誘導普通小球藻zf藻株高效積累花生四烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種誘導普通小球藻ZF藻株高效積累花生四烯酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]小球藻(Chlorella)是一種常見的水生單細胞藻類，是綠藻小球藻科中的一個重要屬，生態(tài)分布廣泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大約10個種。小球藻細胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)(干重的50%)、必需氨基酸、多糖、脂類(脂肪酸積累的結(jié)果)、葉綠素、胡蘿卜素、和維生素等等，在保健食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖(飼料添加劑)、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域內(nèi)應用廣泛，國內(nèi)外市場供不應求。與美國、日本、以色列等國家相比，我國的小球藻工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)水平相對滯后。普通小球藻ZF藻株是一種球形單細胞淡水藻類，通常生長在富營養(yǎng)化的水體中，但在人工培養(yǎng)條件下能大量生長繁殖。營養(yǎng)鹽(氮、磷等)、光照、pH值、溫度、微量元素(鐵、錳、砸等)、碳酸氫銨、等因素均能影響小球藻生長。
[0003]花生四烯酸(AA)，化學名稱為5，8，11，14一二十碳四烯酸，其含有20個碳原子，4個不飽和鍵，屬于n-6系列的長鏈多不飽和脂肪酸(PUF A)，簡記為20:4 (n_6)。人們從研究愛斯基摩人心血管疾病發(fā)病率低的現(xiàn)象中了解到，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等長鏈不飽和脂肪酸(PUFA)可以防止膽固醇在動脈血管壁上沉積，預防心血管疾病的發(fā)生，從此開始了對PUFA與疾病以及亞健康人群之間關(guān)系的研究，AA的生理活性也逐漸被人們所認識。AA廣泛分布于動物的中性脂肪中，它是牛乳脂、豬脂肪、牛脂肪、血液、磷脂、肝磷脂和腦磷脂中的一種成分，但含量較少，同時也是腎上腺磷脂混合脂肪酸的一種主要成分。此外，油料種子中也含有AA，它是花生油的主要成分。有研究報道，Sohlek等人在幾種苔蘚和蕨類植物中檢測到了 AA。在日本的沙丁魚中，也分析得到了 AA。真菌中，AA主要分布在原始的幾個綱中，例如卵菌綱(Oomycetes)、絲壺菌綱(Hyphochytrimycete)、壺菌綱(Hytrid1mycetes)和被孢霉屬(Mortierella)。傳統(tǒng)制備AA主要是從深海魚油中提取，其含量一般只有0.2% (W/W)，因受到季節(jié)、產(chǎn)地等因素的影響，魚油中AA的含量不穩(wěn)定并且比較匱乏，故價格十分昂貴。在我國，有關(guān)AA產(chǎn)品的相關(guān)報道很少，有待于大力的研究開發(fā)。微藻是進行植物生長調(diào)節(jié)劑誘導的優(yōu)良材料，其結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、光敏性強、代謝過程極易受環(huán)境影響，也容易被檢測。
[0004]目前，國內(nèi)外已經(jīng)公開了一些制備花生四烯酸的方法工藝的相關(guān)技術(shù)，大多數(shù)是針對一些提純、分離等技術(shù)改良的。如華中科技大學公布了一種花生四烯酸發(fā)酵制配方法(CN1323904A)，其特征在于改良了花生四烯酸大量合成的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，其培養(yǎng)基成本低廉，取材容易，操作過程簡單易行，但發(fā)酵工藝操作流程復雜，生產(chǎn)周期長，并涉及發(fā)酵罐等儀器設(shè)備的使用。馬泰克生物科學有限公司公開了一種花生四烯酸及其生產(chǎn)和使用方法(CN1175976A)，所述的油脂中AA含量與EPA含量之比至少約5: 1，更好10: 1，最好至少20: I。該文獻方法中采用的微生物也是高山被孢霉菌，是通過控制過程中的pH值實現(xiàn)高AA含量的。但是，上述文獻的不足之處在于，在提高AA在油脂中含量的同時，EPA的含量仍較高，其給出的實例中EPA與AA之比最少也超過5%。而高含量的二十碳五烯酸對嬰幼兒的不利影響限制了 AA在嬰幼兒食品中的廣泛應用。