確定多胎妊娠的胎兒基因組的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請案的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的名稱為"確定多胎妊娠的胎兒基因組 (Determining Fetal Genomes For Multiple Fetus Pregnancies)'，的美國臨時申請第 61/789, 992號的優(yōu)先權，其全部內容以引用的方式并入本文用于所有目的。
[0003] 本申請與Lo等的名稱為"Fetal Genomic Analysis From A Maternal Biological Sample"的共有美國專利公布第2011/0105353號；和Lo等的名稱為"Molecular Testing Of Multiple Pregnancies"的美國專利公布第US 2013/0059733號相關，所述美國專利公 布的公開內容以引用的方式整體并入。
技術領域
[0004] 本發(fā)明總體上涉及根據母體樣品分析胎兒基因組，并且更特別地涉及根據對母體 樣品中遺傳片段的分析，測定多肽妊娠的全部或部分胎兒基因組。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 1997年在母體血漿中發(fā)現(xiàn)游離的胎兒核酸為無創(chuàng)性產前診斷開辟了新的可能 性（Lo Y M D等Lancet 1997;350:485-487;和美國專利第6,258,540號）。這種技術已 經迅速轉變?yōu)榕R床應用，檢測胎兒來源的、父系遺傳性基因或序列，例如用于胎兒性別確 定、胎兒RhD狀態(tài)確定及確定胎兒是否已經遺傳了父系遺傳性突變（Amicucci P等Clin Chem 2000;46:301-302 ;Saito H 等 Lancet 2000 ;356:1170;和 Chiu R W K 等 Lancet 2002 ;360:998-1000)。該領域的最新進展已經使得能夠由母體血漿核酸分析產前診斷出 胎兒染色體非整倍性，例如三體性21(Lo Y M D等Nat Med 2007;13:218-223 ;Tong Y K 等 Clin Chem 2006;52:2194-2202;美國專利公布 2006/0252071 ;Lo Y M D 等 Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:13116-13121;Chiu R W K等Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:20458-20463 ;Fan H C 等 Proc Natl Acad Sci 2008;105:16266-16271;美國專利公 布 2007/0202525 ;和美國專利公布 2009/0029377)。
[0007] 重大最新進展的另一方面是使用單分子計數方法，例如數字PCR對單基因疾病進 行無創(chuàng)性產前診斷，其中母體和父體均攜帶相同突變。這已經通過對母體血漿的相對突變 劑量（RMD)分析實現(xiàn)（美國專利公布 2009/0087847 ;Lun F M F 等 Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:19920-19925;和 Chiu R W K 等 Trends Genet 2009;25:324-331)。
[0008] 然而，此類方法使用可能突變的先驗知識來分析基因組的特定部分，因此不可能 鑒定潛伏或罕見突變或遺傳病。進一步地，按照慣例已經通過超聲掃描（Chauhan SP等Am J ObstetGynecol 2010;203:305-315)或創(chuàng)性產前診斷（例如羊膜穿刺術）（Chen CP等Hum R印rod 2000;15:929-934)獲得了關于雙胎妊娠的接合性的信息。
