一種脂環(huán)化合物修飾的高分子材料及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分子化學(xué)、有機合成以及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂環(huán)化 合物修飾的高分子材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因轉(zhuǎn)染是指將外源基因?qū)爰毎瑥亩@得新的遺傳性狀的過程?；蜣D(zhuǎn)染載 體是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的核心，理想的基因轉(zhuǎn)染載體應(yīng)具備如下特點：高轉(zhuǎn)染效率，低細胞毒 性，生物安全性好，價格低廉等。當前使用的基因轉(zhuǎn)染載體主要包括病毒類載體和非病毒類 載體。主要的應(yīng)用研究仍采用轉(zhuǎn)染效率高的病毒類載體，但病毒類載體存在攜帶基因能力 有限以及安全性隱患等問題。因此，很多非病毒基因載體成為新的研究熱點，包括陽離子蛋 白質(zhì)，多肽，脂質(zhì)體，納米金屬顆粒等。
[0003] 高分子基因載體的轉(zhuǎn)染效率與多個因素相關(guān)，包括核酸結(jié)合能力、血清穩(wěn)定性，細 胞攝入效率、細胞內(nèi)運輸和核酸釋放能力等。
[0004]聚酰胺-胺樹形高分子（polyamidoamine，PAMAM)是TomaliaD.A?于 1985 年首 次報道的具有幾何分支的橢圓形結(jié)構(gòu)的樹形大分子，其高效低毒安全的特點已經(jīng)在基因轉(zhuǎn) 染中被廣泛研究和應(yīng)用，得到了人們的廣泛關(guān)注。聚乙烯亞胺陽離子聚合物于1995年首次 作為基因載體應(yīng)用，由于高密度的胺結(jié)構(gòu)存在，使其能與核酸緊密結(jié)合形成納米顆粒，利于 細胞內(nèi)吞，現(xiàn)已廣泛作為基因轉(zhuǎn)染載體。近年來，將高分子表面氨基進行化學(xué)修飾成為主要 的修飾方式之一，例如在表面氨基上共價連接環(huán)糊精、氨基酸、PEG等修飾基團，可以獲得相 對較好的基因轉(zhuǎn)染效果；另一類修飾方式是在高分子表面氨基上修飾生物素、糖基、多肽片 段或蛋白質(zhì)等基團，可以使高分子作為載體時具有靶向轉(zhuǎn)染效果。上述修飾方式可以優(yōu)化 增強高分子的基因轉(zhuǎn)染效果同時提高其細胞相容性。
[0005]由于脂質(zhì)體的疏水相互作用與細胞膜內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)，使得脂環(huán)化合物修飾的高 分子具有相當好的膜融合能力。以聚酰胺-胺樹形高分子或支化聚乙烯亞胺陽離子聚合物 為基礎(chǔ)，表面氨基修飾鏈烷烴的基因載體，由于脂質(zhì)體的疏水相互作用，細胞攝入能力得到 提高，進而其基因轉(zhuǎn)染效率得到提高，且隨著烷基鏈的長度的增加（十二烷基鏈最佳），細 胞轉(zhuǎn)染效率會相應(yīng)地提高。同時，脂質(zhì)體的疏水相互作用能穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體和核酸形成 的復(fù)合物。然而，這種鏈烷烴與陽離子高分子形成的共價化合物雖然具有較高的基因轉(zhuǎn)染 效率，但是其仍然具有一定的不可忽視的細胞毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)普遍存在的鏈烷烴修飾的高分子材料作為基因轉(zhuǎn)染載體的 缺陷，創(chuàng)新地提出了一種脂環(huán)化合物修飾的高分子材料，利用一系列的陽離子高分子作為 骨架，由脂環(huán)化合物修飾，共價連接到高分子表面，形成含有脂環(huán)化合物功能基團的陽離子 高分子聚合物。同樣作為脂質(zhì)體，脂環(huán)化合物利用其疏水相互作用在提高細胞攝入能力、增 加基因轉(zhuǎn)染效率的同時，表現(xiàn)出優(yōu)于鏈烷烴修飾的高分子材料的生物相容性，彌補鏈烷烴 修飾的高分子作為基因轉(zhuǎn)染載體的不足。本發(fā)明的脂環(huán)化合物修飾的高分子材料可作為易 于合成、高轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定、高效、安全、價格低廉，同時細胞毒性小，生物相容性高 的基因轉(zhuǎn)染載體進行應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供一種高分子材料，S卩脂環(huán)化合物修飾的高分子材料，其包括高分子骨 架和脂環(huán)化合物功能基團；所述高分子骨架為陽離子高分子骨架；所述脂環(huán)化合物功能基 團與所述高分子骨架表面共價連接，即所述高分子的伯胺基團與脂環(huán)化合物通過化學(xué)反應(yīng) 共價相連。
[0008] 其中，所述高分子材料的結(jié)構(gòu)如式（1)所示：
[0009] R-(Y_S)X 式（1)
[0010] 式（1)中，Y為NHCONH，NHCSNH，NHCH0HCH2,NHCH2CH0H，NH或NHC0 基團；
[0011] S為所述脂環(huán)化合物功能基團；
[0012] R為所述陽離子高分子骨架；
[0013]x為 1-1024 的整數(shù)。