而且，現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法及獲得的產(chǎn)品中仍然存在著油脂中花生四烯酸含量偏低，或者EPA含量偏高的缺陷，同時還存在發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基成本高，以及非野生性菌種發(fā)酵存在的生產(chǎn)不穩(wěn)定以及食用安全等諸多問題。華中科技大學和武漢市福星生物藥業(yè)有限公司聯(lián)合公布了一種花生四烯酸油脂及其微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法(CN1539982A)，提供一種篩選的野生高產(chǎn)菌株和相應的花生四烯酸油脂的廉價發(fā)酵生產(chǎn)方法。但該方法涉及發(fā)酵工藝，成本相比而言，還是較高，而且發(fā)酵工藝條件等要求交嚴格。武漢烯王生物工程有限公司提供了一種用離子束生物工程誘變菌生產(chǎn)含花生四烯酸油脂的方法(CN1362522A)，該發(fā)明提供了一種用高活性的離子束生物工程誘變菌生產(chǎn)含花生四烯酸油脂的方法，從而可得到產(chǎn)量高、花生四烯酸含量高、價格便宜的產(chǎn)品，為人類的保健和預防疾病提供了條件。該方法采用采用離子生物工程誘變技術(shù)，操作難度系數(shù)增大，不宜于大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、速度快、造價低、無污染的誘導普通小球藻ZF藻株高效積累花生四烯酸的方法。其具體的技術(shù)方案為:
[0006]—種誘導普通小球藻ZF藻株高效積累花生四烯酸的方法，其特征在于采用如下步驟:
[0007]I)制備藻液:在230C ±2°C、光強1900± 10lx和光暗比為12h/12h的條件下，采用1/4倍BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)普通小球藻ZF藻株細胞28天至對數(shù)生長期，獲得用于植物生長調(diào)節(jié)劑誘導的藻液，培養(yǎng)期間每14天加一次I倍濃度的BGll營養(yǎng)鹽；
[0008]2)積累花生四烯酸:取對數(shù)生長期藻液200mL置于300mL三角錐形瓶中，然后加入植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA在藻液中的濃度為0.1±0.005mg/L，于230C ±2°C進行誘導處理14± I天，處理階段每天人工搖藻不少于3次，相鄰搖藻時間間隔不小于2小時，實現(xiàn)花生四烯酸在藻液中的積累。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點是:
[0010]1、簡單易行，原材料普通小球藻ZF藻株細胞易于培養(yǎng)，周期短，成本低。
[0011]2、能顯著提高普通小球藻ZF藻株細胞內(nèi)花生四烯酸含量，結(jié)果表明，誘導處理后藻細胞花生四烯酸含量為藻細胞干重的1.98-2.03%，分別是對照組藻細胞的3.44-3.53 倍。
【具體實施方式】
[0012]實施例1，采用以下步驟:
[0013]I)制備藻液:在23°C、光強19001x和光暗比為12h/12h的條件下，采用1/4倍BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)普通小球藻ZF藻株細胞28天至對數(shù)生長期，獲得用于植物生長調(diào)節(jié)劑誘導的藻液，培養(yǎng)期間每14天加一次I倍濃度的BGll營養(yǎng)鹽；
[0014]2)積累花生四烯酸:取對數(shù)生長期藻液200mL置于300mL三角錐形瓶中，然后加入北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，使植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA在藻液中的濃度為0.lmg/L，于23°C進行誘導處理14天，處理階段每天人工搖藻不少于3次，相鄰搖藻時間間隔不小于2小時，實現(xiàn)花生四烯酸在藻液中的積累。
[0015]實施例2，采用以下步驟:
[0016]I)制備藻液:在24°C、光強20001x和光暗比為12h/12h的條件下，采用1/4倍BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)普通小球藻ZF藻株細胞28天至對數(shù)生長期，獲得用于植物生長調(diào)節(jié)劑誘導的藻液，培養(yǎng)期間每14天加一次I倍濃度的BGll營養(yǎng)鹽；
