別65%和60% )時(shí)，可鑒定在所述一個(gè)或多個(gè)第一基因座處兩個(gè)胎兒為第一等位 基因的純合子而一個(gè)胎兒為雜合子。當(dāng)所述比率大于第五閾值時(shí)，可鑒定三個(gè)胎兒全部為 第一等位基因的純合子。
[0193] VI.實(shí)施例
[0194] 以下部分提供了說明本發(fā)明的一些原理的非限制性工作實(shí)例。
[0195] A.從雙卵性雙胎獲得并測量DNA
[0196] 經(jīng)知會(huì)同意，在香港威爾斯親王醫(yī)院婦產(chǎn)科（Department of Obstetrics and Gynaecology of the Prince of Wales Hospital, Hong Kong)征募兩名各自雙胎妊娠的 孕婦。在懷孕21周和25周采集血樣。分娩后單獨(dú)地從每個(gè)胎兒采集臍帶血。這項(xiàng)研究經(jīng) 香港中文大學(xué)-新界東醫(yī)院聯(lián)網(wǎng)臨床研究倫理聯(lián)席委員會(huì)（Joint Chinese University of Hong Kong - Hospital Authority New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee)批準(zhǔn)。
[0197] 在4°(：下1，60(^離心母體血樣10分鐘。在4°(：下16,00(^再次離心血漿部分 10分鐘以去除任何殘留的血細(xì)胞。在室溫下2, 500g離心血細(xì)胞部分5分鐘以去除任何 殘留的血漿。用 DSP? DNA Blood Mini Kit?(Qiagen)提取血漿 DNA。用 QIAamp? DNA Blood Mini Kit?(Qiagen)提取臍帶血DNA。用Affymetrix?基因組-全人類SNP陣列 6. 0System?(Affymetrix)為從臍帶血樣品中提取的基因組DNA進(jìn)行基因型分析。通過基 因型分析確認(rèn)每位受試者中兩對雙胞胎均為雙卵性。
[0198] 用雙末端樣品制備試劑盒TM(Illumina)構(gòu)建血漿DNA測序庫。使用約30ng的 DNA制備每個(gè)庫。然后使用定制設(shè)計(jì)的 SureSelect Target Enrichment System?(Agilent Technologies)使這些庫進(jìn)行祀標(biāo)富集。捕獲庫覆蓋分布于14條染色體（chr)上的 5. 5Mb 基因組區(qū)域，如下：chrl (0? 33Mb)、chr2 (0? 30Mb)、chr3 (0? 62Mb)、chr4 (0? 32Mb)、 chr5(0? 33Mb)、chr7(0? 31Mb)、chr8(0? 62Mb)、chr9(0? 31Mb)、chrl3(0? 30Mb)、 chrl5 (0? 33Mb)、chrl7 (0? 66Mb)、chrl9 (0? 35Mb)、chr20 (0? 34Mb)和 chr22 (0? 30Mb)。
[0199] 在Hi-Seq 2000測序儀（Illumina)上通過標(biāo)準(zhǔn)雙末端方法（Illumina)為所述庫 測序，每個(gè)末端的讀數(shù)長度為50bp。用測序流動(dòng)池的2個(gè)泳道為每個(gè)庫測序。使用S0AP2 算法將所有序列讀數(shù)與重復(fù)序列未屏蔽的人類參考基因組（HglS)比對。
[0200] 通過母體血漿中父系遺傳性胎兒等位基因的百分比濃度測定胎兒DNA的百分比 濃度。根據(jù)母體血漿中有兩個(gè)不同等位基因的任何SNP基因座處其作為次要等位基因的存 在，鑒定父系遺傳性胎兒等位基因。
[0201 ] 根據(jù)母體血漿中父系遺傳性胎兒等位基因的百分比濃度的分布，估計(jì)母體血漿中 胎兒DNA的總百分比濃度。對于情況1和2而言，測定胎兒DNA百分比濃度分別為22. 6% 和30. 6%。使用所有信息基因座處胎兒DNA百分比濃度的分布測定單個(gè)雙胎胎兒對母體血 漿DNA的貢獻(xiàn)。
[0202] B.分析與結(jié)論
[0203] 用于這種分析目的的信息基因座是母體為純合子但是至少一個(gè)胎兒為雜合子并 且已經(jīng)從父體遺傳了不同等位基因的那些SNP基因座。對于情況1而言，母體血漿中兩個(gè) 胎兒貢獻(xiàn)的胎兒DNA百分比濃度為10%和11. 6%。對于情況2而言，母體血漿中兩個(gè)胎兒 貢獻(xiàn)的胎兒DNA百分比濃度為12. 4%和18. 2%。