[0014] 其中，所述S為如式（2)所示的環(huán)戊烷、如式（3)所示的環(huán)己烷、如式（4)所示的 環(huán)庚烷、如式（5)所示的環(huán)辛烷、如式（6)所示的環(huán)壬烷、如式（7)所示的金剛烷、如式（8) 所示的環(huán)十一烷或如式（9)所示的環(huán)十二烷：
[0015]
[0016] 其中，所述S作為脂環(huán)化合物，優(yōu)選地，為環(huán)戊烷（式2)、環(huán)庚烷（式4)、金剛烷 (式7)或環(huán)十二烷（式9)。
[0017] 其中，所述R為聚酰胺-胺樹形高分子、聚丙烯亞胺樹形高分子、聚賴氨酸樹形高 分子、支化聚乙烯亞胺陽離子聚合物或線性聚乙烯亞胺陽離子聚合物，即，所述R為如式 (10)所示的聚酰胺-胺樹形高分子、式（11)所示的聚丙烯亞胺樹形高分子、式（12)所示的 聚賴氨酸樹形高分子、如式（13)所示的支化聚乙烯亞胺陽離子聚合物或如式（14)所示的 線性聚乙烯亞胺陽離子聚合物；
[0018]
[0019] 其中，在式（10)、式（11)及式（12)中，M為高分子材料的核心，包括氨、乙二胺、丁 二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1，12-十二烷二胺；n為1-10的整數(shù)；m為2-4的整數(shù)。
[0020] 在式（13)中，n為支化單元重復(fù)數(shù)量，所述支化聚乙烯亞胺陽離子聚合物的分子 量為 600-100000 ;
[0021] 在式（14)中，n代表乙烯亞胺的重復(fù)數(shù)量，所述線性聚乙烯亞胺陽離子聚合物的 分子量為600-100000。
[0022] 優(yōu)選地，所述R為聚酰胺-胺樹形高分子或支化聚乙烯亞胺陽離子聚合物。
[0023] 本發(fā)明還提出了一種如式（1)所示的脂環(huán)化合物修飾的高分子材料的制備方法， 將所述脂環(huán)化合物和所述高分子溶解于水或有機溶劑，充分攪拌反應(yīng)后，除去未反應(yīng)的脂 環(huán)化合物以及相關(guān)溶劑，即得到所述的基于高分子和脂環(huán)化合物的高分子材料。
[0024] 由本發(fā)明的制備方法得到的高分子材料的結(jié)構(gòu)如式（1)所示：
[0025] R-(Y-S)X 式（1)，
[0026] 式（1)中，
[0027]Y為NHCONH，NHCSNH，NHCH0HCH2,NHCH2CH0H，NH或NHC0基團；
[0028] S為脂環(huán)化合物功能基團；
[0029] R為陽離子高分子骨架；
[0030] x為 1-1024 的整數(shù)。
[0031] 本發(fā)明的制備方法將脂環(huán)化合物共價連接到高分子骨架的表面上，即高分子的伯 胺基團與脂環(huán)化合物通過化學(xué)反應(yīng)相連，從而制備得到如式（1)所示的可以作為基因轉(zhuǎn)染 材料的脂環(huán)化合物修飾的高分子材料。
[0032] 本發(fā)明的制備方法中，所述高分子骨架R為聚酰胺-胺樹形高分子、聚丙烯亞胺樹 形高分子、聚賴氨酸樹形高分子、支化聚乙烯亞胺陽離子聚合物或線性聚乙烯亞胺陽離子 聚合物。其中，
[0033] 其中，所述R為陽離子高分子，優(yōu)選地，為聚酰胺-胺樹形高分子（式10)或支化 聚乙烯亞胺陽離子聚合物（式13)。
[0034] 其中，所述高分子表面為伯胺基團。
[0035] 本發(fā)明制備方法中，所述脂環(huán)化合物功能基團S為環(huán)戊烷、環(huán)庚烷、環(huán)辛烷、環(huán)壬 烷、金剛烷、環(huán)癸烷或環(huán)十二烷。優(yōu)選地，為環(huán)戊烷、環(huán)庚烷、金剛烷或環(huán)十二烷作為與高分 子反應(yīng)的主要單體。
[0036] 本發(fā)明制備方法中，將所述脂環(huán)化合物S和所述高分子R溶解于水或有機溶劑，充 分攪拌反應(yīng)，然后分離提純，得到所述高分子材料。所述有機溶劑為甲醇，乙醇，二甲亞砜， N，N-二甲基甲酰胺，或四氫呋喃等。
[0037] 本發(fā)明還提出了如式（1)所示的基于脂環(huán)化合物修飾的高分子材料作為生物大 分子的輸送載體的應(yīng)用。例如，如式（1)所示的基于脂環(huán)化合物修飾的高分子材料作為 基因轉(zhuǎn)染材料在體外作為核酸分子的輸送載體。其中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、 microRNA或修飾的核酸。
[0038] 本發(fā)明還提出了一種新的復(fù)合物，其包括如式（1)所示的基因轉(zhuǎn)染材料即基于脂 環(huán)化合物修飾的高分子材料和生物大分子。所述生物大分子優(yōu)選為核酸，由如式（1)所示 的基因轉(zhuǎn)染載體即基于脂環(huán)化合物修飾的高分子材料攜帶所述核酸。所述核酸包括DNA、 siRNA、shRNA、microRNA或修飾的核酸。例如，在室溫下，將所述基因轉(zhuǎn)染載體和熒光素酶 siRNA形成復(fù)合物，在該復(fù)合物中，由所述基因轉(zhuǎn)染載體攜帶核酸。
[0039] 基于穩(wěn)定表達熒光素酶的Hela細胞即Hela-luci細胞系，以熒光素酶基因作為 報告基因，以焚光素（luciferin)為底物來檢測螢火蟲焚光素酶（fireflyluciferase) 的活性這一報告系統(tǒng)，利用本發(fā)明如式（1)所示的高分子材料輸送熒光素酶的干擾 RNA(siRNA)，通過比較熒光素酶的活性，來評估高分子材料基因轉(zhuǎn)染的效果。本發(fā)明如式 (1)所示的高分子