AA CGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATA
[0030] -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔煙管菌高氏15號制成的菌劑。
[0031] 作為優(yōu)選，所述的菌劑為顆粒性菌劑或可濕性粉菌劑。應(yīng)用方式為，蔬菜育苗盤均 勻撒施和蔬菜育苗移栽過程中定點穴施。
[0032] -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔煙管菌高氏15號在蔬菜根部病害防治中 的應(yīng)用，所述蔬菜根部病害為：由鐮刀菌（Fusariumspp.)、齊整小核菌（Sclerotium rolfsiiSacc)、立枯絲核菌（RhizoctoniacerealisVanderHoeven)和青枯假單胞菌 (PseudomanassolanacearumSmith)所引起的蔬菜根部病害。
[0033] 作為優(yōu)選，所述蔬菜根部病害為：番茄根腐病、番茄立枯病、番茄青枯病、魔芋根腐 病、魔芋白絹病、青椒根腐病、青椒青枯病、青椒立枯病、西瓜根腐病、西瓜青枯病和西瓜立 枯病。
[0034] 本發(fā)明的有益效果：
[0035] 1、本發(fā)明提供的多孔煙管菌（Bjerkanderasp.)高氏15號制成的菌劑對鐮刀菌、 齊整小核菌、立枯絲核菌和青枯假單胞菌具有明顯的抑菌活性，該菌株制備的顆粒性菌劑 或可濕性粉可用于番茄根腐病、番茄立枯病、番茄青枯病、魔芋根腐病、魔芋白絹病、青椒根 腐病、青椒青枯病、青椒立枯病、西瓜根腐病、西瓜青枯病和西瓜立枯病的防治。
[0036] 2、本發(fā)明的菌劑使用簡便、污染小、成本低，具有廣泛的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景和良好的生 物開發(fā)價值。
[0037] 3、本發(fā)明所述菌株培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng) 用前景。
【具體實施方式】
[0038] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合本發(fā)明的實施例，進(jìn)一步來說明本發(fā)明的實質(zhì) 性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0039] 實施例1 :高氏15號菌株發(fā)酵液的制備
[0040] (1)培養(yǎng)基：
[0041] 高氏培養(yǎng)基：1 克KN03,0. 5 克K2HP04,0. 5 克MgS04 ? 7H20,0. 5 克NaCl，0. 01 克 FeS04 ? 7H20, 20 克瓊脂或 13g瓊脂粉，pH= 7. 4-7. 6,1000 毫升水。
[0042] (2)菌種培養(yǎng)：
[0043] 從保存的菌種表面刮取少量菌液在高氏培養(yǎng)基平板上劃線，30°C培養(yǎng)24小時，挑 取單菌落到2毫升高氏培養(yǎng)基中，200轉(zhuǎn)/分，30°C培養(yǎng)24小時，再按10%的比例接入培養(yǎng) 基裝填量為80毫升的250毫升的三角瓶中，200轉(zhuǎn)/分，30°C培養(yǎng)48小時。
[0044] (3)擴(kuò)大發(fā)酵：
[0045] 以0. 5%接種比例將菌種液接種于50升發(fā)酵罐中，在50升全自動發(fā)酵罐中投料 35升發(fā)酵培養(yǎng)料，發(fā)酵條件為：溫度30°C，120轉(zhuǎn)/分鐘，初始pH值7. 0,發(fā)酵3天。
[0046] 實施例2 :菌株鑒定與保藏
[0047] 2. 1形態(tài)特征
[0048] 形態(tài)學(xué)鑒定：將高氏15號菌株在高氏培養(yǎng)基平板上劃線，30°C培養(yǎng)48小時后觀察 形態(tài)。在高氏液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時后，觀察菌體形態(tài)、大小、是否產(chǎn)芽孢和鞭毛著 生方式。
[0049] 觀察結(jié)果：在高氏培養(yǎng)基上形成不透明乳白色放射狀菌落，表面稀薄，分布不均。 菌絲體稀薄，短小，宜斷裂。
[0050] 2. 2鑒定與保藏
[0051] 分子鑒定：由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司對高氏15號的DNA基因測序，測序 引物為：ITS1，獲得長度為266bp的基因片段。
[0052] 將該基因序列在NCBI網(wǎng)站（www.ncbi. .nlm.nih)上與已公布的基因序列進(jìn)行比 對結(jié)果顯不，該菌株與已知的多孔煙管菌（Bjerkanderaadusta)的同源性>97%。