[0204] 對每位孕婦，進(jìn)行RHDO分析以確定兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了相同還是不同的母系單 倍型。在本實(shí)施例中使用位于染色體4長臂上的區(qū)域說明RHDO分析。根據(jù)胎兒臍帶血的 基因型分析，對于情況1的該區(qū)域而言，兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了不同的母系單倍型。對于情況 2而言，兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了相同的母系單倍型。使用家系分析確定父系基因型。在這項(xiàng) RHDO分析中，僅使用母體為雜合子而父體為純合子的SNP基因座。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)確 定了父系單倍型的遺傳時(shí)，母體和父體均為雜合子的SNP基因座也可用于RHDO分析。
[0205] 在這項(xiàng)分析中，使用概率比閾值確定使用a類和P類3即（(!/|3比率）測定的 百分比濃度是否與雙胎胎兒的哪個(gè)母系單倍型遺傳模式最相適宜。對于每種情況而言，根 據(jù)兩個(gè)胎兒的百分比濃度對a/0比率進(jìn)行模擬分析。在二項(xiàng)式分布中生成5, 000個(gè)數(shù)據(jù) 點(diǎn)以模擬對于a類5即和P類SNP而言共有等位基因的百分比濃度分布的序列讀數(shù)。確 定了對于（a)兩個(gè)胎兒均已遺傳了相同母系單倍型，或（b)兩個(gè)胎兒已遺傳了不同母系單 倍型的情況而言，a/0比率的分布。
[0206] 圖14A和14B分別顯示了情況1和情況2的預(yù)期a / 0比率的分布。根據(jù)兩種 可能遺傳模式的a/0比率的預(yù)期分布，測定截?cái)嗔恳员鎰e兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了相同還是 不同的母系單倍型。在該特定實(shí)施例中，使用1200的讓步比計(jì)算上下限閾值。a/0比率 大于上限閾值表明兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了相同母系單倍型并且a/0比率小于下限閾值表 明兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了不同母系單倍型。對于情況1而言，由模擬分析推斷的上下限閾值 分別為1. 113和1. 098。對于情況2而言，由模擬分析推斷的上下限閾值分別為1. 170和 1. 158〇
[0207] 圖15是顯示了情況1的染色體4長臂上染色體片段的RHDO分析的表1500。因 為這種分析的統(tǒng)計(jì)功效取決于分析的序列讀數(shù)的數(shù)量，所以將5, 000用作分類區(qū)段中序列 讀數(shù)數(shù)量的閾值要求。換言之，每個(gè)RHDO分類區(qū)段中SNP的數(shù)量將可變并且在分析中這些 SNP基因座的總測序讀數(shù)將大于5, 000。對于第一RHDO分類區(qū)段而言，測定a/ 0比率為 0. 97837,比由模擬分析推斷的下限閾值1. 098小。
[0208] 這個(gè)結(jié)果是對于該區(qū)域而言，兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了兩個(gè)不同的母系單倍型。第一 分類區(qū)段下游的SNP用于進(jìn)一步RHDO分析并且結(jié)果表明兩個(gè)胎兒遺傳不同的母系單倍型。 該區(qū)域內(nèi)總計(jì)9個(gè)RHDO分類區(qū)段顯示相同結(jié)論。通過兩個(gè)胎兒的基因型結(jié)果確認(rèn)這些結(jié) 果正確。
[0209] 圖16是顯示了情況2的染色體4長臂上染色體片段的RHDO分析的表1600。對于 RHDO分類區(qū)段1，測定a/0比率為1. 299,比由模擬分析推斷的上限閾值1. 170大。
