經(jīng)完成接頭連接的DNA片段再一步進(jìn)行片段選擇，此處進(jìn)行片段選擇的方 式是E-Gel。（此步可省略）；
[0035] 7.對(duì)選擇的片段（或接頭連接之后的DNA片段）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR產(chǎn)物純 化。擴(kuò)增及純化完成之后即為構(gòu)建的DNA測序文庫；
[0036]8.對(duì)已構(gòu)建的DNA測序文庫進(jìn)行質(zhì)控；
[0037] 在上述步驟中，在文庫構(gòu)建的過程中所用的純化方式為磁珠純化。
[00測發(fā)明效果：
[003引本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，由于原先SOLiD測序系統(tǒng)所用的Pl和P2接頭為平端接頭，與 平端目的DNA片段之間連接效率低下，且存在同一測序片段只有一端連上Pl或者P2接頭 (參見附圖8-9)，同一測序片段兩端連上同一接頭（參見附圖10-13)，W及接頭自連（參見 附圖14)的現(xiàn)象，因而會(huì)造成連接效率低下和目的DNA文庫片段選擇的困難。因此，本發(fā)明 提供了一種有效提高建庫效率的非對(duì)稱高通量測序接頭，利用原先接頭序列中的兩條DNA 單鏈，經(jīng)過改造并退火形成一個(gè)新非對(duì)稱高通量測序接頭，取代原來的兩個(gè)接頭。本發(fā)明的 實(shí)驗(yàn)證明，使用本發(fā)明提供的非對(duì)稱高通量測序接頭，只出現(xiàn)了在同一DNA片段的