[0009] 因此，需要提供可使用無創(chuàng)性技術鑒定多胎妊娠的全部或部分胎兒基因組的新方 法、系統(tǒng)和裝置。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明的方法提供了在有多個胎兒的妊娠期內確定母系和父系單倍型的遺傳的 方法、系統(tǒng)和裝置?？稍谀阁w為雜合子并且父系遺傳性等位基因已知（例如，父體為純合 子）的基因座處確定母系遺傳?？墒褂脙煞N類型的基因座，其中一種類型具有在第一母系 單倍型上出現(xiàn)的父系等位基因，而另一種類型具有在第二母系單倍型上出現(xiàn)的父系等位基 因?？捎筛阁w為雜合子而母體為純合子的基因座確定父系遺傳?？蓽y量每個基因座處不同 等位基因的量。量的比較（例如，使用每個等位基因的百分比濃度和閾值）可用于確定單 倍型遺傳。單倍型可與目標病狀相關聯(lián)。
[0012] -些實施方案涉及與本文所述方法相關的系統(tǒng)和計算機可讀介質。
[0013] 參考以下詳細描述和附圖可獲得對本發(fā)明實施方案的特性和優(yōu)點的更好理解。
[0014] 附圖簡述
[0015] 圖1顯示了根據本發(fā)明的實施方案，母體為純合子而父體為雜合子的兩個基因座 的實例。
[0016] 圖2是根據本發(fā)明的實施方案，確定多胎妊娠的胎兒中父系單倍型遺傳的方法 200的流程圖。
[0017] 圖3顯示了根據本發(fā)明的實施方案，具有兩種類型的基因座的標志的假定父體和 母體的單倍型。
[0018] 圖4A顯示了對于圖3所示基因座而言兩個胎兒均已從母體遺傳了 Hap I的實例。 圖4B顯示了當兩個胎兒均已從母體遺傳了 Hap I時，母體血漿中父體和母體共有的等位基 因（A等位基因）的百分比濃度的實例計算。
[0019] 圖5A顯示了對于圖3所示基因座而言兩個胎兒均已從母體遺傳了 Hap II的實例。 圖5B顯示了當兩個胎兒均已從母體遺傳了 Hap II時，母體血漿中父體和母體共有的等位 基因（A等位基因）的百分比濃度的實例計算。
[0020] 圖6A顯示了對于圖3所示基因座而言一個胎兒已從母體遺傳了 Hap I并且一個 胎兒已從母體遺傳了 Hap II實例。圖6B顯示了當一個胎兒已從母體遺傳了 Hap I并且另 一個胎兒已從母體遺傳了 Hap II時，母體血漿中父體和母體共有的等位基因（A等位基因） 的百分比濃度的實例計算。
[0021] 圖7A顯示了對于兩個胎兒的母系單倍型遺傳的三種不同情況而言，母系特異性 等位基因（B等位基因）及父體和母體共有的等位基因（A等位基因）的百分比濃度。
[0022] 圖7B說明了如何使用每個信息SNP基因座處的單獨百分比濃度估計對于特定類 型的所有基因座而言，共有等位基因（A等位基因）的百分比濃度。
[0023] 圖8是根據本發(fā)明的實施方案，使用兩種類型的基因座確定母系單倍型遺傳的方 法800的流程圖。
[0024] 圖9是根據本發(fā)明的實施方案，使用一種類型的基因座確定母系單倍型遺傳的方 法900的流程圖。
[0025] 圖IOA顯示了在兩個胎兒均已從母體遺傳了 Hap I時，當胎兒貢獻不同的胎兒DNA 百分比時對于a類和0類SNP而言母體血漿中共有等位基因（A等位基因）的百分比濃 度。
[0026] 圖IOB顯示了在兩個胎兒均已從母體遺傳了 Hap II時，當胎兒貢獻不同的胎兒 DNA百分比時對于a類和P類SNP而言母體血漿中共有等位基因（A等位基因）的百分比 濃度。