[0210] 這個(gè)結(jié)果表明對于該區(qū)域而言，兩個(gè)胎兒已經(jīng)遺傳了相同的母系單倍型。另外，使 用a類SNP測定的百分比濃度高于使用P類5即測定的百分比濃度。這表明兩個(gè)胎兒已 經(jīng)遺傳了母系Hap I (圖10A)。
[0211] 第一分類區(qū)段中所述區(qū)域下游的SNP用于進(jìn)一步RHDO分析并且該區(qū)域內(nèi)總計(jì)9 個(gè)RHDO分類區(qū)段顯示相同結(jié)論。通過兩個(gè)胎兒的基因型結(jié)果確認(rèn)這些結(jié)果正確。
[0212] VII.計(jì)算機(jī)系統(tǒng)
[0213] 本文提到的任何計(jì)算機(jī)系統(tǒng)均可利用任何適合數(shù)量的子系統(tǒng)。圖17中顯示了計(jì) 算機(jī)設(shè)備10中此類子系統(tǒng)的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括單臺(tái)計(jì)算機(jī)設(shè)備， 其中所述子系統(tǒng)可為所述計(jì)算機(jī)設(shè)備的組件。在其它實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括多臺(tái) 計(jì)算機(jī)設(shè)備，每一臺(tái)均為帶內(nèi)部組件的子系統(tǒng)。
[0214] 圖17所示的子系統(tǒng)經(jīng)由系統(tǒng)總線75相連。顯示了附加子系統(tǒng)，例如打印機(jī)74、 鍵盤78、存儲(chǔ)設(shè)備79、耦合至顯示適配器82的監(jiān)控器76等。耦合至I/O控制器71的外 圍設(shè)備和輸入/輸出（I/O)設(shè)備可通過本領(lǐng)域中已知的任何數(shù)量的裝置，例如輸入/輸出 (I/O)端口 977(例如，USB、FireWire")連接到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。例如，I/O端口 77或外部接 口 81 (例如以太網(wǎng)（Ethernet)、Wi-Fi等）可用于將計(jì)算機(jī)系統(tǒng)10連接到廣域網(wǎng)例如互聯(lián) 網(wǎng)、鼠標(biāo)輸入設(shè)備或掃描儀。經(jīng)由系統(tǒng)總線75互連允許中央處理器73與每個(gè)子系統(tǒng)通信 并且控制來自于系統(tǒng)存儲(chǔ)器72或存儲(chǔ)設(shè)備79(例如，硬盤（例如硬盤驅(qū)動(dòng)器或光盤））的 指令的執(zhí)行，以及子系統(tǒng)間信息的交換。系統(tǒng)存儲(chǔ)器72和/或存儲(chǔ)設(shè)備79可具體化計(jì)算 機(jī)可讀介質(zhì)。本文提到的任何數(shù)據(jù)均可從一個(gè)組件輸出到另一個(gè)組件并且可輸出給用戶。
[0215] 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括，例如通過外部接口 81或通過內(nèi)部接口連接在一起的多個(gè)相 同組件或子系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或設(shè)備可通過網(wǎng)絡(luò)通信。在此類 情況下，將一臺(tái)計(jì)算機(jī)視為客戶端而將另一臺(tái)計(jì)算機(jī)視為服務(wù)器，其中每一臺(tái)均可為相同 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一部分?？蛻舳撕头?wù)器各自可包括多個(gè)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或組件。
[0216] 應(yīng)理解可呈控制邏輯形式，使用硬件（例如專用集成電路）和/或使用計(jì)算機(jī)軟 件，用一般可編程的處理器以模塊化或集成方式執(zhí)行本發(fā)明的任何實(shí)施方案。如本文所使 用，處理器包括相同集成芯片上的多核處理器，或單一電路板上或聯(lián)網(wǎng)的多個(gè)處理單元。根 據(jù)本文提供的公開內(nèi)容和教導(dǎo)，本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將了解并認(rèn)識(shí)到使用硬件及硬件 和軟件的組合執(zhí)行本發(fā)明的實(shí)施方案的其它方式和/或方法。
