一種土壤中腐殖酸的分級提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腐殖酸分離提取技術(shù)，具體涉及一種土壤中腐殖酸的分級提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腐殖酸(humic acid)是由動植物殘體經(jīng)過復(fù)雜的物理、化學(xué)、生物過程形成的大分子有機(jī)混合物，它廣泛存在于土壤、水體、沉積物等環(huán)境介質(zhì)中。腐殖酸能溶于堿性和中性溶液，不溶于酸，約占土壤有機(jī)質(zhì)總量的60?80%，是土壤有機(jī)質(zhì)最重要的組成部分。
[0003]腐殖酸可以促進(jìn)土壤團(tuán)粒體結(jié)構(gòu)的形成，改善土壤透水性。腐殖酸通過自身的酸性和對植物根系的刺激作用改善土壤PH環(huán)境，在一定程度上減輕土壤板結(jié)和鹽堿化。腐殖酸是土壤中重要的碳源，它還能增加土壤中的微生物數(shù)量和土壤酶活性，為作物生長提供碳源。腐殖酸能與銨鹽、磷酸鹽、鉀離子及土壤微量元素相互作用增加土壤的養(yǎng)分保蓄和營養(yǎng)鹽的可利用性。此外，腐殖酸能與環(huán)境中的有毒重金屬離子和有機(jī)污染物(如農(nóng)藥，PPCPs和PAHs)發(fā)生相互作用，形成化學(xué)和生物穩(wěn)定性的溶于水和不溶于水的物質(zhì)，從而改變其迀移、轉(zhuǎn)化規(guī)律和生物有效性?？傊?，土壤腐殖酸對土壤良好結(jié)構(gòu)的形成、土壤酸堿度的調(diào)節(jié)、水土保持以及土壤中有毒有害污染物的清除、植物元素營養(yǎng)平衡，乃至全球碳平衡起著至關(guān)重要的作用。
[0004]人口的增加，化肥和農(nóng)藥的普遍使用及化學(xué)工業(yè)發(fā)展造成的環(huán)境污染日趨加劇，隨之而來的是土地退化、土壤污染及糧食品質(zhì)下降。實施可持續(xù)有機(jī)農(nóng)業(yè)成為農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨向，因此，進(jìn)行土壤腐殖酸的研究對農(nóng)業(yè)和環(huán)境學(xué)的發(fā)展具有重要的意義。
[0005]現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，為土壤腐殖質(zhì)的研究提供了先進(jìn)的手段，使土壤腐殖質(zhì)的研究有了許多新的突破。人們對腐殖酸結(jié)構(gòu)特征的研究已有最初的元素含量等整體性質(zhì)的研究，逐漸發(fā)展到精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究。紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜、核磁共振等研究方法的普及和使用，使人們對腐殖酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)有了更多的了解。但是由于腐殖酸的組成和結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜，它的元素組成、分子量、芳香度及官能團(tuán)含量等隨著時空不同而發(fā)生變化，因此成功分離腐殖酸及其亞組分具有重要的環(huán)境學(xué)意義。
[0006]為了更近一步的研究腐殖酸的結(jié)構(gòu)和組成，前人將腐殖酸進(jìn)行分級分離，從而減小其異質(zhì)性，取得一些列成果。土壤腐殖酸的分級分離方法分為兩類，一類是連續(xù)提取類方法，即連續(xù)向土壤中加入腐殖酸提取劑，實現(xiàn)腐殖酸的分級分離；一類是連續(xù)洗脫類方法，即將提取出的腐殖酸吸附到樹脂柱上，用不同淋洗液進(jìn)行淋洗，實現(xiàn)腐殖酸的分級分離。焦磷酸鈉-氫氧化鈉聯(lián)用是一種典型的腐殖酸連續(xù)提取類放法，該方法依次使用焦磷酸鈉和氫氧化鈉在土壤中直接提取腐殖酸。如Kang等用同濃度的焦磷酸鈉和氫氧化鈉溶液從土壤中提取腐殖酸；施國蘭等采用不同濃度的焦磷酸鈉和氫氧化鈉溶液從土壤中連續(xù)提取腐殖酸。焦磷酸鈉和氫氧化鈉聯(lián)用法涉及利用不同溶液，從土壤中反復(fù)加入提取液，需處理液體體積巨大，中和及腐殖酸沉淀過程中使用大量鹽酸等，具有明顯的缺陷和局限性。Yonebayashi和Hattori使用連續(xù)洗脫類方法法進(jìn)行腐殖酸的分離，該方法首先將腐殖酸吸附在XAD-8樹脂上，利用有機(jī)混合緩沖劑(檸檬酸、磷酸鉀、四硼酸鈉、三異丙基乙磺酰、氯化鉀)、水和甲醇連續(xù)洗脫獲得腐殖酸樣品。該方法在從XAD-8樹脂上洗滌吸附腐殖酸時，涉及檸檬酸和三異丙基乙磺酰等有機(jī)溶劑，可能造成腐殖酸結(jié)構(gòu)的改變，并且難以定量估算有機(jī)溶劑在腐殖酸樣品中的殘留量，存在巨大缺陷。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種土壤中腐殖酸的分級提取方法，該方法能夠克服現(xiàn)有技術(shù)對腐殖酸分級提取過程的不足，獲得腐殖酸各級亞組分。
[0009]連續(xù)提取類方法涉及多次向土壤中加入提取液，需處理液體體積巨大，操作步驟繁雜，費(fèi)時費(fèi)力，提取液過程使用大量酸堿，產(chǎn)生藥品浪費(fèi)。本發(fā)明在對土壤進(jìn)行酸洗的基礎(chǔ)上，采用二次提取法既保證了土壤腐殖酸的全面提取，又避免了藥品的浪費(fèi)，且操作相對簡單，費(fèi)用大為降低。連續(xù)洗脫類方法涉及使用有機(jī)溶劑洗脫腐殖酸亞組分，有機(jī)溶劑可能造成腐殖酸結(jié)構(gòu)的改變，并且難以定量估算有機(jī)溶劑在腐殖酸樣品中的殘留量。本發(fā)明在腐殖酸提取及分級過程中不涉及有機(jī)溶劑，在提取完成后，可以通過測定腐殖酸亞組分中各個元素含量，對可能的無機(jī)殘留進(jìn)行定量，保障了腐殖酸亞組分的純凈。