[0027] 圖IlA顯示了在一個胎兒已從母體遺傳了 Hap I并且另一個胎兒從母體遺傳了 Hap II時，當胎兒貢獻不同的胎兒DNA百分比時對于a類和P類SNP而言母體血漿中共 有等位基因（A等位基因）的百分比濃度。
[0028] 圖IlB顯示了使用a類和0類SNP的A等位基因和三種情況下這兩種濃度的比 率的表1150。
[0029] 圖12是根據本發(fā)明的實施方案，使用來自于兩種類型的基因座的值的比率確定 母系單倍型遺傳的方法1200的流程圖。
[0030] 圖13是根據本發(fā)明的實施方案，母體和父體為雜合子時，確定在由雄性受精的雌 性的兩個胎兒中母系單倍型的遺傳的方法1300。
[0031] 圖14A和14B分別顯示了情況1和情況2的預期a / 0比率的分布。
[0032] 圖15是顯示了情況1的染色體4長臂上染色體片段的RHDO分析的表1500。
[0033] 圖16是顯示了情況2的染色體4長臂上染色體片段的RHDO分析的表1600。
[0034] 圖17顯示了可與根據本發(fā)明的實施方案所述的系統(tǒng)和方法一起使用的示例計算 機系統(tǒng)10的方框圖。
[0035] 定義
[0036] 如本公開中所使用的術語"生物樣品"指取自受試者（例如，人（例如孕婦））并且 含有一種或多種目標核酸分子的任何樣品。用于本發(fā)明實踐中的樣品包括血漿、血清、血細 胞、白細胞、網織紅細胞和全血。出于一些目的，也可使用唾液、胸膜液、汗、腹水、膽汁、尿、 胰液、糞便或子宮頸涂片樣品。
[0037] 術語"基因座（locus) "或其復數形式"基因座（loci) "是基因組上有變化的任何 長度的核苷酸（或堿基對）的位置或地址。
[0038] 如本文所使用，術語"基因座"或其復數形式"基因座"是基因組上有變化的任何 長度的核苷酸（或堿基對）的位置或地址。術語"等位基因"指在相同物理基因組基因座 處，可能產生或可能不產生不同表型性狀的替代性DNA序列。在具有每條染色體（除男性 人類受試者中的性染色體外）的兩個拷貝的任何特定二倍體生物中，每個基因的基因型均 包括存在于該基因座處，在純合子中相同而在雜合子中不同的成對等位基因。一個種群或 一個物種的生物通常在不同個體間在每個基因座處包括多個等位基因。在種群中發(fā)現(xiàn)一個 以上等位基因的基因組基因座稱為多態(tài)性位點。在基因座處的等位變異可測，作為存在的 等位基因的數量（即，多態(tài)性程度）或種群中雜合子的比例（即，雜合率）。序列（例如基 因）的存在或缺乏也視為一類等位變異，因為基因座可包括所述序列或不包括所述序列。 例如，可通過一般在缺失序列之前和之后出現(xiàn)的序列連接鑒定序列（例如RHD基因）的這 種缺乏。如本文所使用，術語"多態(tài)性"指人類基因組中的任何個體間變異，而不管其頻率。 此類變異的實例包括但不限于單核苷酸多態(tài)性、簡單串聯(lián)重復多態(tài)性、插入_缺失多態(tài)性、 突變（可致病）和拷貝數變異。
[0039] 術語"單倍型"指在同一染色體或染色體區(qū)域上進行共同遺傳的在多個基因座處 的等位基因的組合。單倍型可指少至一對基因座或指染色體區(qū)域或指整條染色體。
[0040] "染色體區(qū)域"指特定染色體的多個核苷酸位置。染色體區(qū)域可為整條染色體或較 小分段。在正常人中，染色體區(qū)域將具有兩個單倍型，一個對于所述區(qū)域所在染色體的每個 拷貝而言。所述兩個單倍型在染色體區(qū)域上可相同或不同。
[0041] 如本公開中所使用的術語"閾值"或量意指用于對生物樣品在兩種或更多種分類 狀態(tài)間-例如與特定表型病狀或疾病或對表型病狀或疾病的易感性相關或關聯(lián)的基因序 列的存在或缺乏，做出判斷的數值或量。例如，如果參數大于閾值，則產生第一類的定量數 據，或者如果參數小于閾值，則產生不同類別的定量數據。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 實施方案可確定在有多個胎兒的妊娠期內確定母系和父系單倍型的遺傳?？捎筛?體為雜合子而母體為純合子的基因座確定父系遺傳。父系特異性等位基因的量（例如，那 些等位基因的百分比濃度）可用于確定有多少個胎兒已經遺傳了帶有父系特異性等位基 因的單倍型。對胎兒中父系遺傳性單倍型的了解可用于確定胎兒遺傳的母系單倍型。