[0017]2)積累花生四烯酸:取對數(shù)生長期藻液200mL置于300mL三角錐形瓶中，然后加入北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，使植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA在藻液中的濃度為0.095mg/L，于24°C進行誘導處理15天，處理階段每天人工搖藻不少于3次，相鄰搖藻時間間隔不小于2小時，實現(xiàn)花生四烯酸在藻液中的積累。
[0018]實驗檢測:
[0019]I)富集藻細胞:8000-9000rpm，4°C離心5-8分鐘，得到澡泥，再將藻泥在_40°C冷凍干燥成藻粉。
[0020]2)提取油脂:利用索氏提取法對冷凍干燥后的藻粉進行提取，即得油脂。
[0021]3)對油脂甲酯化:首先向提取到的總油脂中加入3ml 0.4mol/L KOH/甲醇，60°C水浴Ih ;甲冷卻后加入14% BF3 -CH3OH溶液3ml，60°C水浴Ih ;再冷卻后加入20 μ L 1mg/mL十九酸酯，Iml正己烷(色譜純)和Iml飽和NaCl，加入無水硫酸鈉后靜置分層，Iml注射器抽取上層有機相，過濾后保存于1.5mL EP中。
[0022]4)花生四烯酸含量分析:采用氣象色譜分析，色譜柱為HP-FFAP抗氧化交聯(lián)石英毛細管柱，規(guī)格為30mX0.25mmX0.3m;進樣口溫度為260°C，分流比為50: I ;載氣為高純N2,柱流量為lmL/min，總流量55mL/min，壓力114Kpa，線速度29.6cm/s，柱溫由160°C以2 0C /min的速度升至230 °C，保持3min至出峰完畢；FID檢測器，溫度為230 °C，進樣量luL，得到氣象色譜圖。計算結(jié)果為:實施例1所得花生四烯酸含量為藻細胞干重的1.98%，是對照組藻細胞的3.44倍，實施例2所得花生四烯酸含量為藻細胞干重的的2.03%，是對照組藻細胞的3.53倍。
【主權(quán)項】
1.一種普通小球藻ZF藻株高效積累花生四烯酸的方法，其特征在于采用如下步驟: 1)制備藻液:在23°C±2°C、光強1900±1001x和光暗比為12h/12h的條件下，采用1/4倍BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)普通小球藻ZF藻株細胞28天至對數(shù)生長期，獲得用于植物生長調(diào)節(jié)劑誘導的藻液，培養(yǎng)期間每14天加一次I倍濃度的BGll營養(yǎng)鹽； 2)積累花生四烯酸:取對數(shù)生長期藻液200mL置于300mL三角錐形瓶中，然后加入植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA在藻液中的濃度為0.1±0.005mg/L，于230C ±2°C進行誘導處理14± I天，處理階段每天人工搖藻不少于3次，相鄰搖藻時間間隔不小于2小時，實現(xiàn)花生四烯酸在藻液中的積累。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種誘導普通小球藻ZF藻株高效積累花生四烯酸的方法，其特征在于采用如下步驟：1)制備藻液：在23℃±2℃、光強1900±100lx和光暗比為12h/12h的條件下，采用1/4倍BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)普通小球藻ZF藻株細胞28天至對數(shù)生長期，獲得用于植物生長調(diào)節(jié)劑誘導的藻液，培養(yǎng)期間每14天加一次1倍濃度的BG11營養(yǎng)鹽；2)積累花生四烯酸：取對數(shù)生長期藻液200mL置于300mL三角錐形瓶中，然后加入植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA在藻液中的濃度為0.1±0.005mg/L，于23℃±2℃進行誘導處理14±1天，處理階段每天人工搖藻不少于3次，相鄰搖藻時間間隔不小于2小時，實現(xiàn)花生四烯酸在藻液中的積累。本發(fā)明簡單易行、成本低廉，能在短期內(nèi)顯著積累花生四烯酸含量。
【IPC分類】C12R1/89, C12P7/64
【公開號】CN105132483
【申請?zhí)枴緾N201510609476
【發(fā)明人】高政權(quán), 李國強, 孟春曉, 吳冠勛, 郭艷蕓, 付圣貴, 鄧素貞, 沈義成, 胡碩, 孫海風, 張瑞豪, 陳國強
【申請人】山東理工大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月23日