[0217] 本申請中描述的任何軟件組件或功能均可作為將由處理器執(zhí)行的軟件代碼，使用 任何適合的計(jì)算機(jī)語言，例如Java、C、C++、C#或腳本語言例如Perl或Python，使用例如常 規(guī)或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)實(shí)現(xiàn)。軟件代碼可作為一系列指令或命令存儲(chǔ)在用于存儲(chǔ)和/或傳輸 的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上，適合的介質(zhì)包括隨機(jī)存取存儲(chǔ)器（RAM)、只讀存儲(chǔ)器（R0M)、磁介質(zhì) (例如硬盤驅(qū)動(dòng)器或軟盤）或光學(xué)介質(zhì)（例如光盤（CD)或數(shù)字多用盤（DVD))、閃速存儲(chǔ)器 等。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可為此類存儲(chǔ)或傳輸設(shè)備的任何組合。
[0218] 此類程序也可使用適于經(jīng)由與各種協(xié)議相符的有線、光纖和/或無線網(wǎng)絡(luò)，包括 互聯(lián)網(wǎng)傳輸?shù)妮d波信號編碼和傳輸。同樣，可使用用此類程序編碼的數(shù)據(jù)信號產(chǎn)生根據(jù)本 發(fā)明實(shí)施方案所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。用程序代碼編碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可與兼容設(shè)備一 起包裝或與其它設(shè)備分開（例如，經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng)下載）提供。任何此類計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)均可 存在于單個(gè)計(jì)算機(jī)產(chǎn)品（例如硬盤驅(qū)動(dòng)器、CD或整個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）上或內(nèi)部，并且可存在 于系統(tǒng)或網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的不同計(jì)算機(jī)產(chǎn)品上或內(nèi)部。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括監(jiān)控器、打印機(jī)，或用于為 用戶提供本文提到的任何結(jié)果的其它適合顯示器。
[0219] 可用包括可配置用于進(jìn)行所述步驟的一個(gè)或多個(gè)處理器的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)完全或部 分地進(jìn)行本文所述任何方法。因此，實(shí)施方案可涉及配置用于進(jìn)行本文所述任何方法的步 驟的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，可能有進(jìn)行各個(gè)步驟或各組步驟的不同組件。雖然作為編號步驟呈現(xiàn)，但 是本文方法的步驟可同時(shí)或按不同順序進(jìn)行。另外，這些步驟中的一部分可與來自于其它 方法的其它步驟中的一部分一起使用。同樣，整個(gè)步驟或一部分可任選。另外，任何方法的 任何步驟均可用用于進(jìn)行這些步驟的模塊、電路或其它裝置進(jìn)行。
[0220] 在不背離本發(fā)明實(shí)施方案的精神和范圍的前提下，特定實(shí)施方案的具體細(xì)節(jié)可以 任何適合方式組合。然而，本發(fā)明的其它實(shí)施方案可涉及關(guān)于每個(gè)單獨(dú)方面或這些單獨(dú)方 面的特定組合的特定實(shí)施方案。