[0053] AGCATTCCGGGAGGTCATTATCGAGTTTTGATGGGTTGTCTGCTGGCTCGCAAGGGCATGTGCACGCCT GTCTCATCCACTCTCAACTTCTGTGCACTTTTCATAGGCCGGCTTGTGGGTGCGTTCGCGCACTTGTAGGTGTCGGG CTTATGCTTTACTACAAACGATTCAGTTTTAGAATGTCATACTTTGCTATAACGCAATTATATACAACTTTCAGCAA CGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATA
[0054] 2. 3菌株生物學(xué)特征
[0055] 高氏培養(yǎng)基，PH值6. 5-7. 5之間，生長溫度25-40°C，35°C生長最快，4天菌落直徑 可達(dá)50-60暈米。
[0056] 實施例3:高氏15號可濕性粉菌劑的制備流程
[0057] 將發(fā)酵好的發(fā)酵體按照如下方法加工成可濕性粉劑：首先進(jìn)行菌體的古體發(fā)酵培 養(yǎng)（同擴(kuò)大發(fā)酵）。然后經(jīng)板框過濾、干燥、粉碎，制成可濕性粉劑。具體制作過程如下：
[0058] 板框過濾：用10公斤/平方厘米的壓力，將物料由儲罐壓入板框，通過3號紗布過 濾，壓力應(yīng)隨時調(diào)節(jié)，使菌體中的含量菌不超過0. 2億/毫升。
[0059] 干燥：在溫度60 °C以下的烘干房內(nèi)通風(fēng)干燥至含水量5-8%。
[0060] 粉碎：粉碎時出料溫度不能超過70°C，以防菌體失活。
[0061] 成品質(zhì)量指標(biāo)測定：含菌量、含水量、懸浮率、細(xì)度的測定均參照國家企業(yè)標(biāo)注 (Q/KWL02-2003)進(jìn)行，含菌量3. 6X109CFU/g，其余各項指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0062] 實施例4 :高氏15號顆粒菌劑的制備流程
[0063] 將發(fā)酵好的發(fā)酵體按照如下方法加工成顆粒菌劑：先將菌株發(fā)酵體與蔗糖按照 4 :1 (毫升/克）比例混合均勻，得混合物1 ;再把混合物1、聚乙苯吡咯烷酮K30、酒石酸和 碳酸氫鈉，按照12 :1 :1 :2重量比（W/W)混合，得混合物2 ;將混合物2在造粒機(jī)上過16目 篩造粒，再用60°C汽液烘干，實時測定水份含量，使水分控制在3-5%之間，烘4小時，得高 氏15號菌株活菌的顆粒劑，所述的活菌總濃度為5X10sCFU/g。
[0064] 實施例5 :高氏15號菌體對蔬菜根部病害如鐮刀菌、齊整小核菌、立枯絲核菌和青 枯假單胞菌的抑菌活性測定
[0065] (1)平皿拮抗篩選試驗
[0066] 指不菌：鏡刀菌（Fusariumspp.)、齊整小核菌（Sclerotiumrolfsii)和立枯絲 核菌（RhizoctoniacerealisVanderHoeven) 〇
[0067] 在PDA平板中心接種多孔煙管菌菌塊，在半徑2. 5厘米左右的圓周上，等距離接種 3點等量不同病原菌，將每三種不同的病原菌作為一組，共有三組，每組設(shè)三個重復(fù)。用記號 筆做好標(biāo)記菌株編號，以備觀察記錄。將接種好的培養(yǎng)皿放于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天 左右。
[0068] 隔日對所做的實驗進(jìn)行拍照，測量病原菌指向多孔煙管菌的半徑。記錄高氏15號 菌與病原菌之間的形態(tài)特征。病菌與多孔煙管菌交接后，觀察病原菌對高氏15號菌落的包 圍、抑制、侵入和占領(lǐng)其營養(yǎng)空間的過程。篩選多孔煙管菌，依據(jù)以下原則進(jìn)行：（1)生長速 度明顯高于病原菌的菌株，能夠與病原菌爭奪營養(yǎng)，從而顯著抑制病原菌的生長；(2)與病 原菌之間有〇.2cm左右空隙，即產(chǎn)生了抑菌帶，說明多孔煙管菌在代謝過程中產(chǎn)生了某種 抗生物質(zhì)。
[0069] 表1高氏15號菌株對3種病原菌抑制活性測定
[0070]
[0071] 備注：菌體對病原菌的生長抑制作用，由強(qiáng)到弱，分為+++、++、+、_四個等級（抑 菌效果通過抑菌帶大小表示：2mm< + < 4mm;4mm<++< 6mm;+++多6mm)。
[0072] (2)平皿抑菌試驗
[0073] 指不菌：青枯假單胞菌（PseudomanassolanacearumSmith) 〇
[0074] 青枯假單胞菌（PseudomanassolanacearumSmith)容易引起青枯病。將青枯假單 胞菌（PseudomanassolanacearumSmith)以1 :30比例加入到冷卻至45攝氏度左