[0044] 可在母體為雜合子并且父系遺傳性等位基因已知（例如，父體為純合子或確定了 父系遺傳性單倍型）的基因座處確定母系遺傳?？墒褂脙煞N類型的基因座。一種類型具有 在第一母系單倍型上出現(xiàn)的父系等位基因，而另一種類型具有在第二母系單倍型上出現(xiàn)的 父系等位基因。可測量每個基因座處不同等位基因的量。量的比較（例如，使用每個等位 基因的百分比濃度和閾值）可用于確定單倍型遺傳。并且，單倍型可與目標病狀相關聯(lián)，可 根據對哪些父系和/或母系單倍型遺傳的確定，確定目標病狀為遺傳或不遺傳。
[0045] I.接合性
[0046] 多胎妊娠指孕婦攜帶有一個以上胎兒的妊娠。雙胎妊娠是最常見的多胎妊娠形 式?？蓪㈦p胎妊娠表征為單卵（相同）和雙卵（不相同）。雖然討論主要集中在雙胎上，但 是各方面也適用于更多數量的胎兒。
[0047] 對母體血漿中存在的DNA片段的分析在雙胎妊娠中-尤其是如果雙胎為雙卵（不 相同）時更復雜。即使在母體血漿中鑒定特定單倍型或特定疾病相關多態(tài)性起源于胎兒， 分析員仍面臨另一個問題：如何確定是兩個胎兒均受到影響，還是僅有一個。
[0048] A?單卵性雙胎
[0049] 當孕婦攜帶一對單卵性雙胎時，對胎兒的遺傳分析可類似于用于分析單胎妊娠的 遺傳分析。但是，雙卵性雙胎的可能性使得分析更加困難。為了分析父系遺傳，可將母系基 因組中不存在的父系等位基因用作確定胎兒遺傳了哪個父系等位基因的標志。當已知父系 等位基因在父體的特定單倍型上時，可確定至少一個胎兒遺傳了特定單倍型（單卵性時兩 個胎兒均遺傳）。
[0050] 為了分析母系等位基因的遺傳，因為不管胎兒遺傳哪個母系等位基因，在母體血 漿中都可檢測到兩個母系等位基因，所以需要復雜的定量方法?？杀容^母體血漿中兩個母 系等位基因的相對量，并且預計胎兒遺傳的等位基因將以更高濃度存在。在另一項實驗中， 比較母體血漿中兩個母系等位基因的相對量。當血漿樣品中DNA的量有限時，這種相對單 倍型劑量方法可提供更精確的結果。在以引用的方式并入的美國專利第8, 467, 976號中可 找到關于相對單倍型劑量方法的詳情。
[0051] B?雙卵性雙胎
[0052] 如果一對雙胎為雙卵性，則兩個胎兒可能從每個親本遺傳相同或不同的等位基 因。在這種情況下，需要更復雜的遺傳分析來確定每個胎兒遺傳了哪個父系和母系等位基 因。這種信息對分析單基因病和其它病狀有用。
[0053] 實施方案描述了分析多胎妊娠中胎兒對親本單倍型的遺傳的技術。所述分析分為 父系遺傳分析及母系遺傳分析。
[0054] II.父系遺傳分析
[0055] 在已知關于父體的基因型和/或單倍型信息時，可進行確定胎兒遺傳哪個父系單 倍型。一些實施方案提供了通過鑒定和測量親本特異性單倍型確定親本遺傳的方法。
[0056] A?父系特異性單倍型的鑒定
[0057] 對父系遺傳的確定可通過分析母體為純合子而父體為雜合子的基因座進行。在這 種情況下，在任一個或兩個胎兒中可從父體遺傳胎兒特異性等位基因。
[0058] 圖1顯示了根據本發(fā)明的實施方案，母體為純合子而父體為雜合子的兩個基因座 的實例。這兩個基因座110、120相互靠近，以致在單次減數分裂期間這兩個基因座之間的 重組不太可能。在該實例中，在基因座110處，父系A等位基因與母系等位基因相同并且父 系B等位基因在母體中不存在，并且因此，為父系特異性。類似地，基因座120處的C等位 基因也為父系特異性。