[0010]本發(fā)明公開的技術(shù)方案如下:一種土壤中腐殖酸的分級提取方法，所述分級提取方法包括如下步驟:
步驟a、土壤預(yù)處理:
稱取天然土壤，剔除樹根和石子等雜物，風(fēng)干碾磨，得到土壤樣品；
步驟b、土壤酸洗:
向土壤樣品中加入去離子水，使固液比達(dá)到(1-3): (5-8)，用堿和酸調(diào)節(jié)其PH= 1.0-3.0，得到固液混合物，向該固液混合物中加入酸，使其固液比為1:10，連續(xù)攪拌4-8h，靜置20-28 h后，離心后棄去上清液，得到酸洗土壤樣品；
步驟c、提取土壤中腐殖酸:
向酸洗土壤樣品中加入去離子水，使其固液比為(1-3): (10-12)，用酸和堿調(diào)節(jié)溶液pH=7，得到固液混合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向該固液混合物中加入焦磷酸鈉溶液，并用去離子水稀釋，使焦磷酸鈉濃度為0.1-0.2 11101/1且固液比為1:10，持續(xù)攪拌4 _8h，靜置20-28h后，離心得到上清液I和土壤樣品I ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上清液I中加入酸，使其pH =1.0-3.0，攪拌15-30 min，靜置24-28h后，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸I ;
向步驟b中的土壤樣品I中加入去離子水，使其固液比為(1-3):(5-8)，用酸和堿調(diào)節(jié)其pH=7，得到固液混合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向該固液混合物中加入氫氧化鈉溶液，并用去離子水稀釋，使氫氧化鈉濃度為0.1 -0.3 11101/1且固液比為1:10，攪拌4-8 h，靜置20-28h后，離心得到上清液2和土壤殘渣；
氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上清液2中加入鹽酸，使其pH =1.0-3.0，攪拌15-30 min，靜置20-28 h后，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸2 ;
步驟d、腐殖酸除硅:
將腐殖酸I和腐殖酸2合并，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用含有0.1 -0.3mol/L氫氧化鈉和0.2-0.4 mol/L氯化鈉的溶液溶解，高速離心分離，得到上層清液；將該上層清液用鹽酸酸化至pH=l.0-3.0，攬摔15_30min，靜置20-28 h，尚心得固體，標(biāo)記為腐殖酸3 ；
向腐殖酸3中加入含有0.1 -0.3mol/L鹽酸和0.2-0.4 mol/L氫氟酸的溶液，使固液比為1:10，持續(xù)攪拌20-28 h，離心分離得固體標(biāo)記為無硅腐殖酸；
步驟e、土壤腐殖酸除雜酸:
向無硅腐殖酸中加入鹽酸溶液，使其固液比為(1-3): (10-12)，持續(xù)攪拌4-8h，并靜置20-28 h后，離心得到上層清液及純化腐殖酸；
步驟f、土壤腐殖酸的亞組分分級:
在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用氫氧化鈉將步驟e中的純化腐殖酸溶解，加入去離子水使溶液中腐殖酸濃度在1-3 g/L，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH =1-3后，以10倍柱體積/h的速度流過XAD-8樹脂柱，流出液棄去；
以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =3的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=3的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH3 ;
以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =4的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=4的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH4 ;
以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =5的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=5的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH5 ;
以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =6的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=6的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH6 ;
以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =7的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=7的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH7 ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =8的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=8的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH8 ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =9的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=9的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH9 ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =10的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=10的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PHlO ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =11的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=ll的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PHll ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =12的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=12的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH12 ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5-10倍柱體積/h的速度，用pH =13的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長紫外/可見光進(jìn)行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止pH=13的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH13 ;
步驟g、土壤腐殖酸除鹽及固化:
在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，用0.1-0.3 mol/L的氫氧化鈉分別溶解腐殖酸pH3_腐殖酸pH13，使每份溶液固液體積比均為1:2，用濃鹽酸分別調(diào)節(jié)溶液？!1=4-9，共計得到11份腐殖酸亞組分溶液；
將11份腐殖酸亞組分溶液分別置入11個截留分子量為10000道爾頓透析袋中，并將每個透析袋置于超純水中，組成透析體系，攪拌20—40 h后，將每個透析袋中的腐殖酸亞組分溶液冷凍干燥得到11份腐殖酸亞組分，命名為腐殖酸亞組分pH3- pH13o
[0011]優(yōu)選的，所述分級提取方法中，所述步驟e中所得上層清液用溶解有機(jī)碳測定儀器測定其溶解有機(jī)碳含量，如果上清液中溶解有機(jī)碳T0C> 5mg/L，則重復(fù)步驟e，直到T0C<5 mg/L后，再進(jìn)行步驟f。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟g中透析體系攪拌20— 40 h后，用鉬酸銨分光光度法和硝酸銀法分別測定步驟g中透析袋外溶液的磷含量和氯離子含量，如果總磷含量>0.01 mg/L或者有氯化銀存在，則多次更換透析體系中的超純水，每次加入去離子水，攪拌20— 40 h后，再次測定，直到磷含量〈0.0l mg/L且檢測不到氯離子。
[0013]優(yōu)選的，所述分級提取方法還包括步驟h:在80-100°C下烘干20_40h后，在550°C下灼燒5-10h，測定步驟g所得的11份腐殖酸亞組分pH3- pH13的灰分；
如果其中某份腐殖酸亞組分以干重計灰分大于1.0%，則將該腐殖酸亞組分在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，在容器中，用氫氧化鈉溶解，加入去離子水使溶液腐殖酸濃度=1 一3 g/L后，調(diào)節(jié)pH=3-9，再加入濃鹽酸、濃氫氟酸和去離子水，使固液比為1:10且鹽酸濃度為0.lmol/L，氫氟酸濃度為0.3mol/L，持續(xù)攪拌20-28 h，離心分離得固體后重復(fù)操作步驟g。
[0014]更進(jìn)一步詳細(xì)的，本發(fā)明公開的土壤中腐殖酸的分級提取方法，所述分級提取方法包括如下步驟:
步驟a、土壤預(yù)處理:稱取天然土壤，剔除樹根和石子等雜物，風(fēng)干碾磨后過2.0 mm的篩，得到土壤樣品；
步驟b、土壤酸洗:向土壤樣品中加入去離子水，使固液比達(dá)到1:5，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)其PH=L 0，得到固液混合物，向該固液混合物中加0.lmol/L的鹽酸溶液，使其固液比為1:10，連續(xù)攪拌4 h，靜置24 h后，離心后棄去上清液，得到酸洗土壤樣品；
步驟C、提取土壤中腐殖酸:向酸洗土壤樣品中加入去離子水，使其固液比為1:3，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH=7，得到固液混合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向該固液混合物中加入焦磷酸鈉溶液，并用去離子水稀釋，使焦磷酸鈉濃度為0.lmol/L且固液比為1:10，持續(xù)攪拌4h，靜置24 h后，離心得到上清液I和土壤樣品I ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上清液I中加入6mol/L鹽酸，使其pH =1.0，攪拌30 min，靜置24后，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸I ;
向步驟b中的土壤樣品I中加入去離子水，使其固液比為1:3，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH=7，得到固液混合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向該固液混合物中加入氫氧化鈉溶液，并用去離子水稀釋，使氫氧化鈉濃度為0.1 mol/L