[0221] 為了說明和描述的目的，已經(jīng)提出了以上對本發(fā)明示例性實(shí)施方案的描述。其并 非旨在詳盡無遺或?qū)⒈景l(fā)明限于所述精確形式，并且根據(jù)以上教導(dǎo)許多修改和變化是可能 的。選擇并描述實(shí)施方案以便最好地解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域中 的其它技術(shù)人員能夠最好地將本發(fā)明用于不同實(shí)施方案中并且做出適于預(yù)期特定用途的 各種修改。
[0222] 除非明確指出相反，則敘述"一種"、"一個(gè)"或"所述"旨在意為"一個(gè)或多個(gè)"。
[0223] 本文提到的所有專利、專利申請、出版物和描述均以引用的方式整體并入用于所 有目的。沒有承認(rèn)為現(xiàn)有技術(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種確定在由雄性受精的雌性的兩個(gè)胎兒中母系單倍型的遺傳的方法，所述方法包 括： 鑒定第一染色體上第一組的一個(gè)或多個(gè)第一基因座，其中所述雌性在每個(gè)第一基因座 處為各個(gè)第一等位基因和各個(gè)第二等位基因的雜合子，第一母系單倍型具有所述第一等位 基因并且第二母系單倍型具有所述第二等位基因； 確定所述兩個(gè)胎兒從所述雄性遺傳了所述第一基因座處的所述各個(gè)第一等位基因； 鑒定所述第一染色體上第二組的一個(gè)或多個(gè)第二基因座，其中在所述第二組的每個(gè)第 二基因座處，所述第一母系單倍型具有各個(gè)第三等位基因并且所述第二母系單倍型具有各 個(gè)第四等位基因，并且 確定所述兩個(gè)胎兒從所述雄性遺傳了所述第二基因座處的所述各個(gè)第三等位基因； 測量在來自于所述雌性的生物樣品的DNA片段中存在于所述第一基因座的所述各個(gè) 第一等位基因的第一量和所述各個(gè)第二等位基因的第二量，所述生物樣品包括所述雌性和 所述兩個(gè)胎兒的游離DNA ; 測量在所述生物樣品的DNA片段中存在于所述第二基因座的所述各個(gè)第三等位基因 的第三量和所述各個(gè)第四等位基因的第四量；并且 通過以下確定所述兩個(gè)胎兒中母系單倍型的遺傳： (i) 當(dāng)所述第一量在統(tǒng)計(jì)上高于所述第二量并且所述第三量在統(tǒng)計(jì)上等于所述第四量 時(shí)，將兩個(gè)胎兒鑒定為已經(jīng)遺傳了所述第一母系單倍型， (ii) 當(dāng)所述第一量在統(tǒng)計(jì)上等于所述第二量并且所述第四量在統(tǒng)計(jì)上高于所述第三 量時(shí)，將兩個(gè)胎兒鑒定為已經(jīng)遺傳了所述第二母系單倍型，或 (iii) 當(dāng)所述第一量在統(tǒng)計(jì)上高于所述第二量時(shí)并且當(dāng)所述第四量在統(tǒng)計(jì)上高于所述 第三量時(shí)，將所述胎兒其中之一鑒定為遺傳了所述第一母系單倍型而將另一個(gè)胎兒鑒定為 遺傳了所述第二母系單倍型。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括： 通過以下確定所述第一量在統(tǒng)計(jì)上高于所述第二量并且所述第三量在統(tǒng)計(jì)上等于所 述第四量： 計(jì)算所述第一量與所述第二量的第一比率； 計(jì)算所述第三量與所述第四量的第二比率； 計(jì)算所述第一比率與所述第二比率的第三比率；并且 將所述第三比率與閾值比較。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括： 通過以下確定所述第一量在統(tǒng)計(jì)上高于所述第二量時(shí)并且所述第四量在統(tǒng)計(jì)上高于 所述第三量： 計(jì)算所述第一量與所述第二量的第一比率； 計(jì)算所述第四量與所述第三量的第二比率； 計(jì)算所述第一比率與所述第二比率的第三比率；并且 將所述第三比率與閾值比較。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中比較所述第三比率與所述閾值確定了所述第三比 率是否在統(tǒng)計(jì)上等于1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中鑒定第一染色體上第一組的一個(gè)或多個(gè)第一基因